β2-Adrenozeptor-Stereoisomere: Neue pharmakologische und ... · COPD (β 2AR-Agonisten) ... lp h a...

Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011

β2-Adrenozeptor-Stereoisomere: Neue pharmakologische und klinische

Erkenntnisse zu alten Arzneistoffen

Fortbildung für Apotheker

13.07.2011

Regensburg

Roland Seifert

Institut für Pharmakologie13. 07.2011


Themen

• β2AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion

• Interaktion des β2AR mit Stereoisomeren

• Klinische Implikationen


β2-Adrenorezeptor

• G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR)

• Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen (7TMR)

• Katecholamine als endogene Liganden

• Potenz: Adrenalin (Hormon) > Noradrenalin (Neurotransmitter) > Dopamin (Neurotransmitter)

• Neben Rhodopsin bestuntersuchter GPCR

• Kopplung an Gs-Proteine (kanonisch)

• Kopplung an Gi-Proteine, Gq-Proteine und β-Arrestin (nicht-kanonisch)


Kanonische und nicht-kanonische Signaltransduktion über den β2AR

A2

G16 Gi Gs β-Arrestin

AC ERKPLC

A1 A3

β2AR


Expression, Funktion und pharmakologische Bedeutung des β2AR

Expression Funktion Pharmakologische Bedeutung

Glatte Gefäßmuskulatur Vasodilatation Schutz vor exzessiver Kontraktion (α1AR) bei LA mit Adrenalin

Glatte Muskulatur, Uterus

Relaxation Tokolyse bei vorzeitigen Wehen (β2AR-Agonisten)

Leber Glykogenolyse Verhinderung von Hypoglykämie (endogenes Adrenalin)

Glatte Muskulatur, Bronchien

Bronchodilatation Asthma bronchiale, COPD (β2AR-Agonisten)

Mastzellen, eosinophile und neutrophile Granulozyten

Hemmung der Mediatorfreisetzung

Asthma bronchiale, COPD (β2AR-Agonisten)


AC

cAMPATP

4

1

66

Gsα

GDP

Pi

5

2

Gsαγ β β2AR

2

Agonist

β2ARAgonist

Gsα

GDP

γ β

1

GDP

G-Proteinzyklus

Gsα

GTP

Gsα

GTPγ β

γ β

3GTP

β2AR

Agonist


Methoden zur Analyse derGPCR/G-Protein-Kopplung

• GTP(γS)-sensitive hochaffine Agonistbindung Proximal

• Steady-state-Hydrolyse von [γ-32P]GTP

• [35S]GTPγS-Bindung

• Effektorsystemaktivierung

• Kinaseaktivierung

• Genexpression Distal


GPCR-Gα-Fusionsproteine

• Definierte 1 : 1-Stöchiometrie der Signalpartner

• Enge Nachbarschaft der Signalpartner (Transduzisom)

• Vergleich der Kopplung von GPCR-Isoformen an ein Gα

• Vergleich der Kopplung eines GPCRs an verschiedene Gα

• Exakte Potenzen (EC50) und Maximaleffekte (Emax) von Liganden


R R* G E

inverserAgonist

neutralerAntagonist Agonist

Zweizustandsmodell der GPCR-Aktivierung (Two-state model)

-10 -9 -8 -7 -6 -5

0

50

100 voller Agonist

partieller Agonist

neutraler Antagonist

partieller inverser Agonist

voller inverser Agonist

G-P

rote

in- u

nd E

ffekt

orsy

stem

-

Aktiv

ität (

rela

tive

Einh

eite

n)

Ligand (log M)


Aktivierung des β2-Adrenozeptors durch Rotation von TM5 und TM6

Rasmussen et al., Nature 2011;469:175Rosenbaum et al., Nature 2011;469:236

+ reversibler inverser Agonist (R)

+ reversibler Agonist + Nanobody(G-Protein-Substitut)

+ irreversibler Agonist (R*)


Ligand-spezifische G-Protein-Aktivierung

Wenzel-Seifert & Seifert, Mol Pharmacol 2000;58:954

Ligand β2AR-GsαS β2AR-Giα2 β2AR-G16α

(R)-ISO 1.00 1.00 1.00

rac-SAL 0.81 0.64 0.64

rac-DOB 0.68 0.40 0.35

rac-EPH 0.33 0.35 0.26

rac-DCI 0.19 0.29 0.08

Emax-Werte


Mutiple aktive Zustände (Multiple-state model)

R*1

Agonist 1

R*2 R*3

Agonist 2 Agonist 3 Agonist n

R*n

G1 G2 G3 Gn

E1 E2 E3 En

Ligand-spezifische Rezeptorkonformationen


ligand-directed trafficking of receptor signalling

functional selectivity

biased agonism

ligand-biased efficacy

collateral efficacy

pluridimensional efficacydifferential engagement

conformational selectivity

Ligand-specific receptor conformation


Herausforderung Funktionale Selektivität

• Neue pharmakologische Möglichkeiten– Reduktion von unerwünschten Wirkungen

– Zelltyp/Organ-spezifische Wirkungen

• Neue Strategien für High-Throughput-Lösungen in der Arzneistoffentwicklung nötig

– kein universeller HTS-Assay

– Berücksichtigung multipler Signalwege/Effektoren

– rekombinante und native Systeme

– dennoch ökonomisch


Themen





Isoproterenol-Stereoisomere

• keine Selektivität für β2AR im Vergleich zum β1AR

• aber bis vor kurzem einziges erhältliches Stereoisomerenpaar

• für die meisten Liganden nur Razemate verfügbar

• Manchmal reines (R)-, aber kein (S)-Stereoisomer verfügbar

* *


β2ARLAKHEKLCF

272

269

267266

A

K

RS

Konstitutiv aktivierte Mutante des β2AR (β2ARCAM)


R R* G

β2ARinverserAgonist Agonist

R R* G

inverserAgonist Agonist

β2ARCAM

β2AR versus β2ARCAM

• Erhöhte basale G-Proteinaktivierung

• Erhöhte Potenz/Affinität von Agonisten

• Erhöhte Effektivität von inversen Agonisten und partiellen Agonisten


-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

0

50

100

(-)-R(+)-S

β2AR-Gsα

A

GTP

ase

activ

ity (%

of m

axim

um)

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

β2ARCAM-Gsα

B

Isoproterenol stereoisomer (log M)

Unterschiedlich potente GTPase-Aktivierungdurch ISO-Stereoisomere an β2AR und β2ARCAM

Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218

Isoproterenol-Stereoisomere an β2AR und β2ARCAMParameter (-)-(R)-Isoproterenol (+)-(S)-Isoproterenol

Chemische Bezeichnung

Eutomer Distomer

Affinität (Bindung) Hoch Niedrig

Potenz (funktioneller Assay)

Hoch Niedrig

Maximale Wirkstärke (Emax)

~1,0 (voller Agonismus) ~1,0 (voller Agonismus)

Aktiver Zustand R* R*


0

25

50

75

100

controlGTPγS

β2AR-Gsα

A B

β2AR-Gsα

-11 -9 -7 -5 -3

0

25

50

75

100

β2ARCAM-Gsα

C

(-)-R-ISO (log M)-10 -8 -6 -4 -2

β2ARCAM-Gsα

D

(+)-S-ISO

[3 H]D

HA

boun

d (%

of b

asal

)

Differentielle ternäre Komplex-Bildungmit ISO-Stereoisomeren an β2AR und β2ARCAM

Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218


Funktionell inaktive ternäre Komplexe mit R-ISO an β2ARCAM

Parameter (-)-R-ISO (+)-S-ISOKh (nM) 0.2 3.8Kl (nM) 3.8 75Rh (%) 35 56KhGTPγS (nM) 2.0 -KlGTPγS (nM) 13 135RhGTPγS (%) 66 0

Seifert et al., J Pharmacol

Exp Ther 2001; 297:1218

(-)-R-ISO

R*CAM-(-)-R-ISO

Gsα

(-)-S-ISO

R*CAM-(-)-S-ISO

Gsα


OH

NH

OH

OH

OH

**

OH

NH*

OH

OH

OH

NHNH

O

**

OH

O

OH

NH*

OH

OH

O

OH

NHNH

O

*

OH

OO

β2AR-Agonist-Stereoisomere: Endlich verfügbar!

SABA = Short Acting Beta2 Agonist– Fenoterol (RR, RS, SR, SS)

Salbutamol (R, S)

LABA = Long Acting Beta2 Agonist– Formoterol (RR, RS, SR, SS)

– Salmeterol (R, S)

– Olodaterol (R, S)


Die vier Fenoterol-Stereoisomere

DiastereomereEnantiomere Enantiomere

Jozwiak et al., J Med Chem 2007;50:2903


Fenoterol-Stereoisomer-spezifische Signaltransduktion in Kardiomyozyten

Woo et al., Mol Pharmacol 2009;75:158Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13


Distinkte Interaktion von Fenoterol-Stereoisomeren mit dem β2AR: Größere Flexibilität von (S,R)-Fenoterol

(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol

Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13


Differentielle Stabilisierung des ternären Komplexes durch Fenoterol-Stereoisomere an β2AR-Gsα

(R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol

(S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol


Differentielle GTPase- und AC-Aktivierung durch Fenoterol-Stereoisomere an β2AR-Gsα

-10 -8 -6 -4 -2

0

50

100

log (cfenoterol / (mol/L))

GTP

ase

activ

atio

n /

% o

f (R

)–IS

O

-10 -8 -6 -4 -2

0

50

100


AC

activ

atio

n /

% o

f (R

)–IS

O(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol

(R,S)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol


Humane neutrophile Granulozyten als β2AR-Modell

PLC

NOX

IP3DAG

PTX

ROS

PKC

FPR

Ca2+

Ca2+

ER

β2AR

Giα β γ

Gsαβ γ

cAMP

AC 9

ERK

P

β2AR

Giα β γ

PIP2


HL-60-Promyelozyten als Modell für den β2AR

PLC

IP3DAG

PTX

PKCCa2+

Ca2+

ER

β2AR

Gsα β γ

cAMP

AC 9

ERK

Pβ2AR

βγ

G16α

β2AR

Giα β γ

PIP2


S49 Lymphomzellen als Modell für den β2AR

PTXSSTR

β2AR

Giα β γ

Gsαβ γ

cAMP

AC 5/6

ERK

P

β2AR

Giα β γ


S49 cyc- Zellen als Modell für den β2AR

PTXSSTR

β2AR

Giα β γ

Gsαβ γ

cAMP

AC 5/6

ERK

P

β2AR

Giα β γ


Multiplexanalyse von β2AR-Stereoisomeren

Binding

[Ca2

+ ] i

O 2.-

ACGTPase

cAMP

ERK

PTXInter

nalisie

rung

Giα + + + + +

Gsα + + + + +

G16α +

β-Arrestin + + +

Sf9 + + +

HL-60 + + + + + +

HEKβ2AR (+) + + + +

S49 + + +

Neutrophile + + + + +

Kop

pelu

ngsp

artn

erZe

llsys

tem

e

Membran Intakte Zellen


Differentielle cAMP-Akkumulation durch Fenoterol-Stereoisomere in humanen neurophilen Granulozyten und HL-60-Promyelozyten

-10 -8 -6 -4 -2

0

50

100

human neutrophils


c cA

MP

/ % o

f (R

)-ISO

-12 -10 -8 -6 -4 -2

0

50

100

HL-60 promyelocytes

log (cfenoterol /(mol/L))

c cA

MP

/ %

of (

R)-I

SO(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol



Differentielle Stimulation der cAMP-Akkumulation und Hemmung der O2

- Produktion durch Fenoterol-Stereoisomere in neutrophilen Granulozyten

-10 -8 -6 -4 -2

0

50

100


c cA

MP

/ % o

f (R

)-ISO

-12 -10 -8 -6 -4 -2

0

50

100

log(cfenoterol /(mol/L))

Inhi

bitio

n of

RO

S pr

oduc

tion

/ % o

f (R

)-ISO

1 μM fMet-Leu-Phe

(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol


Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome ProfilerTM Human Phospho-MAPK Array Kit

Kontrolle ATP (R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol


p38alp

ha

CREB

ERK1

ERK2

Akt2GSK-3b

etaGSK3a

lpha/beta

RSK1

JNKpan

MKK3

MKK6

MSK2

0

50

100

KontrolleATP 10 µMRR-FEN 1 µMSR-FEN 1 µM

Nor

mal

isie

rte

auf h

öchs

tes

Sign

al

Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome ProfilerTM Human Phospho-MAPK Array Kit


Web of Potencies and Efficacies von Fenoterol-Stereoisomeren am β2AR: Evidenz für Ligand-spezifische

Rezeptorkonformationen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9pKi,low

pEC50,AC

pEC50,GTPasepEC50,cAMP

IC50,ROS

RR RS SR SS

0

20

40

60

80

100

120Ratio high affinity agonist binding

Emax AC

Emax GTPaseEmax cAMP

Emax ROS

RR RS SR SS

Web of Potencies Web of Efficacies

Weitere Hinweise für Stereoisomer-spezifische Rezeptorkonformationen

Rezeptor Ligand-Stereoisomere

Effekt

β2AR Noradrenalin Schnelle Konformationsveränderung (kein G-Protein)

α1AR Adrenalin Kontraktion von Blutgefäßen (Gq)

α2AAR Medetomidin [Ca2+]i-Anstieg (Gi)

H1R Chiraprodifene GTPase-Aktivierung (Gq)


Strukturelle Evidenz für Ligand-spezifische β1AR-Konformationen

Warne et al., Nature 2011;469:241

partielle Agonisten volle Agonisten

Bisher nur R-Stereoisomere analysiert


Zukünftige Untersuchungen

• Komplettierung der Multiplexanalyse mit allen β2AR-Stereoisomerpaaren

• β2AR-Giα2-Kopplung

• β2AR-β-Arrestin-Kopplung• Molecular Modelling mit 7TMR-active-state-Modellen

• Zielgerichtete Mutagenese zur Identifikation von „Stereoisomer-Switches“

• Vergleich β2AR und H2R (Rezeptor-spezifische G-Protein-und Effektoraktivierung)


Themen





Vergleich (R)-Salbutamol versus (S)-Salbutamol beim Asthma bronchiale

Parameter (R)-Salbutamol (S)-Salbutamol

Klassifikation Eutomer Distomer

β2AR-Affinität hoch niedrig

Paradoxe proinflammatorische Effekte in vitro

nein Ja

Paradoxe proinflammatorische Effekte in vivo

nein ?


Paradoxe Wirkungen von β2AR-Stereoisomeren

Ligand System Effekt

(R)-Salbutamol Glatte Muskelzellen der Atemwege

Dilatation

(S)-Salbutamol Glatte Muskelzellen der Atemwege

Kontraktion

(S)-Salbutamol Mastzellen, T-Zellen, Granulozyten

Histamin, IL-13, ROS↑

(R,R)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung↓

(S,S)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung↑


(R,S)- versus (R)-Salbutamol beim Asthma bronchiale

Parameter (R,S)-Salbutamol (R)-Salbutamol

Internationaler Freiname

Salbutamol, Albuterol Levosalbutamol, Levalbuterol

Handelname Salbubronch, Salbulair, SalbuHEXAL, ….

Xopenex® (USA)

Klinische Wirksamkeit

vorhanden vorhanden, Überlegenheit bislang nicht nachgewiesen

Relative Kosten 100 500


β2AR-Rezeptorpolymorphismen16

27164


Wichtigste Eigenschaften von β2AR-Polymorphismen

Parameter Arg16Gly Gln27Glu Thr164Ile

Agonistbindung unverändert unverändert erniedrigte Affinität

G-Protein- und Effektorkopplung unverändert unverändert vermindert

Desensitisierung verstärkt vermindert vermindert

Assoziation mit Erkrankungen

Asthma bronchiale

Asthma bronchiale, vorzeitige Wehen, kardiovaskuläre Erkrankungen

Kardiovaskuläre Erkrankungen

β2AR-Polymorphismen funktionell nur unvollständig charakterisiert


Einfluss von β2AR-Polymorphismen auf die klinische Wirksamkeit von β2AR-Agonisten

Israel et al., Am J Respir Crit Care Med 2000;162:5


Rolle von neutrophilen Granulozyten beim Asthma bronchiale

Bakterien

Formylpeptide

Neutrophile Granulozyten

Hypersekretion Remodelling

Atemwegskonstriktion

Infektion

β2AR

β2ARMakrophagen Neutrophile

Epithelialzellen Eosinophile

Lymphozyten

Zellen in BAL-Flüssigkeit von Asthmatikern


Hemmung der O2- Produktion in humanen neutrophilen

Granulozyten über den β2AR: Keine paradoxen Effekte von „Distomeren“

-12 -10 -8 -6 -40.0

0.1

0.2

0.3IsoproterenolRR-FenoterolSS-FenoterolR-SalbutamolS-Salbutamol

Ligand (log M)

Δ A

550

nm

8 ml venöses Vollblut, 96 Proben, Mutiplate-reader

1 μM fMet-Leu-Phe


Interindividuelle Variabilität der IC50-Werte für Fenoterol-Stereoisomere an neutrophilen Granulozyten

(O2- Produktion) gesunder Spender

RR-FENRS-FENSR-FENSS-FEN

R-ISO

-10

-8

-6

-4lo

g(IC

50/M

)


Zukünftige Untersuchungen

• Korrelation zwischen β2AR-Pharmakologie in neutrophilen Granuloyten und β2AR-Genotyp in gesunden Spendern

• Korrelation zwischen β2AR-Pharmakologie und β2AR-Genotyp in neutrophilen Granulozyten von Asthmatikern

• Analyse der Wirkungen von LABAs an gesunden Spendern und Asthmatikern


Implikationen für zukünftige klinische Studien mit β2AR-Agonisten bei Asthma

bronchiale und COPD

• β2AR-Genotypisierung der Probanden• Funktionelle β2AR-Charakterisierung in Immunzellen • Vergleich Razemat, „Eutomere“ und „Distomere“• Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener SABAs• Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener LABAs


Take-Home Messages

• Funktionelle Selektivität in rekombinanten Systemen und nativen Zellen

• GPCR-Stereoisomere als Werkzeuge zur Exploration funktioneller Selektivität

• Analyse der Wirkungen von β2AR-Stereoisomeren beim Asthma bronchiale als Strategie zur Therapieoptimierung


Kooperationspartner• Brian Kobilka, Ulrik Gether (Stanford University)• Katharina Wenzel-Seifert (Stanford University; University of Kansas)• Michael Kabesch (Pädiatrie, MHH)• Irena Brunskole, Armin Buschauer, Stefan Dove (Medizinische Chemie,

Universität Regensburg)• Peter Gmeiner (Medizinische Chemie, Erlangen)• Irving Wainer (NIH, Bethesda)

Institut für Pharmakologie, MHH• Michael Reinartz • Solveig Kälble• Heike Burhenne, Volkhard Kaever

DFG, AHA, NIH, US Army Research Office

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