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Proteine

•  Biopolimeri degli α-amino acidi. •  Amino acidi sono uniti attraverso il legame peptidico. •  Alcune funzioni:

� Struttura (collagene, cheratina ecc.) �  Enzimi (maltasi, deidrogenasi ecc) � Trasporto (albumine, emoglobina ecc.) �  Protezione (tossine, allergeni ecc.) � Ormoni (insulina, ormoni della crescita ecc.)

Struttura delle Proteine

α Amminoacidi

�  -NH2 sul carbonio adiacente al -COOH.

� Glicina, NH2-CH2-COOH, è il più semplice.

�  Con -R come catena laterale, essi sono chirali.

�  La maggior parte degli amminoacidi naturali sono L-amminoacidi.

COOH

C HH2N

R

α

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Stereochimica degli α-Amminoacidi

Amminoacidi costituenti le proteine

•  Ventidue α-amminoacidi standard. •  Differiscono nella natura della catena laterale:

�  -H o alchile

�  contiene un –OH

�  Contiene lo zolfo

�  Contiene un azoto non basico.

� Un gruppo –COOH addizionale

� Un azoto basico

Amminoacidi Essenziali

•  Treonina (Thr) •  Lisina (Lys) •  Valina (Val) •  Fenilalanina (Phe)

•  Triptofano (Trp) •  Metionina (Met) •  Leucina (Leu) •  Isoleucina (Ile)

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Proteine Complete

�  forniscono tutti gli amminoacidi essenziali.

�  esempi: quelle nella carne, pesce, latte, uova.

�  Le proteine nei vegetali sono generalmente incomplete.

�  I vegetariani devono mangiare molti tipi differenti di vegetali, oppure supplire la dieta ad esempio con uova o latte.

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Aminoacidi Rari

�  4-idrossiprolina, 5-idrossilisina presente nel collagene.

� Acido D-Glutammico nelle pareti cellulari dei batteri.

�  D-Serina nei lombrichi.

� Acido γ-amminobutirrico, è un neurotrasmettitore.

�  β-Alanina, costituente della vitamina acido pantotenico.

Zwitterione

� Gli Amminoacidi esistono come ioni dipolari.

�  -COOH perde H+,mentre -NH2 acquista H+.

•  La struttura effettiva dipende dal pH

Proprietà degli Amminoacidi

�  Punti di fusione alti, oltre i 200°C �  Più solubili in acqua che in solventi non polari. � Un momento di dipolo più grande di quello di acidi o

ammine semplici. �  Più acidi della maggior parte degli acidi carbossilici e

meno basici di molte ammine.

H3N CH

R

C

O

O+ _

pKa = 10 pKb = 12

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Struttura e pH

Punto isoelettrico

�  pH a cui gli amminoacidi esistono come zwitterione (neutro).

� Dipende dalla struttura della catena laterale.

� Amminoacidi acidi, pI ~ 3.

� Amminoacidi basici, pI ~ 9.

� Amminoacidi neutri, pI ~ 5-6.

Elettroforesi

Proteine cariche positivamente si muovono verso il catodo

Proteine cariche negativamente si muovono verso l�anodo

Posizione della miscela originale

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O

N+

CH3

OH

H

H

H

O

N+

CH3

O-

H

H

H

O

N

CH3

O-

H

H

pKa=2.35 pKa=9.87

pI = 6.11

alanina

N+

O

NH

NH2

N+

O

H

H

H

H

H

H

N+

O

NH

NH2

N+

O-

H

H

H

H

H

N+

O

NH

NH2

N

O-

H

H

H

H

N

O

NH

NH2

N

O-

H

H

HpKa=2.01 pKa=9.04 pKa=12.48

pI = 10.76

arginina

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lisina

pKa=2.18 pKa=8.95 pKa=10.53

pI = 9.74

O

N+

O-

H

H

H

N+

H

H

H

O

N

O-

H

H

N+

H

H

H

O

N

O-

H

H

NH

H

O

N+

O

H

H

H

H

N+

H

H

H

O

N+

N N+

OH

HH

H

H

H

O

N+

N N+

O-

HH

H

H

H

O

N+

N N

O-

H

H

H

H

O

N

N N

O-

H

H

HpKa=1.77 pKa=6.10 pKa=9.18

pI = 7.64

istidina

O-

O

N+

O

O

H

H

H

H

O-

O-

N+

O

O

H

H

H

O

O

N+

O

O

H

H

H

H

H

O-

O-

N

O

O H

H

pKa=2.10 pKa=3.86 pKa=9.82

pI = 2.98

Acido aspartico

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O

N+

SH

OH

H

H

H

O

N+

SH

O-

H

H

H

O

N+

S-

O-

H

H

H

O

N

S-

O-

H

HpKa=2.05 pKa=8.00 pKa=10.25

pI = 5.02

cisteina

O

N+

OH

OH

H

H

H

O

N+

OH

O-

H

H

H

O

N

OH

O-

H

H

O

N

O-

O-

H

H

pKa=2.20 pKa=9.11 pKa=10.07

pI = 5.63

Tirosina

Equazione di Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + logbase coniugata[ ]acido debole[ ]

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Alcune Sintesi di laboratorio degli amminoacidi

�  Amminazione riduttiva

�  Sintesi da a aloacidi

�  Sintesi di Gabriel-estere malonico

�  sintesi di Strecker

Amminazionone Riduttiva

� Questo metodo di sintesi è biomimetico, cioè mima il processo biologico di sintesi.

� Si fa reagire un α-chetoacido con ammoniaca, poi si riduce l�imina con H2/Pd.

� Nel processo di laboratorio si ottiene una miscela racemica!

R C

O

COOHNH3 R C

N

COO

H _NH4

+ H2Pd

R C

NH2COO

H

_

Sintesi da α-aloacidi

�  La reazione di Hell-Volhard-Zelinsky permette di sintetizzare gli α-bromoacidi.

�  Il bromo può essere sostituito con un gruppo ammino facendo reagire l�α-bromoacido con un eccesso di ammoniaca.

� Si ottiene una miscela racemica.

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Sintesi di Gabriel-Estere Malonico

�  L�ammino gruppo viene protetto come ammide.

�  Il gruppo carbossilico viene protetto come estere.

�  La posizione α è attivata ulteriormente dalla presenza del gruppo estereo temporaneo

Sintesi di Strecker

�  La prima sintesi nota di un amminoacido risale al 1850. �  La reazione di un�aldeide con NH3 dà un�imina. �  Lo ione cianuro attacca l�immina protonata. �  Il risultato è un α-ammino nitrile che viene idrolizzato

ad acido carbossilico.

Meccanismo della sintesi di Strecker

L�idrolisi del nitrile porta all�amminoacido.

Stadio 1: formazione dell�immina

Stadio 2: attacco dello ione cianuro

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Risoluzione degli Amminoacidi

•  solitamente, solo l�enantiomero L- e biologicamente attivo.

•  Si converte l�amminoacido in un sale, utilizzando un acido o una base chirale. Si ottiene cosi la miscela dei due Sali diastereomerici che possono essere separati

•  Si utilizza un enzima come l�deacilasi che reagisce solo con uno dei due enantiomeri.

Formazione di esteri diasteromerici

H3N CH

R

C

O

O− + R* OH H3N CH

R

C

O

OR* + H2OH ++ +

Risoluzione di racemati: alcuni esempi

Risoluzione enzimatica

Struttura dei Peptidi

•  Il legame peptidico è un legame ammidico. •  Le ammidi sono composti molto stabili e neutri.

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Alternanza dei piani in un polipeptide

Bradichinina

•  Un oligopeptide non proteico. •  Convenzionalmente le strutture dei peptidi

vengono disegnate con l�amminoacido N-terminale sulla sinistra.

•  Il nome dei peptidi è costruito nominando tutti gli amminoacidi che lo compongono a partire dall�amminoacido N-terminale: arginilprolilprolil……arginina.

Legame disolfuro

La cisteina può formare ponti disolfuro.

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Determinazione della struttura di un peptide

•  Rottura dei ponti disolfuro •  Determinazione della composizione in amminoacidi •  Sequenziazione dall�N-terminale •  Analisi dei residui C-terminali •  Idrolisi parziale

Il primo passaggio è la rottura del ponte disolfuro

Il passaggio successivo è la determinazione del tipo e del numero degli amminoacidi contenuti

•  Si Separano le catene polipeptidiche. •  Si mette a bollire con HCl 6 M per 24 ore. •  Gli amminoacidi si separano con un analizzatore.

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Reazione con la Ninidrina

•  Utilizzata per visualizzare le macchie o le bande degli amminoacidi separati per cromatografia o elettroforesi.

•  Colore porpora intenso formato con tutti gli amminoacidi La prolina e l�idrossiprolina danno una colorazione gialla.

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Sequenziazione dall�N-terminale

•  Degradazione di Edman: reazione con fenil isotiocianato seguita dall�idrolisi rimuove l�amminoacido N-terminale.

•  La feniltioidantoina viene identificata per via gascromatografica.

•  È utilizzata con buoni risultati per polipeptidi con meno di 30 amminoacidi.

Esempio di degradazione di Edman per ossitocina bovina

Sequenziazione del residuo C terminale

•  L�enzima carbossipeptidasi rompe selettivamente il C-terminale.

•  Riduzione della funzione carbossilica a funzione alcolica

•  Idrazinolisi del peptide.

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Idrolisi parziale

Formazione di un legame ammidico

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Sintesi di un dipeptide

Sintesi di un peptide in fase liquida

•  Dapprima, si protegge il gruppo N terminale. •  Si attiva il gruppo carbossilico del medesimo

amminoacido. •  Si fa avvenire la reazione con l�amminoacido

successivo. •  Per sintetizzare un polipeptide si ripete

l�operazione di attivazione ed accoppiamento. •  Terminata la sintesi si rimuove il gruppo protettivo.

Sintesi di un tripeptide

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Sintesi di un tripeptide

Sintesi di peptidi su fase solida

•  La catena polipeptidica da sintetizzare è ancorata ad un letto di piccoli granuli di polistirene.

•  Gli intermedi non devono essere purificati. •  I reagenti in eccesso vengono lavati via con un idoneo

solvente. •  Il processo può essere automatizzato. •  Permette di costruire peptidi più lunghi rispetto alla

sintesi in soluzione.

Sintesi automatica di Merrifield 1° Stadio

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Sintesi automatica di Merrifield 2° Stadio

Sintesi automatica di Merrifield 3° Stadio

Sintesi automatica di Merrifield 4° Stadio

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Sintesi automatica di Merrifield 5° Stadio

Classificazione delle proteine

•  Semplici: idrolizzano solo ad amminoacidi. •  Coniugate: sono legate ad un gruppo non proteico

come zuccheri, acidi nucleici, lipidi. •  Fibrose: lunga e filamentosa, insolubile in acqua,

funzione strutturale. •  Globulari: ripiegata in forma sferica, funzione

enzimatica, ormonale, o di trasporto ormonale.

Proteine fibrose

Proteine globulari

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Legame disolfuro

Schema di una catena polipeptidica con legami a ponte disolfuro intercatena ed intracatena Note: i ponti disolfuro intracatena legano insieme due parti dello stesso polipeptide, mentre il legame intercatena unisce due catene di polipeptidi differenti.

Il ponte disolfuro contribuisce alla forma della proteina

Formazione del legame disolfuro

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Livelli delle struttura delle proteine

•  Primaria: la sequenza degli amminoacidi nella catena ed i legami disolfuro.

•  Secondaria: struttura formata dai legami idrogeno. Esempio è l�α-elica e il foglietto piegato (struttura β ).

•  Terziaria: la conformazione completa 3-D. •  Quaternaria: l�associazione di due o più catene

peptidiche per formare le proteine.

Livelli delle struttura delle proteine

Alfa elica

Ogni ossigeno carbonilico può formare un legame idrogeno con l�N-H dell�avvolgimento successivo dell�elica.

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Vista laterale di un segmento di un��α elica di una proteina

Vista dall�alto di un segmento di un��α elica di una proteina

Foglietti piegati (struttura β ) Ogni ossigeno carbonilico forma un legame idrogeno con un N-H di una catena peptidica adiacente.

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STRUTTURA DELLE PROTEINE

� Struttura primaria: sequenza aminoacidica � Struttura secondaria: ripiegamento della catena

lungo un asse �  Cheratine: α- e β-cheratine

�  Collageno: tessuto connettivo

� Struttura terziaria: ripiegamento tridimensionale delle catene polipeptidiche.

Struttura terziaria

� Spesso determinata per diffrazione ai raggi X

�  Esempi di proteine globulari sono mioglobina, lisozima, ribonucleasi, citocromo C

�  Caratteristiche comuni: �  Ciascuna proteina ha una struttura caratteristica �  Ripiegamento compatto con poco spazio all�interno �  Localizzazione all�esterno di quasi tutti i gruppi idrofilici �  Localizzazione all�interno dei gruppi idrofobici �  Possono contenere tratti sia di α-elica sia di β-foglietto

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Mioglobina, una proteina globulare

La sequenza determina la struttura

�  La denaturazione dà luogo a conformazioni casuali della catena polipeptidica.

� Alcune proteine denaturate possono riacquistare la loro attività biologica

�  Esempio classico la ribonucleasi.

Denaturazione e rinaturazione della

ribonucleasi

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Stabilizzazione della struttura terziaria

�  Legame idrogeno tra gruppi peptidici

�  Legame idrogeno tra residui R polari

�  Interazioni idrofobiche

�  Legame idrogeno tra residui R carichi

L�interazione predominante è l�interazione idrofobica

Le interazioni

Struttura quaternaria

�  Caratteristica delle proteine oligomeriche

�  La struttura quaternaria designa l�interazione tra le varie unità della proteina.

� Alcune proteine che hanno struttura quaternaria dopo la denaturazione possono essere rinaturate.

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Sommario delle Strutture

Alterazioni chimiche negli amminoacidi

Alterazioni chimiche negli amminoacidi

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Alterazioni chimiche negli amminoacidi