RÉGULATION DE L’EXPRESSION GÉNÉTIQUE

1. L’opéron lactose

Procaryotes

STRUCTURE DU LACTOSE

liaison β-galactosidique

β-galactosidase galactose

glucose

lactose

CROISSANCE BACTÉRIENNE EN PRÉSENCE DE GLUCOSE ET DE LACTOSE

log D.O. Croissance bactérienne

[bactéries] [ONP]

T (h)

T (h)

Concentration en sucres

[glucose] [lactose]

Diauxie

INDUCTION ENZYMATIQUE

L'utilisation du lactose conditionne la présence

de la !-galactosidase, enzyme nécessaire

à sa dégradation. Il y a induction de l'enzyme.

Deux hypothèses sont à faire pour cette induction

• le lactose active la !-galactosidase, déjà

présente dans le milieu sous forme inactive.

! induction biochimique

• le lactose permet la synthèse de la ! -

galactosidase de novo.

! induction génétique

QUELLE EST LA NATURE DE L'INDUCTION ?

Expérience A :

• culture de bactéries en milieu :

+ glucose

+ méthionine 35S

pendant 1 heure à 37°C

• transfert de ces bactéries en milieu :

+ lactose

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase synthétisée n'est pas marquée.

Expérience B :

• culture de bactéries en milieu :

+ glucose

pendant 1 heure à 37°C

• transfert de ces bactéries en milieu :

+ lactose

+ méthionine 35S

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase synthétisée est marquée.

Conclusion : le lactoserégule la synthèse de novo de l'enzyme et non une régulation allostérique qui affecterait la conformation d'une enzyme déjà présente.

RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION OU DE LA TRADUCTION ?

Conclusion : le lactoserégule la synthèsede novo de l'enzymeau niveau transcriptionnel :l'ARN messager transcritest ensuite traduiten β-galactosidase.

Expérience A :

• culture de bactéries en milieu :

+ lactose + méthionine 35S + rifampicine

(inhibiteur de la transcription)

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase n'est pas synthétisée.

Expérience B :

• culture de bactéries en milieu :

+lactose + méthionine 35S + puromycine

(inhibiteur de la traduction)

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase n'est pas synthétisée.

RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION OU DE LA TRADUCTION ?

Conclusion : le lactoserégule la synthèsede novo de l'enzymeau niveau transcriptionnel :l'ARN messager transcritest ensuite traduiten β-galactosidase.

Expérience A :

• culture de bactéries en milieu :

+ lactose + méthionine 35S + rifampicine

(inhibiteur de la transcription)

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase n'est pas synthétisée.

Expérience B :

• culture de bactéries en milieu :

+lactose + méthionine 35S + puromycine

(inhibiteur de la traduction)

pendant 1 heure à 37°C

! la !-galactosidase n'est pas synthétisée.

L'ALLOLACTOSE EST L'INDUCTEUR

allactose β,1-6

lactose β,1-4

La β-galactoside transacétylase, enzyme de masse moléculaire 60 kDa transformant le lactose β,1-4 en allolactose β,1-6 par transglycosylation

DIPLOIDES PARTIELS

lacI+

lacZ+

O+

lacI-

lacZ+

O+

lacY+

lacA+

facteur F'

chromosome bactérien

L'OPERON LACTOSE D'ESCHERICHIA COLI

L'opéron lactose d'Escherichia coli (6 237 pdb) comporte les

éléments suivants :

• 3 gènes structuraux : lacZ, lacY et lacA.

• des éléments régulateurs, promoteur P et opérateur O, agissant

en cis.

• 1 gène régulateur, lacI, possédant son promoteur.

REGULATION DE L'OPERON LACTOSE

JACOB ET MONOD 1961

LES MUTATIONS DU RÉPRESSEUR

i- Le répresseur muté ne peut plus sefixer sur l'opérateur fonctionnel. Labactérie est [lacc]

is Le répresseur muté ne peut plusinteragir avec l'inducteur etchanger sa conformation (super-répresseur). La bactérie est [lac-]

i-

iS

O+

O+

LES MUTATIONS DE L’OPÉRATEUR

OC Le répresseur fonctionnel ne peutplus se fixer sur l'opérateur muté. Labactérie est [lacc].

i+

DIPLOIDE PARTIEL I- O +Z+ … // I+ O+ Z+

facteur F'

chromosome bactérien

• l'allèle I+ est dominant sur l'allèle I-

• ces bactéries sont de phénotype [lac+ inductible].

DIPLOIDE PARTIEL Is O+ Z+ … // I+ O+ Z+

chromosome bactérien

facteur F'

• l'allèle Is est dominant sur l'allèle I+

• ces bactéries sont de phénotype [lac-

non-inductible].

DIPLOIDE PARTIEL I+ Oc Z+ … // I+ O+ Z+

• l'allèle Oc est dominant sur l'allèle O+

• ces bactéries sont de phénotype [lac+

constitutif].

GGATCA5'

3'sensdemigration

EMPREINTE DE L’OPÉRATEUR

SUR L'ADN

INITIATION DE LA TRANSCRIPTION

5'

3' brin transcrit

3'

5'

G

C

A

T

C

G

A

T

T

A

T

A

T

A

A

T A

T

A

A

T N

+1-10-35

sens de transcription

A T

T

brin non transcrit

boîte -35 boîte -10 1er nucléotide transcrit

ADN

~ 60 nucléotides

~ 40 nucléotides ~ 20 nucléotides

L'ARN polymérase recouvre 60 nucléotides environ sur l'ADN

INITIATION DE LA TRANSCRIPTION

Promoteur (ADN couvert par l'ARN polymérase)

Séquences non consensus du promoteur Moitiés symétriques de l'opérateur

ARN messager

Opérateur (ADN couvert par le répresseur)

• Le promoteur faible occupe la position –48 à +12

• L'opérateur occupe la position –5 à +21

Ces deux séquences se recouvrent donc partiellement.

GLUCOSE ET TAUX INTRACELLULAIRE D'AMPc

PROTÉINE CAP, AMPc ETTRANSCRIPTION DE L’OPÉRON LAC

La protéine CAP est un dimère de sous-unités identiques (22,5 kDa chacune) : chaque sous-unité possède un site de liaison à l'ADN et un site de liaison pour l'AMPc. Le dimère seul ne peut se lier à l'ADN, mais dès qu'une molécule d'AMPc est fixée sur l'une des sous-unités, le changement conformationnel résultant permet la fixation du dimère CAP sur l'ADN.

REGION CONTRÔLANT DE L'OPERON LACTOSE

PromoteurSite CAP ARNmessager

OpérateurSéquences

non consensusdu promoteur

Moitiés symétriques de l'opérateur

Séquences consensus du site CAP

Sites de mutationsempêchant la protéine CAP

de se fixer à l'ADN

Fin du gènedu répresseur

Début dugèneβ-gal

Le site CAP occupe la position –72 à -49 Le promoteur faible occupe la position –48 à +12

L'opérateur occupe la position –5 à +21

CAP-AMPc ACTIVE L'OPERON LACTOSE

Les séquences en -10 et -35 étant différentes desséquences consensus des promoteurs forts, la protéineCAP intervient en incurvant l’ADN pour augmenter leniveau de fixation de l'ARN polymérase sur cepromoteur.

CAPAMPc

LE GLUCOSE RÉPRIME L’OPÉRON LACTOSE

Le glucose en abaissant le taux intracellulaire d’AMPC inactive laprotéine CAP et réprime la transcription de l’opéron lactose en absenceou présence de lactose.

(si absence de lactose…)

ACTIVATION TOTALE DE L’OPÉRON LACTOSE :PRÉSENCE DE LACTOSE ET ABSENCE DE GLUCOSE

QU’EST-CE QU’UN OPÉRON ?

Un opéron est une unité régulée d'expression des

gènes dans laquelle on trouve un ensemble de

gènes structuraux, sous le contrôle d'un système

régulateur unique (ATTENTION…).

Les gènes structuraux sont transcrits à partir

d'une région "opérateur-promoteur" commune,

sous la f orme d'un ARN messager unique, appelé

ARNm polycistronique, qui sera traduit en

protéines différentes.

Cet opéron est contrôlé par une protéine de

régulation (répresseur ou activateur) codée par un

gène de régulation spécifique.

CONTRÔLE NÉGATIF

CONTRÔLE POSITIF

Répresseur

Activateur

Lactose

Tryptophane

Répressioncatabolique

Rhamnose

RÉGULATION DE L’EXPRESSION GÉNÉTIQUE

2. Régulation de la synthèse de tryptophane

L’OPÉRON TRYPTOPHANE

β-galactosidase galactose

glucose

lactose

CONTRÔLE NÉGATIFDE L’OPÉRON

TRYPTOPHANEen absence de trp en présence de trp

répresseurinactif

répresseur actif

Changements conformationnels du répresseur

L'opéron tryptophane est sous un contrôle négatif par un répresseur, dimère de sous-unités (PM 12 kDa), synthétisé sous forme inactive. L'inducteur est le tryptophane.

L’ATTÉNUATION

L'atténuation est une terminaison prématurée de

la transcription.

L'atténuation est provoquée par un terminateur

facultatif qui est situé au début de l'unité de

transcription de l'opéron et que l'on appelle

atténuateur.

STRUCTURE DE L’ATTÉNUATEUR

Séquence codantedu peptide leader

Terminaison

codons trpcodon stopcodon

"start"

Antiterminaison codon"start"

de l'ARNmtrpE

L'atténuateur de l'opéron tryptophane est une séquence nucléotidique

ARN de 162 bases, située à l'extrémité 5' de l'ARNm

polycistronique. Cette séquence est donc synthétisée à p artir

du promoteur de l'opéron trp avant la séquence codante du

gène trpE.

Elle comprend une séquence codante, comprise entre les

nucléotides 27 à 68 (codon d'initiation AUG à codon stop UGA)

permettant la synthèse d'un peptide de 14 acides aminés de

longueur : dont deux codons tryptophane (en positions 10 et 11,

c'est-à-dire quasiment à la fin de la séquence codante).

L’ARNm LEADER TRP

4 séquences nucléotidiques (notées 1, 2 , 3 et 4) sont des séquences

palindromiques qui peu vent conduire à l a formation de structures ARN

"en épingles à cheveux"

5'

peptideleader

séquence 1 séquence 2

séquence 3

séquence 4 séquence trpEséquence de pause

162140

CERTAINES STRUCTURES EN ÉPINGLES ÀCHEVEUX SONT DES TERMINATEURS

Terminateur rho-indépendant :

Terminateur rho-dépendant :

Structures en "épingle à cheveux"

Epingle 2/3 :antiterminateur

Epingle 3/4 :terminateur

PRÉREQUIS DE L’ATTÉNUATION

L'atténuation repose sur le fait que transcription et traduction sont simultanées chez les bactéries. Dans tous les cas, la transcription de l'ARNm tryptophane démarre. L'ARNm trytophane en cours de synthèse est traduit.

C'est la position du ribosome en cours de traduction qui va déterminer la suite des évènements :

- atténuation et arrêt de la transcription- poursuite de la transcription

Le ribosome pourra avoir deux positions sur l'ARNm et selon ces positions, il pourra y avoir formation de deux types de structures en épingle à cheveux différentes :

- position A : formation d'une boucle 2/3 boucle d'antiterminaison- position B : formation d'une boucle 3/4 boucle de terminaison

C'est la vitesse de traduction du peptide leader qui déterminera la position du ribosome sur l'ARNm tryptophane.

PRINCIPE DE L’ATTÉNUATION

ARNpolymérase

ARNpolymérase

terminateur rho-indépendant

En absence de TRP:-freinage par absence d’ARNt-TRP-épingle à cheveux 2/3-il y a synthèse de l’ARNm

En présence de [trp] moyenne:- pas de freinage-épingle à cheveux 3/4-terminaison de la transcription

RÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DU TRP

3 Niveaux de régulation :- Rétroinhibition de la voie de synthèse- Répression de l’opéron par un répresseur fixant le tryptophane comme corépresseur- Atténuation : transcription abortive de l’opéron

Question :Dans quelles conditions de concentration de

tryptophane interviennent ces différents processus ?

RÉGULATION DE L’EXPRESSION GÉNÉTIQUE

3. Autres mécanismes de régulation de L’expression génétique…

L'ARN POLYMERASE BACTERIENNE

brin transcrit3' 5'α

α

σ

β

β'

~ 60 nucléotides

sites d'interaction avec l'ADN site catalytique

intérieur du complexe

3' 5' brin transcrit

L'ARN polymérase bactérienne ou holoenzyme (500 kDa) !2""'#:

• sous-unité ! (x2) : interactions avec les protéines régulatrices

• sous-unité " : formation des liaisons phosphodiesters

• sous-unité "' : liaison au brin d'ADN matrice

• sous-unité # : reconnaissance du promoteur

Échange de sous unité σ

NIVEAUX DE CONTRÔLES DES GÈNES

Chez les bactéries, le contrôle des gènes

s'exerce essentiellement à 3 niveaux :

• l'initiation de la transcription

• la terminaison de la transcription

• la stabilité des ARN messagers

Dans quelques cas il existe une régulation de la

traduction des ARNm

(Chez les eucaryotes, il existe des niveaux

supplémentaires affectant la maturation des

ARN messagers et la traduction en protéines).