(1 6)-β-D-GLUCANA (LASIODIPLODANA) SULFATADA: OBTENÇÃO...

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS GABRIELLE CRISTINA CALEGARI (16)-β-D-GLUCANA (LASIODIPLODANA) SULFATADA: OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES BIOATIVAS Dissertação de Mestrado Pato Branco, 2019

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA

DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

GABRIELLE CRISTINA CALEGARI

(1→6)-β-D-GLUCANA (LASIODIPLODANA) SULFATADA: OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES BIOATIVAS

Dissertação de Mestrado

Pato Branco, 2019

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GABRIELLE CRISTINA CALEGARI

(1→6)-β-D-GLUCANA (LASIODIPLODANA) SULFATADA:

OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES BIOATIVAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná como requisito parcial para obtenção do título de “Mestre em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos” Orientador: Dr. Mário Antônio Alves da Cunha. Coorientadora: Drª. Vidiany Aparecida Queiroz Santos.

Pato Branco, 2019

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TERMO DE APROVAÇÃO Nº 82

TÍTULO DA DISSERTAÇÃO

“(1→6)-β-D-GLUCANA (LASIODIPLODANA) SULFATADA: OBTENÇÃO,

CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES BIOATIVAS”

Autora

Gabrielle Cristina Calegari

Esta dissertação foi apresentada às 13 horas e 30 minutos do dia 22 de fevereiro de 2019,

como requisito parcial para a obtenção do título de MESTRE EM TECNOLOGIA DE

PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS – Linha de pesquisa em biotecnologia – no

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. A autora

foi arguida pela Banca Examinadora abaixo assinada, a qual, após deliberação, considerou

o trabalho aprovado.

____________________________________ Prof. Dr. Mario Antonio Alves da Cunha

UTFPR/PB Orientador

______________________________________ Profa. Dra. Aneli De Melo Barbosa Dekker

UEL/Londrina Examinadora

__________________________________ Profa. Dra. Sirlei Dias Teixeira

UTFPR/PB Examinadora

Visto da Coordenação

Prof. Dr. Edimir Andrade Pereira

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos - PPGTP

O Termo de Aprovação assinado encontra-se na Coordenação do PPGTP

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

Universidade Tecnológica Federal do Paraná Câmpus Pato Branco

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

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“Os outros... Os que amaram sem pedir compensações, os que não lhe exigiram nada e lhe deram tudo.”

Olhai os lírios do campo Érico Veríssimo

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RESUMO CALEGARI, Gabrielle Cristina. (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) sulfatada: obtenção, caracterização e propriedades bioativas. 2019. 111 f. Dissertação – Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2019. A lasiodiplodana é uma (1→6)-β-D-glucana fúngica que apresenta diferentes

funcionalidades biológicas, incluindo atividades antioxidante, hipocolesterolêmica,

hipoglicemiante e anticarcinogênica. Suas propriedades biológicas podem ser

potencializadas por meio de modificações químicas na estrutura da macromolécula,

como por exemplo, a sulfatação. Neste contexto, no presente trabalho foram obtidos

derivados sulfatados com diferentes graus de substituição (DS), os quais foram

caracterizados por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

(IV-TF), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Análise Térmica (DTG, TGA e

DTA), Difração de Raios-X (DRX) e solubilidade. Algumas propriedades biológicas

foram avaliadas, tais como atividade antimicrobiana (MIC), antioxidante (FRAP, OH,

ABTS e DPPH) e potencial citotóxico. Dentre os derivados sulfatados com diferentes

DS (1,61; 1,42; 1,02 e 0,15) observou-se que não houve uma correlação direta entre

DS e concentração do reagente sulfatante empregado no protocolo de derivatização.

A derivatização promoveu aumento na solubilidade da macromolécula em relação a

lasiodiplodana nativa. A sulfatação foi confirmada por IV-TF, através do surgimento

de bandas em 1250 cm-1 (S=O) e 810 cm-1 (C-O-S), oriundas da introdução de

grupamentos sulfônicos. As imagens de MEV demonstraram que a sulfatação

promoveu mudanças morfológicas na superfície do biopolímero, levando ao

surgimento de estruturas fibrilares e heterogêneas ao longo da área superficial. A

lasiodiplodana sulfatada apresentou maior estabilidade térmica, ocorrendo oxidação

do biopolímero em temperaturas próximas a 460 °C. A análise por DRX demonstrou

que as amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatadas apresentaram perfil

difratográfico predominantemente amorfo, característico de polissacarídeos. A

sulfatação potencializou a atividade antimicrobiana da lasiodiplodana, especialmente

contra a Candida albicans (atividade fungicida) e Salmonella enterica Typhimurium

(atividade bacteriostática). A amostra nativa apresentou maior capacidade de

remoção do radical hidroxila, enquanto os derivados sulfatados apresentaram maior

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potencial FRAP. As lasiodiplodanas nativa e sulfatadas não demonstraram

citotoxicidade letal contra cepas selvagem e mutantes de Saccharomyces cerevisiae,

nas concentrações estudadas. As amostras com maiores DS (1,42 e 1,61)

apresentaram menor potencial de indução ao estresse oxidativo. Os resultados do

presente estudo indicam que o processo de sulfatação pode ser uma ferramenta

atrativa para a potencialização de atividades biológicas da lasiodiplodana, podendo

contribuir para a diversificação de suas aplicações biotecnológicas.

Palavras-chave: bioatividade, polissacarídeos fúngicos, sulfatação.

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ABTRACT CALEGARI, Gabrielle Cristina. (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) sulfated: obtaining, characterization and bioactive properties. 2019. 111 f. Dissertation - Post-Graduation Program in Chemical and Biochemical Processes Technology, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2019. Lasiodiplodan is a fungal (1→6)-β-D-glucan which exhibits different biological

functionalities, including antioxidant, hypocholesterolemic, hypoglycemic and

anticarcinogenic activities. Their biological properties may be potentiated by chemical

modifications in the macromolecule structure, such as sulfation. In this context, sulfate

derivatives with different degrees of substitution (DS) were obtained and characterized

by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscopy

(SEM), Thermal Analysis (DTG, TGA and DTA), X-ray Diffraction (XRD) and solubility.

Biological properties were evaluated, including antimicrobial (MIC) and antioxidante

(FRAP, OH, ABTS and DPPH) activities and cytotoxic potential. Sulfated derivatives

with different DS (1.61, 1.42, 1.02 and 0.15) were obtained, and there was no direct

correlation between DS and the concentration of the sulfating reagent used in the

derivatization protocol. Derivatization promoted an increase in the solubility of the

macromolecule regarding to native lasiodiplodan. Sulfation was confirmed by FT-IR

through the emergence of bands at 1250 cm-1 (S=O) and 810 cm-1 (C-O-S), derived

from the introduction of sulfonic groups. SEM showed that sulfation promoted

morphological changes on the surface of the biopolymer, leading to the appearance of

heterogeneous fibrillar structures along the surface area. The sulfated lasiodiplodan

showed higher thermal stability (oxidation temperatures close to 460 °C). XRD analysis

demonstrated that the native and sulfated lasiodiplodan samples present a

predominantly amorphous diffractographic profile, characteristic of polysaccharides.

Sulphation enhanced the antimicrobial activity of lasiodiplodan, especially against

Candida albicans (fungicidal activity) and Salmonella enterica Typhimurium

(bacteriostatic activity). The native sample presented higher hydroxyl radical removal

capacity, while the sulfated derivatives showed higher FRAP potential. Native and

sulfated lasiodiplodan did not demonstrate lethal cytotoxicity against wild and mutants

Saccharomyces cerevisiae strains at the concentrations studied. Samples with higher

DS (1.42 and 1.61) had lower potential for induction to oxidative stress. The results of

the present study indicate that the sulphation process can be an attractive tool to

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improve the lasiodiplodan biological activities and could contribute to the diversification

of its biotechnological applications.

Key-words: bioactivity, fungal polysaccharides, sulfation.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela vida, pela força que me foi concedida

nesta caminhada, principalmente nos momentos mais difíceis.

A minha família, meu pai Celso, minha mãe Izabel, e aos meus irmãos Matheus

e Marcelle, por sempre estarem ao meu lado e me apoiarem. Obrigada pela força,

carinho, paciência (e muita) e amor, ao lado de vocês esta caminhada tornou-se mais

leve. Amo vocês.

Agradeço as minhas amigas Carlise, Anna Paulla e Renata pela amizade e

apoio durante esses dois anos de mestrado. As manhãs de aula, listas, provas, dias

no laboratório, jantas mensais e conversas fizeram diferença nos meus dias. As

minhas amigas Marcieli, Jéssica, Larissa e Giulia que mesmo longe estiveram

presente em todos os momentos. Também as minhas amigas de vida, Raquel e

Àckilis. Obrigada por sempre me ouvirem, mesmo não convivendo mais dia-a-dia,

sempre me deram força. A Débora, que nesses últimos anos tornou-se uma grande

amiga e companheira de açaí, obrigada.

Aos meus colegas e amigos de laboratório de biotecnologia e bioprocessos,

que sempre me deram apoio, incentivo e que tornaram a rotina do laboratório, seja

em dias da semana, noites, fins de semana e feriados mais agradáveis e felizes.

A nossa assistente administrativa do PPGTP, Neide, que sempre foi atenciosa

em me ajudar. Meu sincero agradecimento e reconhecimento.

A minha co-orientadora, amiga, e segunda mãe Dra. Vidiany, por tudo.

Obrigada pelos ensinamentos, por sempre (sempre mesmo) estar ao meu lado, por

toda ajuda e orientação nesta caminhada. Obrigada pela palavra amiga, pelos

momentos pertinentes e intransferíveis de amizade.

Ao meu orientador Dr. Mário por confiar a mim este trabalho. Obrigada pelos

ensinamentos, atenção e orientações que foram, com certeza, fundamentais em

minha formação acadêmica e profissional.

Este estudo foi financiado em partes pela Coordenação de Aperfoiçoamento de

Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação da formação do dissacarídeo lactose (β-D-galactopiranosil-

(1,4)-D-glicopiranose), por meio da ligação glicosídica entre os monossacarídeos β-

1,4-galactose e α-1,4-glicose. ................................................................................... 22

Figura 2. Estrutura química dos polissacarídeos vegetais amido (a) e celulose (b). . 23

Figura 3. Fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI cultivado em ágar sabouraud com

cloranfenicol, evidenciando o abundante crescimento de micélio aéreo. .................. 25

Figura 4. Estrutura básica da parede celular fúngica. ............................................... 27

Figura 5. Estrutura química da (a) dextrana (1,6-α—D-glicosil), (b) levana (2,6-β-D-

frutosil) e (c) xantana. ................................................................................................ 28

Figura 6. Exemplos de tipos de conformações das β-glucanas, (a) β-1,3, (b) β-1,4 e

(c) β-1,6. .................................................................................................................... 30

Figura 7. Representação estrutural de β-glucanas modificadas por: (a) sulfatação, (b)

carboximetilação, (c) fosforilação, (d) acetilação, (e) selenização e (f) alquilação .... 33

Figura 8. Representação estrutural de uma glucana sulfatada no carbono 3. .......... 34

Figura 9. Representação esquemática dos diferentes alvos das substâncias

antimicrobianas na estrutura celular e mecanismos de resistência. .......................... 36

Figura 10. Estrutura química da heparina. ................................................................ 37

Figura 11. Representação esquemática do mecanismo de ação anticoagulante de

polissacarídeos sulfatados. ....................................................................................... 38

Figura 12. Reação de oxirredução do radical livre TPTZ durante avalição

antioxidante (FRAP). ................................................................................................. 40

Figura 13. Reação de hidroxilação do salicilato de sódio. ......................................... 41

Figura 14. Reação de oxirredução do radical livre DPPH durante avalição

antioxidante de DPPH. .............................................................................................. 41

Figura 15. Reação de oxirredução do radical livre ABTS durante avalição

antioxidante de ABTS. ............................................................................................... 42

Figura 16. Fluxograma da produção biotecnológica da lasiodiplodana nativa e do

processo de derivatização química por sulfatação .................................................... 46

Figura 17. Fluxograma das caracterizações estruturais e biológicas realizadas nas

amostras.................................................................................................................... 47

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Figura 18. Sistema de microcultivo fúngico em lâmina. ............................................ 48

Figura 19. Representação esquemática do processo de produção e recuperação da

lasiodiplodana nativa (LAS-N) ................................................................................... 49

Figura 20. Processo de preparo do reagente sulfatante, utilizando ácido

clorossulfônico e piridina. .......................................................................................... 50

Figura 21. Processo de sulfatação da lasiodiplodana. .............................................. 51

Figura 22. Cultivo do fungo L. theobromae MMPI em ágar PDA: 7 dias de incubação

(A) e 14 dias de incubação (B). ................................................................................. 58

Figura 23. Microscopia ótica do fungo L. theobromae MMPI: (A) micélio aéreo na

superfície do meio PDA; (B) microcultivo em lâmina; (C) visualização das hifas com

amplitudes de 40 x e (D) 1000 x. .............................................................................. 59

Figura 24. Mecanismo reacional da sulfatação da lasiodiplodana. ........................... 61

Figura 25. Espectros de infravermelho da LAS-N, LAS-S1:10, LAS-S1:6, LAS-S1:4 e

LAS-S1:5. .................................................................................................................. 66

Figura 26. Sobreposição dos espectros de infravermelho da LAS-N e LAS-S1:5

(DS=1,61). ................................................................................................................. 67

Figura 27. Ampliações nas regiões entre (A) 4000 e 2700 cm-1, (B) 1600 e 1100 cm-

1 e (C) 1100 e 400 cm-1, comparando a LAS-N e a lasiodiplodana sulfatada (LAS-

S1:5). ......................................................................................................................... 67

Figura 28. Micrografias das amostras LAS-N, LAS-S1:10, LAS-S1:6, LAS-S1:4 e

LAS-S1:5, nas amplitudes de 300x, 800x e 1200x. ................................................... 69

Figura 29. Perfil térmico da amostra de lasiodiplodana nativa (LAS-N), pelas curvas

de DTA, DTG e TGA. ................................................................................................ 71

Figura 30. Curvas de DTA, DTG e TGA das amostras sulfatadas: (a) LAS-S1:10, DS

de 0,15, (b) LAS-S1:6, DS de 1,02, (c) LAS-S1:4, DS de 1,42 e (d) LAS-S1:5 com

DS de 1,61. ............................................................................................................... 72

Figura 31. Difratogramas das amostras de lasiodiplodana nativa (LAS-N), e das

sulfatadas (LAS-S1:5, LAS-S1:4, LAS-S1:6 e LAS-S1:10. ........................................ 74

Figura 32. Potencial de redução do íon férrico (FRAP) das amostras de LAS-N e

LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10,

DS=0,15. ................................................................................................................... 79

Figura 33. Potencial de capacidade de sequestro do radical OH• das amostras de

LAS-N e LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-

S1:10, DS=0,15. ........................................................................................................ 81

13

Figura 34. Potencial de captura do radical DPPH das amostras de LAS-N e LAS-S.

LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15.

.................................................................................................................................. 83

Figura 35. Potencial de captura do radical ABTS das amostras de LAS-N e LAS-S.

LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15.

.................................................................................................................................. 84

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Proporções utilizadas de ácido clorossulfônico e piridina no preparo das

amostras.................................................................................................................... 50

Tabela 2. Composição elementar (C e S) das amostras sulfatadas e seus

respectivos graus de substituição. ............................................................................ 62

Tabela 3. Solubilidade das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatadas em água

e DMSO 20%. ........................................................................................................... 64

Tabela 4. Potencial antimicrobiano das amostras de lasiodiplodana nativa e

sulfatada contra diferentes cepas de bactérias e leveduras. ..................................... 76

Tabela 5. Estresse oxidativo frente as cepas de leveduras testadas das amostras de

lasiodiplodana nativa e sulfatadas. ............................................................................ 86

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LISTA DE ABREVIATURAS

5-Fu 5-Fluorouracil

ABTS Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico

ATCC American Type Culture Collection

BHI Brain Heart Infusion

CSA Ácido Clorossulfônico

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

DRX Difratometria de Raios-X

DS Grau de Substituição

DTA Análise Térmica Diferencial

DTG Análise de Termogravimetria Derivada

DV2 Dengue Sorotipo 2

EPS Exopolissacarídeo

FRAP Poder de Redução do Íon Férrico

FTIR Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

GSH1 Glutamato Citeína Ligase

GST Glutationas Tranferases

GTT1 Glutationa Transferase 1

GTT2 Glutationa Transferase 2

HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana

IMC Índice de Massa Corporal

IPS Polissacarídeos Intracelulares

LAS-N Lasiodiplodana Nativa

LAS-S Lasiodiplodana Sulfatada

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

MIC Concentração Mínima Inibitória

MRB Modificadores de Respostas Biológicas

NK Natural Killer

OH• Radical Hidroxila

Py Piridina

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PDA Ágar Batata Dextrose

RNA Ácido Ribonucleico

RNS Espécies Reativas de Nitrogênio

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

TGA Análise Termogravimétrica

TPTZ 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine

UFC Unidade de Formação de Colônias

VMSM Meio de Sais Minerais de Vogel

YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21

2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 21

2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 21

3 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 22

3.1 Polissacarídeos ................................................................................................. 22

3.1.2 Polissacarídeos microbianos ............................................................................ 24

3.2 Lasiodiplodia theobromae ................................................................................ 25

3.3 Exopolissacarídeos (EPS) ................................................................................ 26

3.4 Glucanas ............................................................................................................ 29

3.4.1 Lasiodiplodana ................................................................................................. 31

3.5 Modificações químicas de polissacarídeos .................................................... 32

3.5.1 Modificação química por sulfatação ................................................................. 34

3.5.2 Atividades biológicas relacionadas à sulfatação .............................................. 35

3.6 Potencial antioxidante ...................................................................................... 39

3.6.1 Poder de redução do íon férrico (FRAP) .......................................................... 39

3.6.2 Sequestro do radical hidroxila .......................................................................... 40

3.6.3 Captura do radical DPPH ................................................................................. 41

3.6.4 Captura do radical ABTS .................................................................................. 42

3.7 Estresse oxidativo ............................................................................................. 42

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 46

4.1 Fluxograma das atividades desenvolvidas ..................................................... 46

4.2 Produção do exopolissacarídeo lasiodiplodana e derivatização química ... 47

4.2.1 Caracterização macro e micro-morfológica da cepa Lasiodiplodia theobromae

MMPI ......................................................................................................................... 47

4.2.2 Preparo do inóculo para produção de lasiodiplodana ...................................... 48

4.2.3 Produção da lasiodiplodana em cultivo submerso ........................................... 48

4.2.4 Derivatização química da lasiodiplodana por sulfatação .................................. 49

4.3 Caracterização química da lasiodiplodana nativa e sulfatada ...................... 51

4.3.1 Determinação do grau de sulfatação (DS) ....................................................... 51

4.3.2 Avaliação da solubilidade ................................................................................. 52

18

4.3.3 Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (IV-TF) .......... 52

4.3.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ..................................................... 53

4.3.5 Análise Térmica ................................................................................................ 53

4.3.6 Difração de raios-X (DRX) ................................................................................ 53

4.4 Caracterização biológica da lasiodiplodana nativa e sulfatada .................... 53

4.4.1 Determinação do potencial antimicrobiano ....................................................... 53

4.4.2 Atividade antioxidante ...................................................................................... 54

4.4.2.1 Poder de redução do íon férrico (FRAP) ....................................................... 54

4.4.2.2 Sequestro do radical hidroxila ....................................................................... 55

4.4.2.3 Captura do radical DPPH .............................................................................. 55

4.4.2.4 Captura do radical cátion ABTS .................................................................... 56

4.4.3 Citotoxicidade sobre células de Saccharomyces cerevisiae ............................ 56

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 58

5.1 Aspectos morfológicos da cepa Lasiodiplodia theobromae MMPI .............. 58

5.2 Grau de sulfatação ............................................................................................ 59

5.3 Solubilidade dos derivados obtidos ................................................................ 63

5.4 Análises dos espectros de Infravermelho (IV-TF) .......................................... 65

5.5 Análise das imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) .......... 68

5.6 Perfil térmico das amostras de lasiodiplodana .............................................. 71

5.7 Análise por difração de raios-X (DRX) ............................................................. 73

5.8 Atividade antimicrobiana (MIC) ........................................................................ 75

5.9 Potencial Antioxidante ...................................................................................... 79

5.9.1 Avaliação do poder de redução do íon férrico (FRAP) ..................................... 79

5.9.2 Avaliação da capacidade de sequestro do radical hidroxila ............................. 80

5.9.3 Avaliação da capacidade de captura do radical DPPH .................................... 82

5.9.4 Avaliação da captura do radical cátion ABTS ................................................... 84

5.10 Avaliação da citotoxicidade sobre Saccharomyces cerevisiae .................. 85

6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 88

7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 90

8 APÊNDICES ........................................................................................................ 103

19

1 INTRODUÇÃO

Polissacarídeos provenientes de bactérias, leveduras, fungos filamentosos e

algas têm sido descritos na literatura científica como materiais com diferentes

potencialidades biológicas. Muitas destas macromoléculas têm atraído atenção do

setor farmacêutico por apresentarem atividades imunomoduladora, antioxidante, anti-

inflamatória, antimicrobiana e antitumoral, além de algumas contribuírem para a

redução de riscos de desenvolvimento de doenças cardiovasculares e diabetes.

Dentre os polissacarídeos microbianos, destacam-se as β-glucanas que são

biopolímeros constituídos por unidades de glucose unidas por ligações glicosídicas e

diferenciam-se pelo tamanho das cadeias poliméricas, estrutura molecular, tipo de

conformação e ramificações. É importante mencionar que as diferenças

conformacionais e estruturais interferem diretamente nas funcionalidades biológicas

que estas biomacromoléculas podem apresentar. Neste contexto, é estratégica a

busca por novas glucanas, incluindo a obtenção de derivados quimicamente

modificados, os quais podem apresentar novas funcionalidades biotecnológicas ou

ainda terem suas propriedades potencializadas.

A lasiodiplodana, uma D-glucana extracelular com estrutura linear do tipo

β(1→6) produzida pelo fungo ascomiceto Lasiodiplodia theobromae MMPI, tem

demonstrado diferentes funções biológicas, incluindo atividade antioxidante,

hipocolesterolêmica, hipoglicemiante e anticarcinogênica.

Dentre as modificações químicas que podem potencializar as funcionalidades

biológicas dos polissacarídeos, é destacada a sulfatação. A sulfatação é uma reação

que envolve a substituição nucleofílica nos grupos hidroxilas presentes nas unidades

monoméricas, por grupamentos sulfatos (O-SO3H). Tal derivatização promove

principalmente a potencialização das atividades anticoagulante, antitrombótica,

antiviral e antimicrobiana.

Polissacarídeos modificados quimicamente têm atraído cada vez mais a

atenção de pesquisadores e do setor industrial, em função de suas interessantes

propriedades tecnológicas e funcionalidades biológicas. Estes biopolímeros

constituem hoje um nicho de mercado que movimenta milhões de dólares, com

perspectivas de expansão especialmente nos setores farmacêutico e alimentício. O

mercado global de biopolímeros foi avaliado em US$ 2.465,4 milhões no ano de 2017

20

e há perspectivas de um crescimento de aproximadamente 192%, com taxa de

crescimento anual composta (CAGR) de 15,2% atingindo então um valor de US$

7.196,8 milhões até 2024 (NAGI, 2018).

Com base nas informações apresentadas, o presente trabalho teve por objetivo

a bioprodução e a derivatização química por sulfatação da lasiodiplodana ((1→6)-β-

D-glucana). Macromoléculas com diferentes graus de sulfatação foram obtidas,

caracterizadas quimicamente e submetidas a avaliação de potencialidades biológicas,

como atividade antimicrobiana e antioxidante. Além disso, foi avaliado o estresse

oxidativo dos derivados sobre cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae.

21

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Obter e caracterizar derivados sulfatados de (1→6)-β-D-glucana.

2.2 Objetivos específicos

Produzir a (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) pelo fungo L. theobromae MMPI

em cultivo submerso;

Modificar químicamente por sulfatação, utilizando diferentes concentrações do

reagente sulfatante;

Avaliar o grau de substituição e solubilidade dos derivados obtidos;

Caracterizar por espectroscopia na região do infravermelho com transformada

de Fourier (IV-TF), microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise térmica

(DTG, TGA e DTA) e difratometria de raios-X (DRX);

Avaliar os potenciais antioxidante e antimicrobiano;

Avaliar o estresse oxidativo da lasiodiplodana nativa e dos derivados usando

Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico.

22

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Polissacarídeos

Polissacarídeos são estruturas de condensação em que unidades

monossacarídicas como D-ribose, D-glicose e frutose, estão unidas entre si por

ligações glicosídicas. Eles podem diferir entre si em relação à unidade monomérica

constituinte, o grau de ramificação, massa molecular, tipo de ligações e no

comprimento de suas cadeias (XIAO; GRINSTAFF, 2017; KAGIMURA et al., 2015a).

As ligações glicosídicas ocorrem pela condensação ou desidratação do grupo

hidroxila hemiacetal de um açúcar e um grupo hidroxila de outra unidade de açúcar,

como representado na figura 1.

Figura 1. Representação da formação do dissacarídeo lactose (β-D-galactopiranosil-(1,4)-D-glicopiranose), por meio da ligação glicosídica entre os monossacarídeos β-1,4-galactose e α-1,4-glicose. Fonte: Autoria própria.

Tais macromoléculas desempenham importantes funções em sistemas

biológicos, atuando no armazenamento de energia, lubrificação e transdução de sinal

celular, bem como função estrutural (XIAO; GRINSTAFF, 2017). Polissacarídeos

podem ser encontrados em plantas e vegetais (amido e celulose), células animais

(glicogênio), algas (ágar e alginato), e ainda em sementes e exsudados de árvores

(gomas guar e arábica).

Polissacarídeos de origem vegetal têm se destacado como materiais que

possuem propriedades biotecnológicas. KUMA e KUMAR (2017), avaliaram a

23

utilização de um polissacarídeo oriundo das sementes de Albizia lebbeck L. (faveiro)

como excipiente de fármacos. Tal estudo mostrou que o polissacarídeo de faveiro

possui propriedades adequadas para uso como estabilizante de espumas

alimentícias, além de ser um material termicamente estável e sensível ao pH, podendo

ser utilizado como veículo de liberação de drogas. Similarmente, TANG et al. (2018),

extraíram três tipos de polissacarídeos de batata doce roxa e avaliaram seus efeitos

imunológicos. Neste estudo os autores verificaram que estes polissacarídeos são

capazes de estimular a resposta imune através de macrófagos e regular a imunidade

adaptativa, aumentando a produção de imunoglobulina, como revelou os testes

realizados em camundongos.

Entre os polissacarídeos vegetais tradicionalmente utilizados pelas indústrias

alimentícia e farmacêutica, destaca-se o amido, um homopolissacarídeo constituído

por unidades de D-glicopiranose (figura 2a), o qual é empregado na elaboração de

filmes biodegradáveis, utilizados em embalagens alternativas de alimentos

LUCHESE, SPADA e TESSARO (2017) e no revestimento de papéis a fim de

aumentar a resistência à umidade (LIN et al., 2017).

A celulose vegetal, um polissacarídeo constituído por subunidades de glicose

unidas por ligações do tipo (14), como demonstrado na figura 2b, também tem sido

empregada como agente transportador de medicamentos (WIJAYA et al., 2017),

filmes biodegradáveis para embalagens, como material absorvente e fibra

(PHINICHKA; KAENTHONG, 2016), além de serem utilizadas em sistemas óleo-gel

com grande campo de aplicação nas indústrias de alimentos, farmacêutica e de

cosméticos (JIANG et al., 2017).

Figura 2. Estrutura química dos polissacarídeos vegetais amido (a) e celulose (b). Fonte: Autoria própria.

24

3.1.2 Polissacarídeos microbianos

Além dos polissacarídeos de origem vegetal, os polissacarídeos de origem

microbiana obtidos de leveduras, bactérias, algas e fungos filamentosos (SOUZA;

GARCIA-CRUZ, 2004) tem ganhado espaço no mercado mundial. O interesse em

polissacarídeos microbianos está associado ao fato de tais moléculas além de

apresentarem diferentes propriedades tecnológicas (espessante, umectante,

texturizante, etc) mostram-se promissoras no tratamento de algumas doenças,

apresentando também atividades antimicrobianas, antioxidantes e antitumorais,

dentre outras bioatividades (ALZORQI et al., 2016; XU et al., 2017).

A localização celular é um fator de classificação destes biopolímeros. Há

polissacarídeos que permanecem ligados à parede celular (polissacarídeos

estruturais); outros são encontrados intracelularmente (grânulos ou inclusões

celulares), e os exopolissacarídeos, os quais são liberados para o meio extracelular

(MAHAPATRA; BANERJEE, 2013). Outro aspecto a ser considerado, é que os

polissacarídeos microbianos podem ser sintetizados em diferentes fases do

crescimento microbiano, sendo o mecanismo biossintético, particularmente específico

para cada tipo de microrganismo (SOUZA; GARCIA-CRUZ, 2004).

DI et al. (2017) caracterizaram quimicamente e avaliaram algumas atividades

biológicas de exopolissacarídeos produzidos por espécies de Lactobacillus. Os

autores verificaram que, além da possibilidade de utilização em produtos alimentícios

funcionais, tais polissacarídeos desempenharam efeito inibitório significativo contra a

proliferação de células tumorais colorretais HT-29.

Estudos desenvolvidos por HAN et al. (2016), mostraram a produção de

polissacarídeo exocelular (exopolissacarídeo) pela levedura Sporidiobolus pararoseus

JD-2. Esta molécula demonstrou caráter aniônico capaz de potencializar funções

imunológicas, além de poder ser empregado como espessante em indústrias de

alimentos.

Os fungos filamentosos são os principais produtores de polissacarídeos, os

quais apresentam 75% de sua parede celular composta por tais macromoléculas

(FUKUDA et al., 2009). Diferentes fungos têm sido mencionados na literatura científica

como produtores de polissacarídeos, dentre os quais destacam-se o Cordyceps

kyushuensis (ZHANG et al., 2015), Botryosphaeria rhodina (GIESE et al., 2011),

25

Lasiodiplodia theobromae MMPI (KAGIMURA et al., 2015b), Aureobasidium pullulans

(AOKI et al., 2015), Botrytis cinerea (JADHAV; GUPTA, 2016) e Epicoccum nigrum

(SCHMID et al., 2006).

3.2 Lasiodiplodia theobromae

O Lasiodiplodia theobromae é um fungo filamentoso pertencente à família

Botryosphaeriaceae, gênero Lasiodiplodia, anteriormente designado como

Botryosphaeria theobromae (MUNIZ et al., 2011). Este fungo é a representação do

estado assexuado do Botryosphaeria rhodina porém, há isolados diferentes que

podem apresentar características variáveis quanto a coloração e velocidade de

crescimento (SOMENSI, 2014). O L. theobromae apresenta abundante micélio aéreo

e a coloração das colônias, como demonstrado na figura 3, pode variar de branco à

cinza e até negro, dependendo do substrato e tempo de incubação (RODRIGUES,

2003).

Figura 3. Fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI cultivado em ágar sabouraud com cloranfenicol, evidenciando o abundante crescimento de micélio aéreo. Fonte: Autoria própria.

L. theobromae é um fitopatógeno típico das regiões tropicais e subtropicais, que

causa sérios prejuízos a numerosas espécies vegetais cultivadas. Este fungo infecta

os caules levando à redução no transporte de nutrientes e água, com consequente

redução da fotossíntese e morte do cultivar (CIPRIANO et al., 2015). O L. theobromae

26

tem sido associado a manchas foliares, necrose e gomose de plantas, incluindo

herbáceas e plantas lenhosas. Estudos revelam que o L. theobromae pode causar

doenças em flores como a Rosa rugosa (CHEN et al., 2016), cajueiros (CIPRIANO et

al., 2015), Falcataria moluccana (JI et al., 2017) e abacateiros (MAFTOONAZAD et

al., 2007). Menos frequentemente, também tem sido associado a doenças

subcutâneas em humanos (PAPACOSTAS et al., 2015).

Em contrapartida, este fungo tem se mostrado um eficiente produtor de

exopolissacarídeo (EPS), como a lasiodiplodana ((1→6)-β-glucana) quando cultivado

sob fermentação (KAGIMURA et al., 2015a).

Similarmente, (OLIVEIRA et al., 2015) reportaram a produção de dois tipos de

exopolissacarídeos, uma (1→3)(1→6)-β-glucana e uma (1→6)-β-glucana pela cepa

L. theobromae MMBJ em cultivo submerso. Estes autores avaliaram a atividade

imunomoduladora e verificaram a presença de citocinas como TFN-α (pró-

inflamatória) e IL-10 (anti-inflamatória) envolvidas na atividade de modulação, sendo

verificada resposta dose-dependente em relação a citocina pró-inflamatória.

3.3 Exopolissacarídeos (EPS)

Os polissacarídeos microbianos comumente são produzidos como constituintes

da parede celular, onde desempenham funções estruturais e de proteção contra

estresses exteriores. A composição polissacarídica da parede celular fúngica típica

está apresentada na figura 4. Entretanto, alguns polissacarídeos podem ser

excretados para o meio extracelular, sendo estes denominados exopolissacarídeos

(EPS). Os EPS apresentam vantagens em relação aos polissacarídeos intracelulares

e de parede celular, quanto a sua obtenção ou disponibilidade, pois apresentam

elevada produtividade, maior facilidade de isolamento e purificação, além da

possibilidade de serem produzidos a partir de resíduos agroindustriais como matéria

prima (MAHAPATRA; BANERJEE, 2013; DONOT; FONTANA; SCHORR-GALINDO,

2017).

27

Figura 4. Estrutura básica da parede celular fúngica. Fonte: Adaptado de GEOGHEGAN, STEINBERG e GURR, 2017).

A biossíntese de exopolissacarídeos por microrganismos pode estar

relacionada tanto a capacidade de sobrevivência quando em condições adversas,

quanto em condições ótimas de incubação, onde produzem estas biomoléculas como

reserva energética. Tais biomoléculas podem apresentar uma grande variedade de

combinações estruturais, e são classificadas em relação a sua composição

monomérica, em homopolissacarídeos e heteropolissacarídeos.

Homopolissacarídeos são constituídos por um único tipo de monossacarídeo na forma

de unidade repetida, como as dextranas e levanas (Figuras 5 a e b). Já os

heteropolissacarídeos, são constituídos por vários tipos de unidades

monossacarídicas, como a goma xantana (Figura 5 c) (DONOT; FONTANA;

SCHORR-GALINDO, 2012).

28

Figura 5. Estrutura química da (a) dextrana (1,6-α—D-glicosil), (b) levana (2,6-β-D-frutosil) e (c) xantana. Fonte: Autoria própria.

Os EPS possuem variada aplicação industrial, podendo ser utilizados como

biomateriais, emulsificantes e estabilizantes, além de serem modificadores de

resposta biológica (DONOT; FONTANA; SCHORR-GALINDO, 2012). Estudos

recentes desenvolvidos por (CASTELLANE et al., 2017), demonstraram que

exopolissacarídeos microbianos produzidos por espécies de Rhizobium sp.,

apresentaram atividade emulsificante com potenciais aplicações na degradação de

hidrocarbonetos e na biorremediação de áreas contaminadas com óleos.

Em relação aos polissacarídeos de origem fúngica, é interessante ressaltar que

alguns fungos produzem diferentes exopolissacarídeos e que uma mesma cepa é

capaz de produzir EPS com propriedades e características variadas. Condições

29

fermentativas específicas interferem diretamente na produção dos exopolissacarídeos

fúngicos, dentre as quais destacam-se o pH, temperatura (entre 22 e 30 °C), aeração,

velocidade de agitação, tempo de incubação, composição do meio de cultura, fonte

de carbono, concentração da fonte de carbono (glicose, maltose, entre outros), fonte

de nitrogênio (orgânica como peptona e inorgânica como sais de amônio) e ainda a

adição de sais contendo fosfato como fosfato monopotássico (KH2PO4), fosfato

dipotássico (K2HPO4) e sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O) (SOUZA,

GARCIA-CRUZ, 2004; MAHAPATRA, BANERJEE, 2013).

Neste sentido, CUNHA et al. (2012), avaliaram a influência de parâmetros

fermentativos como fonte de carbono e nitrogênio e forma de condução da

fermentação para a produção do EPS lasidiplodana ((1→6)-β-D-glucana). Maiores

rendimentos foram obtidos utilizandondo-se glicose e extrato de levedura como fontes

de carbono e nitrogênio, respectivamente, e em fermentações conduzidas em frascos

agitados. Da mesma forma, ZHU, DU, XU, (2016), avaliaram os efeitos da composição

do meio de cultura em relação a fonte de carbono (sacarose, glicose e amido solúvel)

e nitrogênio (peptona, extrato de carne e extrato de levedura) sobre o crescimento

micelial, massa molecular e potencial antitumoral de polissacarídeos intracelulares

(IPS) oriundos de Cordyceps gunnii. Estes autores verificaram que as fontes de

carbono e nitrogênio mais eficientes foram sacarose e peptona, respectivamente.

Comumente, as fontes de carbono e nitrogênio empregadas nos meios de produção

de EPS tem grande influência tanto no crescimento celular, como na biossíntese dos

EPS.

3.4 Glucanas

As glucanas são polímeros de glucose encontradas nas paredes celulares de

microrganismos (leveduras e fungos filamentosos), algas e cereais, como aveia e

cevada, ou ainda podem ser produzidas e excretadas (EPS) para o meio de cultivo

por algumas bactérias e fungos filamentosos (KAGIMURA et al., 2015b). Podem

diferenciar entre si em relação ao tamanho da cadeia, massa molecular, solubilidade

em água e tipo de ligação glicosídica, podendo apresentar-se na configuração α ou β

e estrutura linear ou ramificada (MORENO-MENDIETA et al., 2017).

30

-Glucanas de origem vegetal encontram-se geralmente sob a forma de

cadeias lineares unidas por ligações glicosídicas (1→4) com algumas ligações (1→3),

já as obtidas de algas e bactérias comumente apresentam cadeias lineares do tipo

(1→3), enquanto que as de origem fúngica e produzidas por líquens apresentam

ligações do tipo (1→3) e (1→6) (MORENO-MENDIETA et al., 2017), como

representado na figura 6.

Figura 6. Exemplos de tipos de conformações das β-glucanas, (a) β-1,3, (b) β-1,4 e (c) β-1,6. Fonte: Autoria própria.

As β-glucanas são carboidratos que predominam em fungos, as quais atuam

como agentes estruturais de parede celular e destacam-se na área biotecnológica por

atuarem como modificadores de respostas biológicas (MRB) (MORENO-MENDIETA

et al., 2017 ;KAGIMURA et al., 2015b). Tais macromoléculas têm apresentado

também propriedades antioxidantes (JIANG et al., 2016) e antimicrobianas (KHAN et

al., 2016), dentre várias outras.

Além disso, estas biomoléculas têm grande aplicabilidade em diferentes

setores industriais, por possuírem propriedades físicas como capacidade de

espessamento, estabilização, emulsificação e gelificação (KAGIMURA et al., 2015a).

SARTESHNIZI et al. (2014) estudaram a formulação de salsicha prebiótica

contendo amido, β-glucana de aveia e amido resistente, avaliando as interações entre

tais macromoléculas na salsicha. No embutido, a β-glucana exerceu efeito tecnológico

positivo em relação a dureza, cor e suculência.

No setor de cosméticos, as β-glucanas destacam-se por apresentarem

propriedades antioxidantes e anti-idade (KAGIMURA et al., 2015a) e têm ganhado

importância no mercado mundial por apresentarem importantes propriedades

biológicas. No estudo desenvolvido por LIU et al. (2016), foi avaliado o mecanismo de

31

ação de uma β-D-glucana extraída de aveia, sobre o controle dos níveis de glicose

sanguínea e efeito hepatogênico em camundongos. Estes autores, verificaram que tal

-glucana, em doses de médias a altas, demonstrou grande efeito hipoglicemiante em

ratos induzidos a hiperglicemia com estreptozotocina e nicotinamida.

HUSSAIN, RATHER, SURADKAR (2017) avaliaram uma β-D-glucana extraída

de aveia e irradiada com raios gama contra diferentes tipos de células cancerígenas

(células cancerígenas de cólon humano (Colo-205), células de câncer de mama ductal

humana, células tumorais epiteliais (T47D), células de adenocarcinoma de mama

humana (MCF7) e queratinócitos humanos). As β-D-glucanas irradiadas

apresentaram efeito antiproliferativo frente a linhagens celulares de câncer de Colo-

205 e MCF-7. Além disso, as β-D-glucanas irradiadas tiveram sua solubilidade e

capacidade de absorção de água aumentadas.

AOE et al. (2017), investigaram a adoção de uma dieta baseada na utilização

de cevada com elevado teor de β-glucana, a fim de verificar se esta reduziria a

obesidade e a gordura visceral em indivíduos japoneses. A ingestão de cevada com

alto teor de β-glucana levou a reduções significativas da gordura visceral, além da

redução do IMC (índice de massa corporal), peso corporal e circunferência da cintura;

indicando que a implementação de polissacarídeos como as β-glucanas na dieta,

podem contribuir para a prevenção da obesidade.

3.4.1 Lasiodiplodana

A lasiodiplodana é uma (1→6)-β-D-glucana extracelular produzida pelo

ascomiceto Lasiodiplodia theobromae MMPI, quando cultivado em meio submerso

rico em açúcares, especialmente glicose e sacarose (CUNHA et al., 2012).

Glucanas com configuração β(1→6) são as mais incomuns entre as β-

glucanas, sendo encontradas como constituintes de paredes celulares de fungos

filamentosos (CUNHA et al., 2012). Entretanto, a lasiodiplodana ((1→6)-β-D-glucana)

produzida pelo L. theobromae MMPI é uma glucana extracelular que pode ser

precipitada com etanol 95% (v/v) e facilmente recuperada do caldo de cultivo. O

processo de produção da lasiodiplodana é mais simples, mais econômico, e

32

ambientalmente menos agressivo quando comparado aos processos tradicionais de

extração de glucana de parede celular microbiana e vegetal.

Esta macromolécula tem demonstrado diferentes funções biológicas, dentre as

quais destacam-se atividades antioxidante, hipoglicemiante, hipocolesterolêmica e

anticarcinogênica (CUNHA et al., 2012; TÚRMINA et al., 2012; KAGIMURA et al.,

2015b).

Outra propriedade biológica da lasiodiplodana é seu efeito protetor contra

danos ao DNA induzido pela droga anticarcinogênica doxorrubicina, descrito

recentemente por MELLO et al. (2017). Estes autores investigaram os efeitos

genotóxicos da lasiodiplodana, sua potencial capacidade protetora contra danos ao

DNA e seu impacto na expressão de genes associados aos danos e as vias de

resposta inflamatória. Foi verificado que a lasiodiplodana não induziu distúrbios na

estabilidade do DNA e foi capaz de reduzir significativamente os danos ao DNA e o

desenvolvimento de processos inflamatórios. Além disso, TÚRMINA et al. (2012),

avaliaram os efeitos toxicológicos do tratamento sub-crônico de camundongos de

ambos os gêneros, com lasiodiplodana (1→6)-β-D-glucana, por meio da avaliação dos

efeitos bioquímicos, hematológicos e histopatológicos. Tais autores descreveram que

houve redução significativa da glicemia (35%) no grupo dos camundongos machos; e

que o tratamento com a lasiodiplodana não promoveu alterações hematológicas e

histológicas que levassem a sinais de toxicidade nos animais, independente do

gênero.

3.5 Modificações químicas de polissacarídeos

Nem todos os polissacarídeos naturais demonstram propriedades biológicas.

Desta forma, derivatizações químicas na estrutura primária da macromolécula têm

sido uma importante ferramenta para potencializar e/ou criar funcionalidades

biológicas (LI, DAI, SHAH, 2017; LI et al., 2016). Estas atividades estão diretamente

relacionadas à estrutura molecular do polissacarídeo, incluindo a composição

monomérica, ligação glicosídica da cadeia principal, grau de ramificação, grau de

substituição, conformação espacial das cadeias e solubilidade da biomolécula (MA et

al., 2012).

33

Modificações químicas de polissacarídeos para obtenção de derivados com

atributos funcionais desejáveis, têm ampliado suas áreas de aplicações e valor

comercial, e têm atraído cada vez mais a atenção de pesquisadores. As modificações

químicas baseiam-se em reações de substituição nos grupos hidroxilas, presentes nas

unidades monoméricas do biopolímero. Essas substituições, comumente envolvem a

inclusão de grupos iônicos como grupos sulfônicos (O-SO3H) na sulfatação,

carboximetílicos (+CH2COOH) na carboximetilação, fosfato (O-PO3H2) na fosforilação,

acetila (CH3COO-) na acetilação, grupos HSeO3- na selenização e grupos alquila

(CnH2n+1) na alquilação (KAGIMURA et al., 2015a; JI et al., 2013; LI et al., 2016),

conforme mostra a figura 7.

Figura 7. Representação estrutural de β-glucanas modificadas por: (a) sulfatação, (b) carboximetilação, (c) fosforilação, (d) acetilação, (e) selenização e (f) alquilação Fonte: Autoria própria.

As principais atividades biológicas reportadas na literatura, em relação a

sulfatação (Figura 7a) de polissacarídeos incluem as atividades anticoagulante

(VASCONCELOS et al., 2013), antiviral (TONG et al., 2010) e antimicrobiana (ZHANG

et al., 2016). Já em relação a carboximetilação (Figura 7b) têm sido descrito que tal

derivatização química contribui para o aumento da solubilidade e potencialização da

atividade antioxidante (KAGIMURA et al., 2015b; WANG et al., 2016). A fosforilação

(Figura 7c) contribui para a potencialização da capacidade antitumoral, aumento da

34

solubilidade e atividade antioxidante (YE et al., 2013; DENG et al., 2015). A

modificação por acetilação (Figura 7d) tem a capacidade de melhorar a capacidade

antioxidante de alguns polissacarídeos (SONG et al., 2013). A selenização (Figura 7e)

auxilia na melhora da atividade imunológica (QIN et al., 2013) e a alquilação (Figura

7f) demostra potencializar atividades antimicrobianas (XIE et al., 2002).

3.5.1 Modificação química por sulfatação

Polissacarídeos sulfatados podem ser naturalmente encontrados como

componente de parede celular de algas marinhas, ou obtidos por reações de

derivatização química (KRICHEN et al., 2015; PEASURA et al., 2015; SUN et al.,

2016). A sulfatação (Figura 8) consiste em uma substituição nucleofílica nos grupos

hidroxilas por grupamentos sulfatos (O-SO3H) e tem sido realizada em polissacarídeos

como glucanas, pectinas e quitosanas (WANG et al., 2015; LI, DAI, SHAH, 2017).

Figura 8. Representação estrutural de uma glucana sulfatada no carbono 3. Fonte: Autoria própria.

Na sulfatação utiliza-se um solvente orgânico e um agente sulfatante, sendo

empregados como agentes sulfatantes o ácido sulfúrico, trióxido de enxofre-piridina,

ácido clorossulfônico-piridina ou trióxido de enxofre-dimetilacetamida e

dimetilsulfóxido (DMSO), a dimetilformamida e formamida tem sido utilizadas como

solventes (LU et al., 2008). A eficiência da reação, ou seja, o número de hidroxilas do

polissacarídeo substituídas por grupos sulfonatos é avaliada pelo grau de substituição

(DS), o qual é influenciado principalmente por parâmetros como temperatura, tempo

35

de reação, concentração do agente derivatizante e proporção entre agente sulfatante

e solvente orgânico (LU et al., 2008; LI, DAI, SHAH, 2017).

A sulfatação comumente é feita pela solubilização ou suspensão do

polissacarídeo em dimetilsulfóxido (DMSO), formamida ou dimetilformamida, sendo

adicionando na sequência o catalisador, geralmente piridina, e então, o agente

sulfatante. O catalisador e o agente sulfatante podem ser adicionados separadamente

ou em conjunto, formando um complexo catalisador - agente sulfatante (ZHANG et al.,

2011; VASCONCELOS et al., 2013). A reação é então neutralizada, com bicarbonato

de sódio ou hidróxido de sódio e a mistura reacional é submetida a intensa diálise para

pré-purificação e seleção de massa molecular desejada (LI; DAI; SHAH, 2017).

O grau de substituição (DS) que representa o número de sítios (hidroxilas)

substituídos por unidade de monômero do polímero sulfatado é avaliado pela

determinação do conteúdo de enxofre inserido na macromolécula, sendo comumente

empregado o método cloreto de bário-gelatina ou avaliação instrumental por análise

elementar (VASCONCELOS et al., 2013; WAN-MOHTAR et al., 2016).

3.5.2 Atividades biológicas relacionadas à sulfatação

A sulfatação tem sido amplamente utilizada para potencializar propriedades

biológicas, principalmente, as propriedades anticoagulante, antiviral, antitrombótica e

antimicrobiana (VASCONCELOS et al., 2013; ZHANG et al., 2016).

BUDDANA, VARANASI, SHETTY (2015) analisaram as atividades biológicas

de uma α-(1→3)-glucana extraída de Streptococcus mutans e derivatizada por

sulfatação. Os autores verificaram que a amostra derivatizada com grau de

substituição (DS) de 1,19, apresentou aumento nas atividades biológicas, incluindo

maior efeito antimicrobiano frente a bactérias Gram negativas como Pseudomonas

aeruginosa MTCC 6458, Stenotrophomonas mutans MTCC 497 e Escherichia coli

MTCC 1680. Além disso, também verificaram atividade anti-inflamatória e fibrinolítica

na glucana sulfatada.

LI e SHAH (2014) avaliaram os efeitos antimicrobianos e antioxidantes de

polissacarídeos obtidos de Streptococcus thermophilus e Pleurotus eryngii após

sulfatação com DS de 0,31 e 0,69, respectivamente. Tais autores reportaram que a

sulfatação potencializou a atividade antioxidante, a qual foi avaliada por diferentes

36

protocolos (DPPH, superóxido, radical hidroxila e FRAP). Similarmente após a

sulfatação os polissacarídeos demonstraram atividade inibitória contra Escherichia

coli, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes.

Em relação à atividade antimicrobiana, o mecanismo de ação de

polissacarídeos ainda não está claro, entretanto HE et al. (2010) propôs que estas

biomoléculas promovem o rompimento da parede celular e da membrana

citoplasmática, levando ao extravasamento de moléculas essenciais, além de causar

decomposição do DNA do microrganismo (Figura 9). É importante destacar que

diferentes substâncias antimicrobianas podem atuar em diferentes alvos da estrutura

celular, como na parede celular, síntese de DNA e RNA, síntese de folato, membrana

celular e síntese de proteínas. Já o mecanismo de resistência das células a agentes

antimicrobianos pode ocorrer, por exemplo, por efluxo e inativação de enzimas,

conforme demostrado no esquema criado por LEWIS (2013) e representado na figura

9.

Figura 9. Representação esquemática dos diferentes alvos das substâncias antimicrobianas na estrutura celular e mecanismos de resistência. Fonte: Adaptado de LEWIS, 2013.

VASCONCELOS et al. (2013), modificaram quimicamente por sulfonação, uma

(1→6)-β-D-glucana, produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMRL. Os

37

autores obtiveram derivado (glucana sulfonada) com DS de 0,95 e verificaram que o

polissacarídeo exibiu atividade anticoagulante após a sulfonação.

LIANG et al. (2018) descreveram um polissacarídeo sulfatado com

características anticoagulantes similares as das heparinas (Figura 10), atuando

através de cargas negativas de grupos sulfatos, que neutralizam os resíduos de

aminoácidos carregados positivamente por ligações eletrostáticas à antitrombina,

melhorando assim a atividade anticoagulante, como ilustrado por POMIN (2012) no

esquema apresentado na figura 11.

Figura 10. Estrutura química da heparina. Fonte: Autoria própria.

38

Figura 11. Representação esquemática do mecanismo de ação anticoagulante de polissacarídeos sulfatados. Fonte: Adaptado de POMIN (2012).

Em relação a capacidade antiviral, estudos desenvolvidos por TONG et al.

(2010) avaliaram a atividade antiviral de uma α-D-glucana sulfonada frente a infecção

do vírus da dengue sorotipo 2 (DV2), incluindo a infecção inicial e a replicação

intracelular. Os resultados revelaram que a glucana sulfatada exerceu efeito inibitório

potente sobre o DV2, através da interferência entre a interação do vírus com as células

alvo. Da mesma forma, MURRY et al. (2014) avaliaram os inibidores químicos via

sulfatação contra o vírus HIV-1. Neste estudo, os autores verificaram que esses tipos

de inibidores bloqueiam eficientemente a iniciação da transcrição do vírus, durante a

reativação da latência.

SUN et al. (2009), estudaram a atividade antitumoral após sulfatar a glucana

((1→3)-β-D-glucana) extraída de corpos de frutificação do basidiomiceto Russula

virescens. Tais autores descreveram que todos os derivados sulfatados (um total de

cinco derivados) exibiram atividade antitumoral aprimorada contra Sarcoma 180. Além

disso, este estudo revelou que os derivados apresentaram toxicidade menor que o 5-

Fu (agente anticancerígeno conhecido), atuando apenas nas células doentes e não

nas células saudáveis, estimulando assim o mecanismo de resposta imune do

organismo.

39

Como descrito por SHI (2016) os polissacarídeos atuam ativando o sistema

imunológico de um organismo, ou seja, promovendo a maturação, diferenciação e

reprodução de três tipos de células: os linfócitos, macrófagos e as células NK (Natural

Killer), porém, o mecanismo de ação da atividade antitumoral por estas células ainda

não está completamente esclarecido.

3.6 Potencial antioxidante

Os antioxidantes são moléculas capazes de diminuir ou prevenir a oxidação de

outras moléculas e quando atuam em sistemas biológicos, evitam o estresse oxidativo

que causam danos celulares ao organismo e podem levar a doenças cardiovasculares

e inflamatórias (BOROSKI et al., 2015).

O aumento na busca de antioxidantes naturais, tem crescido em todo mundo

em função da toxicidade dos antioxidantes sintéticos, especialmente quando utilizados

em grandes quantidades. Além disso, antioxidantes naturais são capazes de fornecer

diversos outros efeitos benéficos à saúde devido a outras propriedades biológicas

presentes (BOROSKI et al., 2015).

Em estudos científicos é importante conduzir diferentes ensaios para a

avaliação da atividade antioxidante, a fim de avaliar adequadamente o potencial de

remoção de substâncias radicalares e potencial redutor. Cada protocolo de avaliação

de atividade antioxidante tem suas especificidades e a determinação da capacidade

antioxidante de uma molécula, pode ser feita por métodos in vivo e in vitro.

Neste estudo, foram abordadas cinco metodologias in vitro para determinação

do potencial antioxidante da lasiodiplodana nativa (LAS-N) e dos derivados sulfatados

(LAS-S). As metodologias empregadas foram: determinação do poder de redução do

íon férrico (FRAP), sequestro do radical hidroxila, captura do radical DPPH, eliminação

de peróxido de hidrogênio (H2O2) e captura do radical ABTS, cujos fundamentos

metodológicos são descritos a seguir.

3.6.1 Poder de redução do íon férrico (FRAP)

Este método de verificação do potencial antioxidante utiliza o complexo férrico

de 2,4,6-tripiridil-1,3,5-triazina (Fe3+ - TPTZ), na presença de uma substância

40

antioxidante redutora e em meio ácido. O complexo recebe um elétron e é reduzido a

(Fe2+ - TPTZ), como ilustrado na figura 12. O complexo (Fe2+ - TPTZ) apresenta

intensa coloração azul a qual é lida em 593 nm (BOROSKI et al., 2015; LI, DAI, SHAH,

2017).

Figura 12. Reação de oxirredução do radical livre TPTZ durante avalição antioxidante (FRAP). Fonte: Adaptado de LI, DAI, SHAH, 2017.

3.6.2 Sequestro do radical hidroxila

Nesta metodologia empregada, é determinada a capacidade que uma amostra

possui de sequestrar os radicais hidroxilas que são gerados na Reação Fenton, entre

sulfato ferroso (FeSO4) e peróxido de hidrogênio (H2O2), como representado na

equação (1).

𝑭𝒆𝟐+ + 𝑯𝟐𝑶𝟐 → 𝑭𝒆𝟑+ + °𝑶𝑯 + 𝑶𝑯− (Equação 1)

Os antioxidantes podem ser capazes de prevenir a formação de radicais

hidroxila por meio da inativação de íons metálicos livres por quelação ou pela

conversão de H2O2 em compostos inofensivos, como água e oxigênio molecular (LI,

DAI, SHAH, 2017). Os radicais hidroxilas que não são sequestrados participam da

reação de hidroxilação do salicilato de sódio, também presente neste procedimento,

desta forma, quanto maior a capacidade antioxidante da amostra, menos salicilato

hidroxilado estará presente no meio (Figura 13).

41

Figura 13. Reação de hidroxilação do salicilato de sódio. Fonte: Adaptado de SAVI, 2018.

3.6.3 Captura do radical DPPH

A atividade de capturar do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) esta

baseada na capacidade da substância antioxidante de transferir elétrons/hidrogênio

para estabilizar o radical livre (DPPH). Na estrutura do DPPH, o átomo de nitrogênio

ligado diretamente ao anel picrilhidrazina apresenta um elétron desemparelhado,

como demonstrado na figura 14 (BOROSKI et al., 2015). Na reação de oxidação e

redução entre o DPPH e a espécie antioxidante, este elétron desemparelhado se

emparelha com o elétron cedido por um radical hidrogênio fornecido por um composto

antioxidante. Esta reação apresenta absorção máxima em 517 nm, no qual o DPPH

após receber o átomo de hidrogênio proveniente da espécie antioxidante passa da

coloração violeta para amarelada (BOROSKI et al., 2015; LI, DAI, SHAH, 2017).

Figura 14. Reação de oxirredução do radical livre DPPH durante avalição antioxidante de DPPH. Fonte: Adaptado de LI DAI, SHAH (2017).

42

É interessante ressaltar que a acessibilidade estérica do DPPH é um fator de

limitação da reação, de forma que moléculas maiores apresentam menor acesso ao

sítio ativo do radical, do que aquelas menores, apresentando dessa forma diferença

na capacidade antioxidante nestas moléculas.

3.6.4 Captura do radical ABTS

A metodologia de captura do ABTS (ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-

sulfônico) (Figura 15), é baseada na capacidade da substância antioxidante de

estabilizar o radical cátion ABTS presente na solução, que volta à forma de composto

neutro ABTS, através de uma reação de oxidação. Este deslocamento de equilíbrio

entre essas duas formas do ABTS, ocasiona a descoloração da solução verde escura,

que vai ficando mais clara à medida que o ABTS vai sendo convertido em sua forma

neutra, ocasionando dessa forma a diminuição da absorbância em 734 nm (BOROSKI

et al., 2015).

Figura 15. Reação de oxirredução do radical livre ABTS durante avalição antioxidante de ABTS. Fonte: Adaptado de BOROSKI et al. (2015).

3.7 Estresse oxidativo

O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a geração de ROS

(espécies reativas de oxigênio), RNS (espécies reativas de nitrogênio) ou

antioxidantes celulares, que podem causar danos à membranas celulares, proteínas,

lipídios, carboidratos e à ácidos nucleicos (CASTRO et al., 2008; CHIARELLO et al.,

2018).

43

Tais estruturas oxidantes as quais constituem os denominados ROS e RNS

(superóxido, radicais hidroxila, peróxido de hidrogênio e óxido cítrico) fazem parte do

metabolismo celular, ocorrendo principalmente nas mitocôndrias como produto de

reações enzimáticas da cadeia respiratória e da fagocitose, e também em reações

não enzimáticas como aquelas que envolvem oxigênio e compostos orgânicos,

(CHIARELLO et al., 2018). Dessa forma o processo de estresse oxidativo tem sido

relacionado ao processo natural de envelhecimento celular e com doenças

neurodegenerativas como o Alzheimer, diabetes, aterosclerose, doenças

inflamatórias e câncer (CHEIGNON et al., 2018).

Recentemente células de leveduras vêm sendo utilizadas como modelo

biológico para estudos de mecanismos moleculares de resistência ao estresse

oxidativo, por apresentarem algumas semelhanças com células de mamíferos, como

a síntese de algumas proteínas (COSTA, MORADAS-FERREIRA, 2001;

SUBHASWARAJ et al., 2017). Muitos genes que codificam proteínas mitocondriais

são altamente conservados entre eucariotos, o que possibilita o uso deste

microrganismo como um modelo para estudos fisiológicos de proteína a nível

mitocondrial (KRUFT et al., 2001).

Leveduras podem crescer tanto em condições anaeróbicas como aeróbicas

sendo, portanto, expostas a espécies reativas de oxigênio geradas como subprodutos

do metabolismo celular. A principal fonte de espécies reativas de oxigênio é a cadeia

respiratória mitocondrial, que é responsável por 85 a 90% do oxigênio consumido nas

células. Em condições fisiológicas normais, os danos celulares são evitados por

mecanismos de defesa que neutralizam as espécies reativas de oxigênio. Entretanto,

em condições específicas de estresse, os níveis de ROS e a capacidade antioxidante

das células são desequilibrados, podendo resultar na diminuição dos antioxidantes

e/ou aumento na produção de ROS. Neste contexto, o acúmulo de moléculas

oxidadas são associadas à morte celular (COSTA, MORADAS-FERREIRA, 2001).

Células de levedura podem detectar o estresse oxidativo, sendo capazes de

construir uma resposta a nível molecular envolvendo a indução de antioxidantes

primários e secundários. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um sistema

biológico ideal para ser estudado como modelo na avaliação de vias de desintoxicação

celular, devido à facilidade de manipulação bioquímica e genética. De fato, grande

número de genes que medeiam a resistência a xenobióticos, bem como vias

44

metabólicas, foram identificados em células de leveduras (COSTA, MORADAS-

FERREIRA, 2001; CASTRO et al., 2007; SUBHASWARAJ et al., 2017).

Glutationas tranferases (GST) compreende uma família de isoenzimas

metabólicas de fase II que desempenham um papel crucial na proteção de células

contra xenobióticos, catalisando a conjugação da forma reduzida de glutationa à

substratos xenobióticos. Nos mamíferos as GST estão amplamente distribuídas

dentro das células e classificadas como citosólica, mitocondriais e associada à

membrana proteínas.

Similarmente como nos mamíferos, nas células de S. cerevisiae duas

glutationas transferases (Gtt1 e Gtt2) já foram identificadas (CASTRO et al., 2008).

Mais recentemente microrganismos como leveduras têm sido empregadas como

modelos biológicos em ensaios para a avalição dos efeitos tóxicos de diferentes

substâncias com potencial de promoção de estresse oxidativo. Em especial leveduras

mutantes do gênero S. cerevisiae, deficientes em enzimas envolvidas em mecanismos

antioxidantes endógenos são empregadas em tais estudos (SUBHASWARAJ et al.,

2017; CHEIGNON et al., 2018).

As células de levedura podem crescer na presença e ausência de oxigênio e

esse recurso pode ser utilizado para avaliar o papel do ciclo redox na toxicidade de

determinada substância (RODRIGUEZ et al., 2004). KERDSOMBOON et al. (2016)

avaliaram a ação protetora de um extrato solúvel de folha de Moringa oleifera contra

a toxicidade do cádmio, utilizando como modelo biológico cepas de S. cerevisiae. Os

autores verificaram que este extrato exibiu um efeito protetor contra o estresse

oxidativo induzido por cádmio e H2O2 através da redução de espécies reativas

intracelulares de oxigênio.

BAYLIAK e LUSHCHAK (2011), estudaram o efeito do extrato aquoso da raiz

de Rhodiola rosea sobre o tempo de vida e atividade de enzimas antioxidantes na

levedura S. cerevisiae. Tais autores verificaram que a suplementação do meio de

crescimento com extrato de R. rosea diminuiu a sobrevivência de células na fase

exponencial sob estresse oxidativo induzido por H2O2, mas aumentou a viabilidade e

o sucesso reprodutivo das células na fase estacionária de crescimento. Dessa forma,

os resultados encontrados sugeriram que R. rosea atua como um estressor para as

células de S. cerevisiae, o que sensibiliza as células de levedura ao estresse oxidativo

na fase exponencial, mas induz a adaptação em células em fase estacionária,

45

demonstrando o efeito positivo na sobrevivência das leveduras sem ativação das

principais enzimas antioxidantes.

46

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Fluxograma das atividades desenvolvidas

Nas figuras 16 e 17 estão descritos os fluxogramas esquemáticos das

atividades realizadas.

Figura 16. Fluxograma da produção biotecnológica da lasiodiplodana nativa e do processo de derivatização química por sulfatação Fonte: Autoria própria.

47

Figura 17. Fluxograma das caracterizações estruturais e biológicas realizadas nas amostras. Fonte: Autoria própria.

4.2 Produção do exopolissacarídeo lasiodiplodana e derivatização química

4.2.1 Caracterização macro e micro-morfológica da cepa Lasiodiplodia theobromae

MMPI

Neste trabalho foi utilizado o fungo ascomiceto Lasiodiplodia theobromae MMPI

isolado de fruta do conde (Annona squamosa). O fungo foi conservado em meio ágar

sabouraud com cloranfenicol a 4 °C por repiques periódicos.

Para avaliação morfológica da cultura fúngica, foram conduzidos cultivos em

placas de Petri em meio PDA com cloranfenicol (cultivo superficial) e também

microcultivo em lâmina usando meio PDA com cloranfenicol.

No cultivo superficial, uma porção de micélio (cultura estoque) do fungo foi

repicada para placas de Petri contendo meio PDA cloranfenicol, as quais foram

incubadas em estufa bacteriológica à 28 °C por 4 dias para ativação da cultura. Na

sequência, novo repique foi feito para meio PDA cloranfenicol e então as placas foram

incubadas por 7 dias à 28 °C.

No microcultivo, duas lâminas esterilizadas foram sobrepostas em forma de

cruz e dispostas em placa de Petri contendo um chumaço de algodão umidificado para

manutenção da umidade (Figura 18). O fungo foi inoculado em uma gota de ágar PDA

cloranfenicol sobre a lâmina, a qual foi coberta com uma lamínula, e então a placa foi

48

fechada assepticamente e incubada à 28 °C por 7 dias. Após este período, a lamínula

foi cuidadosamente retirada com auxílio de uma pinça, sendo então gotejado corante

azul de metileno 1% e examinada em microscópio ótico modelo (Bioval, Brasil).

Figura 18. Sistema de microcultivo fúngico em lâmina. Fonte: Autoria própria.

4.2.2 Preparo do inóculo para produção de lasiodiplodana

Uma porção de micélio fúngico foi transferido assepticamente para placas de

Petri contendo ágar sabouraud com cloranfenicol. As placas foram incubadas a 28 °C

por 72 horas em estufa bacteriológica. Em seguida, o fungo foi repicado para frascos

Erlenmeyer contendo 100 mL de Meio de Sais Minerais de Vogel – VMSM (VOGUEL,

1956) e 5 g L-1 de glicose e incubados a 28 °C sob agitação de 150 rpm por 48 horas.

Esta pré-cultura foi centrifugada para recuperação do micélio fúngico e então, os

pellets de biomassa foram homogeneizados e ressuspendidos em solução salina

0,9% para obtenção de um inóculo padronizado com leitura de absorção entre 0,4 e

0,5 a 400 nm (CUNHA et al., 2012).

4.2.3 Produção da lasiodiplodana em cultivo submerso

Lasiodiplodana foi produzida em frascos Erlenmeyer de 250 mL por cultivo

submerso conduzido em agitador orbital de bancada (shaker). O volume de trabalho

utilizado foi de 150 mL, sendo constituído por meio de fermentação (135 mL) à base

de sais minerais de Vogel (VOGUEL, 1956), 20 g L-1 de glicose e 15 mL de inóculo

49

padronizado. Os frascos foram incubados sob agitação de 150 rpm, a 28 °C por 72

horas (CUNHA et al., 2012).

Após 72 horas o meio de cultivo foi separado da biomassa celular por

centrifugação (1500 x g, 15 min.), e então a lasiodiplodana foi precipitada do caldo

com 3 volumes de etanol resfriado a 4 °C (overnight). A lasiodiplodana precipitada foi

ressolubilizada em água destilada (60 °C), e então submetida a intensa diálise contra

água destilada por aproximadamente cinco dias (com três trocas diárias de água),

como demonstrado na figura 19. Por fim, o material dialisado foi desidratado por

liofilização, nomeado como LAS-N e armazenado adequadamente para posteriores

análises de caracterização e sulfatação.

Figura 19. Representação esquemática do processo de produção e recuperação da lasiodiplodana nativa (LAS-N) Fonte: Autoria própria.

4.2.4 Derivatização química da lasiodiplodana por sulfatação

50

O reagente sulfatante foi preparado seguindo protocolo descrito por LU et al.

(2008) com pequena adaptação. Para a obtenção de derivados sulfatados com

diferentes graus de substituição, foram estudadas quatro proporções (1:4, 1:5, 1:6 e

1:10) entre o ácido clorossulfônico (CSA) e a piridina (Py), conforme demonstrado na

tabela 1. O reagente sulfatante foi preparado em balão de duas saídas (imerso em

banho de gelo) através do gotejamento do ácido clorossulfônico sobre a piridina

durante 40 minutos com agitação constante, conforme demonstrado na figura 20.

Figura 20. Processo de preparo do reagente sulfatante, utilizando ácido clorossulfônico e piridina. Fonte: Autoria própria.

Tabela 1. Proporções utilizadas de ácido clorossulfônico e piridina no preparo das amostras.

Amostra Ácido clorossulfônico (mL) Piridina (mL)

LAS-S1:4 6 (25% v/v)* 19

LAS-S1:5 5 (20% v/v)* 20

LAS-S1:6 4 (17% v/v)* 21

LAS-S1:10 2,5 (10% v/v)* 22,5

*Relação percentual CSA:Py. Fonte: Autoria própria.

A derivatização do exopolissacarídeo foi realizada seguindo protocolo descrito

por ZHANG et al. (2011), com pequena adaptação, utilizando balão de duas saídas.

Inicialmente 200 mg do EPS nativo liofilizado foi solubilizado em 20 mL de formamida,

51

sob intensa agitação (agitador magnético) por 72 horas à temperatura ambiente. Em

seguida, foram adicionados, gota-a-gota, 20 mL do reagente sulfatante previamente

preparado, e então, a solução permaneceu sob agitação por 3 horas à temperatura

de 60 °C. A sulfatação foi interrompida pela neutralização do meio (pH entre 7 e 8)

com adição de solução NaOH (15% m v-1). A solução resultante foi extensivamente

dialisada contra água destilada, por seis dias, com várias trocas diárias de água

(Figura 21). Por fim, o produto dialisado foi submetido a liofilização e nomeado como

LAS-S.

Figura 21. Processo de sulfatação da lasiodiplodana. Fonte: Autoria própria.

4.3 Caracterização química da lasiodiplodana nativa e sulfatada

4.3.1 Determinação do grau de sulfatação (DS)

O grau de substituição por sulfatação da macromolécula foi determinado com

base na correlação entre os conteúdos de enxofre e carbono da amostra seguindo

protocolo descrito por DE MOURA NETO et al. (2011). O grau de sulfatação é definido

52

como o número médio de grupos sulfatos (O-SO3H) inseridos em cada unidade

monossacarídica da macromolécula lasiodiplodana. Os conteúdos de enxofre e

carbono presentes nas amostras de lasiodiplodana foram determinados em analisador

elementar CHNS/O 2400 série II (Perkin Elmer, USA), e o grau de substituição foi

estimado de acordo com equação 2.

𝑫𝑺 = (𝑺%

𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒂𝒕ô𝒎𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒐 𝑺⁄ )

(𝑪%𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒂𝒕ô𝒎𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒐 𝑪 𝒙 𝟔⁄ )

∴ 𝑫𝑺 = 𝟐, 𝟐𝟓 (𝑺%

𝑪%), (Equação 2)

Onde, S% e C% corresponde aos conteúdos percentuais de enxofre e de carbono

presentes na amostra, respectivamente. O número 6 corresponde ao número de

átomos de carbono por unidade monomérica.

4.3.2 Avaliação da solubilidade

Para avaliação da solubilidade em água, foi empregado o protocolo descrito por

WANG et al. (2012), com adaptações. As amostras de lasiodiplodana (10 mg) foram

suspensas em água destilada (10 mL) e agitadas por 24 horas à 25 °C. Em seguida,

foram centrifugadas a 1500 x g por 10 minutos. O sobrenadante então, foi coletado e

utilizado para quantificação de açúcares totais, sendo estes, diretamente relacionados

com a quantidade de amostra solúvel. A solubilidade em água foi expressa em

porcentagem de massa solúvel de EPS. A solubilidade em solução de DMSO 20%,

também foi avaliada seguindo protocolo similar ao empregado na avaliação da

hidrossolubilidade, apenas substituindo a água por solução de DMSO 20%

(GALEANE et al., 2017). A solubilidade em DMSO 20% foi realizado visando posterior

utilização nos ensaios de atividade biológica.

4.3.3 Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (IV-TF)

Os espectros de infravermelho das amostras de LAS-N e LAS-S foram obtidos

em espectrômetro Frontier (Perkin Elmer®, USA) na faixa espectral compreendida

entre 400 e 4000 cm-1, com resolução de 2 cm-1, número de acumulações de 16

varreduras para cada espectro, utilizando a técnica de disco de KBr.

53

4.3.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

As micrografias foram obtidas em microscópio eletrônico de varredura de

bancada TM3000 (Hitachi, USA) a partir das amostras liofilizadas de LAS-N e LAS-S.

Imagens com amplitudes de 300, 800 e 1200 x, foram adquiridas das amostras fixadas

em fita de carbono.

4.3.5 Análise Térmica

Amostras liofilizadas de LAS-N e LAS-S foram submetidas à Análise de

Termogravimetria Derivada (DTG), Análise Térmica Diferencial (DTA) e Análise

Termogravimétrica (TGA), realizadas em equipamento SDT Q600 TA (TA Instruments,

USA). A perda de massa foi acompanhada entre 25 °C e 800 °C, com taxa de

aquecimento de 10 °C min-1, em atmosfera de ar sintético com fluxo de 50 mL min-1.

4.3.6 Difração de raios-X (DRX)

Para obtenção dos difratogramas das amostras foi utilizado difratômetro

MiniFlex600 (Rigaku, USA), usando fonte de radiação de lâmpada de cobre

(CuKα=1,5418 Å), corrente de 15 mA, 40 kV de voltagem, faixa de varredura de 10° a

60° (2θ) em modo step scan ao passo de 0,05°/2 segundos.

4.4 Caracterização biológica da lasiodiplodana nativa e sulfatada

4.4.1 Determinação do potencial antimicrobiano

O potencial antimicrobiano foi determinado conforme procedimento descrito por

KRICHEN et al., (2015). Os ensaios de atividade antimicrobiana foram conduzidos em

placas de Elisa com 96 poços. Em cada cavidade foram adicionados 100 µL da

amostra (LAS-N e LAS-S) nas concentrações de 0,26; 0,20; 0,15; 0,10 e 0,05 mg mL-

1 juntamente com 100 µL de caldo Mueller Hinton (bactérias) ou caldo Sabouraud com

cloranfenicol (leveduras) e 5 µL da suspensão microbiana previamente padronizada

54

em escala de McFarland 0,5 (1,5x108 UFC mL-1). Nestes ensaios, foram testadas

quatro cepas bacterianas (Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes

ATCC 19111, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Salmonella enterica

Typhimurium ATCC 0028) e duas cepas de leveduras (Candida albicans ATCC 10231

e Candida tropicalis 13803). As placas foram incubadas por 24 horas à 28 °C e 37 °C,

para leveduras e bactérias, respectivamente. Após incubação, foram adicionados em

cada cavidade, 20 µL do corante-reagente resazurina (0,01%) para verificação da

presença de células viáveis. Células viáveis são indicadas pelo aparecimento de

coloração rósea pela formação do composto intermediário rizorufina, oriundo da

reação de oxi-redução do corante resazurina (azul). Ou seja, o desenvolvimento de

coloração rósea no meio indica presença de células viáveis e a ausência indica

inibição celular. Após duas horas em repouso, a primeira leitura foi realizada, na qual

foi verificada a inibição dos microrganismos testados. O material dos poços que

apresentaram resultados positivos, ou seja, inibição dos microrganismos

(permanência da coloração azul do meio), foram repicados para placas de Petri

contendo ágar BHI (bactérias) ou ágar sabouraud com cloranfenicol (leveduras), as

quais foram incubadas em estufa bacteriológica à 28 °C (leveduras) ou 37 °C

(bactérias) por 24 horas, para verificação da atividade bactericida ou fungicida da

amostra. Como controles positivos, foram utilizados os antimicrobianos tetraciclina e

fluconazol para as bactérias e leveduras, respectivamente. Água peptonada 0,1%

esterilizada foi utilizada como controle negativo.

4.4.2 Atividade antioxidante

O potencial antioxidante das amostras foi avaliado por diferentes protocolos in

vitro, sendo analisado o poder de redução do íon férrico pelo método FRAP, a

capacidade de sequestro do radical OH e a capacidade de eliminação dos radicais

DPPH e ABTS.

4.4.2.1 Poder de redução do íon férrico (FRAP)

Esta análise foi baseada nos protocolos descritos por RUFINO et al., (2007) e

WOOTTON-BEARD, MORAN e RYAN (2011). No preparo do reagente FRAP foram

misturados 25 mL de solução tampão acetato de sódio (300 mmol L-1) pH 3,6, 2,5 mL

de solução TPTZ (10 mmol L-1) dissolvido em HCl 40 mmol L-1 e 2,5 mL de solução

55

de cloreto férrico (20 mmol L-1). O reagente foi armazenado por 15 minutos a 37 °C

antes do uso. Para determinação do potencial antioxidante FRAP, 90 µL da amostra

nas concentrações de 0,10, 0,18 e 0,26 mg mL-1 foram misturados com 270 µL de

água destilada e 2,7 mL de solução FRAP e esta solução foi armazenada na ausência

de luz por 30 minutos a 37 °C e então procedida a leitura a 595 nm. Solução FRAP foi

utilizada como branco. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados

expressos em µmol FeSO4.7H2O através de correlação com curva de calibração de

sulfato ferroso (0,2 - 2,0 mmol L-1).

4.4.2.2 Sequestro do radical hidroxila

O potencial de sequestro de OH• foi avaliado com base no protocolo descrito

por LIU et al., (2010). Mistura reacional (2 mL) contendo 0,5 mL de FeSO4 (1,5 mmol

L-1), 0,35 mL de H2O2 (6 mmol L-1), 0,15 mL de salicilato de sódio (20 mmol L-1) e 1

mL da amostra em diferentes concentrações (0,10, 0,18 e 0,26 mg mL-1) foi obtida.

Ácido ascórbico foi utilizado como controle positivo. Após incubação por 1 hora a 37

°C as leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a 562 nm. As

análises foram realizadas em triplicata e o percentual de sequestro do radical hidroxila

foi determinado, segundo equação 3.

% 𝒅𝒆 𝑹𝒆𝒎𝒐çã𝒐 𝒅𝒆 𝑶𝑯 = [𝟏 −(𝑨𝟏−𝑨𝟐)

𝑨𝟎] 𝒙𝟏𝟎𝟎% (Equação 3)

Onde, A0 corresponde a absorbância do controle, A1 a absorbância da amostra ou

ácido ascórbico e A2 a absorbância do branco com salicilato de sódio.

4.4.2.3 Captura do radical DPPH

O potencial de captura do radical DPPH foi analisado seguindo metodologia

descrita por LOCATELLI et al., (2009), com adaptações. Em tubo de ensaio foram

misturados 500 µL da amostra (Aamostra) nas concentrações de 0,10, 0,18 ou 0,26 mg

mL-1, 3 mL de etanol P.A e 300 µL de solução etanólica de DPPH (0,5 mmol L-1). As

leituras espectrofotométricas foram obtidas em 517 nm após 80 minutos de reação. O

aparelho foi zerado com solução etanólica 80% e como controle (Acontrole) foi utilizado

a mesma mistura reacional apenas sendo substituído o volume da amostra por igual

56

volume de solução etanólica 80%. A porcentagem de atividade de captura do radical

hidroxila foi estimada segundo equação 4.

% 𝑨𝑨 = 𝟏𝟎𝟎 −(𝑨𝒂𝒎𝒐𝒔𝒕𝒓𝒂𝒙𝟏𝟎𝟎)

𝑨𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍𝒆 (Equação 4)

4.4.2.4 Captura do radical cátion ABTS

O potencial de captura do radical cátion ABTS foi determinado seguindo

metodologia descrita por RUFINO et al., (2007) e WOOTON-BEARD, MORAN e

RYAN (2007) com adaptações. Radical ABTS foi obtido pela mistura de 5 mL de

solução de ABTS (7 mmol L-1) e 88 µL da solução de persulfato de potássio (140 mmol

L-1) em tubo de ensaio, o qual foi mantido ao abrigo de luz em temperatura ambiente

durante 16 horas. Em seguida, foram diluídos 1 mL da solução ABTS em álcool etílico

até obtenção de absorbância de 0,7 em 734 nm. Em tubos de ensaio foram misturados

30 µL de amostra nas concentrações de 0,10, 0,18 e 0,26 mg mL-1 e 3 mL da solução

de ABTS diluída em etanol. Os tubos foram agitados e deixados ao abrigo luz por 6

minutos até leitura de absorbância em 734 nm. Como branco foi utilizado solução de

DMSO 20%. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em

mmol L-1 de Trolox equivalente mL-1 pela correlação com curva padrão de Trolox (0,1,

0,25, 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 mmol L-1).

4.4.3 Citotoxicidade sobre células de Saccharomyces cerevisiae

O potencial de citotoxicidade da lasiodiplodana nativa e sulfatada foi avaliada

em relação a capacidade de indução ao estresse oxidativo, em cepas de

Saccharomyces cerevisiae. Foram utilizadas as linhagens Saccharomyces cerevisiae

f.r bayanus (Fermol Perlage, AEB Biochemistry Latin American AS, Brazil) e leveduras

mutantes Saccharomyces cerevisiae (YIR038C∆GTT1, YLL060C∆GTT2 e

YSL101C∆GSH1).

As linhagens de S. cerevisiae YIR038C, YLL060C e YSL101C são mutantes

cujos genes GTT1 (Glutationa Transferase 1), GTT2 (Glutationa Transferase 2) e

GSH1 (Glutamato Cisteína Ligase) foram respectivamente interrompidos pelo gene

KanMX4 (Euroscarf, Frankfurt, Alemanha) e apresentam deficiência na enzima

57

Glutationa (GSH/GSSG). As cepas de levedura foram mantidas em meio YPD à 4 °C.

As cepas foram reativadas em caldo nutriente e repicadas para ágar YPD antes dos

ensaios.

O potencial de estresse oxidativo pelas amostras de lasiodiplodana nativa e

sulfatada foi avaliado com base nos protocolos descritos por CASTRO et al., (2008),

e SUBHASWARAJ et al., (2017) com adaptações. Os ensaios foram conduzidos em

placas de Elisa de 96 poços. Em cada cavidade foram adicionados 100 µL da amostra

de lasiodiplodana nativa ou sulfatada nas concentrações de 0,10; 0,20 ou 0,26 mg mL-

1, juntamente com 100 µL de caldo YPD e 20 µL da suspensão microbiana com

concentração padronizada em escala de McFarland 0,5 (1,5x108 UFC mL-1). As placas

foram incubadas por 24 horas a 28 °C; após incubação foram adicionados em cada

cavidade 20 µL do corante-reagente resazurina (0,01%) e deixadas em repouso por 2

horas para verificação da presença de células viáveis (coloração rósea).

O aparecimento de coloração azul nos poços das placas de Elisa indicavam

inatividade celular. Os meios de tais poços foram repicados para placas de Petri

contendo ágar YPD, as quais foram incubadas em estufa bacteriológica à 28 °C, para

comprovação da ausência de viabilidade celular (morte celular) ou apenas efeito

microbiostático das amostras sobre as leveduras avaliadas. Como controle positivo foi

utilizado menadiona, e água peptonada 0,1% esterilizada foi utilizada como controle

negativo.

58

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Aspectos morfológicos da cepa Lasiodiplodia theobromae MMPI

Conforme pode ser verificado nas figuras 22 A e 23A, após 7 dias de incubação

em meio PDA foi observado intenso crescimento micelial, tanto crescimento radial

quanto prolongamento aéreo das hifas, sendo toda placa recoberta pelo micélio

fúngico. Após 14 dias de incubação algumas mudanças macroscópicas podem ser

observadas (Figura 22 B) na cultura, incluindo redução do comprimento do micélio

aéreo e escurecimento do micélio vegetativo, destacando a coloração branca

acinzentada do micélio aéreo.

Figura 22. Cultivo do fungo L. theobromae MMPI em ágar PDA: 7 dias de incubação (A) e 14 dias de incubação (B). Fonte: Autoria própria.

O microcultivo do L. theobramae permitiu a visualização morfológica de suas

hifas (Figuras 23 C e D), sendo observados hifas hialinas septadas com poucas

ramificações. Não foram observados esporos fúngicos em tais condições de cultivo,

possivelmente em função de condições adequadas e não estressoras de cultivo.

59

Figura 23. Microscopia ótica do fungo L. theobromae MMPI: (A) micélio aéreo na superfície do meio PDA; (B) microcultivo em lâmina; (C) visualização das hifas com amplitudes de 40 x e (D) 1000 x. Fonte: Autoria própria.

5.2 Grau de sulfatação

A reação de sulfatação da lasiodiplodana pode ser dividida em três etapas. A

primeira etapa consiste na obtenção do reagente sulfatante, a partir da mistura do

agente doador dos grupos sulfatos (O-SO3H), ácido clorossulfônico, com o catalisador,

piridina.

Nesta reação a piridina atua como uma base de Lewis, sendo doadora de

elétrons. Quando a piridina entra em contato com o ácido clorossulfônico, a hidroxila

presente no ácido se desprende para o meio reacional, deixando o enxofre com

caráter positivo. O nitrogênio piridínico que possui dois elétrons desemparelhados, é

capaz de doar um de seus elétrons para o ácido, formando uma ligação e desta forma

originando o sal clorossulfônico piridino. Este sal apresenta uma coloração branca

cristalina e um alto ponto de fusão (175 °C) (TIDWELL; VIKAS; JAGADISH, 2017), o

que torna sua dissolução demorada e em alguns casos inviável.

A preparação do reagente sulfatante (CSA-catalisador) antes da reação de

derivatização (JINDAL et al., 2013; LIANG et al., 2018), pode contribuir para a

proteção da amostra, minimizando a possibilidade de hidrólise. Por outro lado,

protocolos de sulfatação mais agressivos onde o ácido clorossulfônico é gotejado

60

diretamente sobre amostra solubilizada e contendo o catalisador (MENDES et al.,

2009), pode levar a hidrólise parcial da amostra.

O segundo passo da sulfatação corresponde a reação entre o sal

clorossulfônico piridino e a amostra (lasiodiplodana nativa). Nesta etapa reacional

ocorre a retirada do hidrogênio de uma das hidroxilas da lasiodiplodana nativa e a

inserção do grupo sulfônico na macromolécula, o qual é oriundo do sal clorossulfônico

piridino, previamente formado. Paralelamente o catalisador piridina é liberado para o

meio reacional.

Na terceira e última etapa a mistura reacional é neutralizada com NaOH,

ocorrendo a formação do cloreto de sódio, ligação da hidroxila do álcali à

macromolécula e geração do produto sulfatado estável, como descrito na figura 26.

61

Figura 24. Mecanismo reacional da sulfatação da lasiodiplodana. Fonte: Autoria própria.

No presente estudo foram obtidos quatro derivados sulfatados em função das

diferentes proporções de ácido clorossulfônico e piridina empregadas na reação

(CSA:Py - 1:4, 1:5, 1:6 e 1:10). Na tabela 2 estão descritos os valores de DS estimados

em cada uma das amostras derivatizadas, bem como os conteúdos de carbono e

enxofre determinados por análise elementar e utilizados no cálculo descrito na

equação 2.

62

Tabela 2. Composição elementar (C e S) das amostras sulfatadas e seus respectivos graus de substituição.

Elemento Amostras

LAS-S1:4* LAS-S1:5* LAS-S1:6* LAS-S1:10*

Carbono 18,59 18,09 20,30 31,91

Enxofre 11,73 12,98 9,25 2,80

DS 1,42 1,61 1,02 0,15

*Proporção entre CSA:Py. Fonte: Autoria própria.

As condições de sulfatação promoveram a formação de amostras com

diferentes graus de substituição (1,42 - LAS-S1:4, 1,61 - LAS-S1:5, 1,02 - LAS-S1:6 e

0,15 - LAS-S1:10). Quando foram utilizadas as proporções 1:4 e 1:5 derivados com

maiores valores de DS (1,42 e 1,61, respectivamente) foram obtidos, e, parece haver

uma correlação entre o grau de substituição e a proporção reacional CSA:Py. De fato,

a proporção de agente derivatizante e solubilizante, temperatura e tempo de reação

são os principais fatores que afetam a eficiência de derivatização por este método (LU

et al., 2008; LI, DAI, SHAH, 2017).

O uso de maiores concentrações de CSA (LAS-S1:4 e LAS-S1:5) na mistura

reacional contribuiu para a obtenção de derivados com maior grau de substituição.

Entretanto, quando comparados os valores de DS das amostras LAS-S1:4 (25% v/v

de CSA) e LAS-S1:5 (20% v/v de CSA) houve pouca diferença entre os resultados,

sendo encontrado maior DS na amostra obtida com o uso de 20% v/v de CSA (LAS-

S1:4). Isto possivelmente pode ser explicado pela baixa solubilidade do sal

clorossulfônico piridino, o qual é obtido em maiores concentrações quando maiores

concentrações de CSA foram empregadas na derivatização. Neste contexto, testes

preliminares mostraram que o uso de concentrações de 28% v/v de CSA na mistura

derivatizante (CSA:Py) inviabilizou a sulfatação, uma vez que houve insolubilização e

cristalização do sal clorossulfônico piridino gerado.

O uso de diferentes concentrações de CSA na solução derivatizante (CSA:Py)

tem mostrado ser uma ferramenta para obtenção de polissacarídeos sulfatados com

diferentes graus de substituição. Polissacarídeos extraídos de Zizyphus jujuba

63

sulfatados com o uso de solução CSA:Py nas proporções de 1:2, 1:4, 1:6 e 1:8

originaram derivados sulfatados com DS variando de 0,36 a 2,30 (CAI et al., 2018).

Similarmente, XIE et al. (2016) derivatizaram por sulfatação polissacarídeo

extraído de Cyclocarya paliurus e verificaram que o aumento da proporção utilizada

de ácido clorossulfônico-piridina (1:1, 1:4, 1:6 e 1:8) possibilitou a obtenção de

derivados com maior DS (0,52, 0,33, 0,20 e 0,06).

O grau de substituição das amostras de lasiodiplodana foi estimado,

considerando que cada unidade monossacarídica da macromolécula possui três

hidroxilas livres, ou seja, é possível a obtenção de um DS máximo de três (DS= 3).

Foram obtidas eficiências de 47,33% (LAS-S1:4, DS: 1,42), 53,67% (LAS-S1:5,

DS:1,61), 34% (LAS-S1:6, DS: 1,02) e 5% (LAS-S1:10, DS:0,15).

Polissacarídeos sulfatados com DS superior a 0,8 têm sido destacados na

literatura científica como macromoléculas bioativas (VASCONCELOS; et al., 2013;

(ZHANG et al., 2010; LIANG et al., 2018). Neste sentido, é importante o

desenvolvimento de protocolos de sulfatação eficientes que promovam a obtenção de

derivados com elevados valores de DS.

5.3 Solubilidade dos derivados obtidos

Modificações estruturais em polímeros podem promover diversas alterações

em suas propriedades químicas, físico-químicas e biológicas. A inserção de

heteroátomos ou grupamentos químicos na estrutura dos polissacarídeos pode levar

a mudanças nas interações com a água ou outros solventes, podendo aumentar ou

diminuir sua solubilidade.

Neste trabalho, foram avaliadas a solubilidade da lasiodiplodana nativa e

sulfatada em água e DMSO 20% em temperatura ambiente e os resultados estão

descritos na tabela 3.

64

Tabela 3. Solubilidade das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatadas em água e DMSO 20%.

Amostra Solubilidade (%)

DS Água DMSO 20%

LAS-N - 6,14 ± 0,0003 8,72 ± 0,0066

LAS-S1:10 0,15 7,55 ± 0,0023 11,70 ± 0,017

LAS-S1:6 1,02 11,59 ± 0,0025 17,05 ± 0,0079

LAS-S1:4 1,42 8,03 ± 0,0032 10,42 ± 0,0047

LAS-1:5 1,61 15,35 ± 0,0073 26,50 ± 0,0046

Fonte: Autoria própria.

A lasiodiplodana apesar de conter grupamentos polares como hidroxilas,

apresenta baixa solubilidade em água. Isto pode ser explicado pela estrutura linear e

estado conformacional de tríplice-hélice da molécula (VASCONCELOS et al., 2008),

associada à ocorrência de diversas interações intramoleculares pelos grupos

hidroxilas, levando à formação de agregados macromoleculares o que dificulta sua

solvatação.

Conforme verificado na tabela 3, a amostra LAS-N apresentou solubilidade de

6,14% em água e de 8,72% em DMSO 20%. Similarmente, todas as amostras

sulfatadas apresentaram solubilidade em DMSO 20% um pouco superior do que a

verificada em água.

A sulfatação contribuiu para o aumento da solubilidade tanto em água quanto

em DMSO 20% e ocorreu aumento de solubilidade com o aumento do DS. A amostra

LAS-S1:10 (DS: 0,15), apresentou solubilidades de 7,55% e 11,7% em água e DMSO

20%, respectivamente. Quando o grau de substituição da macromolécula foi elevado

para 1,61 foram verificadas solubilidades de 15,35% em água e 26,50% em DMSO

20%.

A introdução de grupos químicos grandes e polares em macromoléculas

polissacarídicas pode contribuir para o aumento da solubilidade em água. A presença

de maior número de grupos sulfonatos, pode possivelmente contribuir para o

distanciamento das hidroxilas das macromoléculas em função do seu grande volume.

A presença de maior número de grupos sulfatos (O-SO3H) e o maior distanciamento

intramolecular pode levar ao surgimento de uma camada polar, o que favorece as

ligações de hidrogênio com a água, e consequentemente a solvatação. Por outro lado,

65

a menor solubilidade de derivados com baixo grau de sulfatação comparado com

derivados de maior DS, pode ser explicado pela possibilidade de ligações

intramoleculares pela ocorrência de interações entre o oxigênio do grupo sulfatos e

átomos de hidrogênio das hidroxilas não substituídas do anel de glicose.

5.4 Análises dos espectros de Infravermelho (IV-TF)

A análise de infravermelho permite obter informações fundamentais sobre as

estruturas de moléculas químicas e é uma técnica que baseia-se na absorção da

radiação no espectro do infravermelho pelas moléculas, as quais são excitadas para

atingir um estado de maior energia. No processo de absorção, as frequências de

radiação absorvidas são aquelas que equivalem as frequências vibracionais naturais

da molécula em questão. Esta energia absorvida serve para aumentar a amplitude

dos movimentos vibracionais das ligações na molécula, movimentos estes, que

podem ser de estiramento e dobramento das ligações na maioria das moléculas mais

covalentes (PAVIA et al., 2010).

A figura 25 mostra os espectros de infravermelho (normalizados) das amostras

de lasiodiplodana nativa (LAS-N) e sulfatadas (LAS-S).

Os espectros gerados entre 4000 e 400 cm-1, apresentaram sinais típicos de

polissacarídeos com bandas características de glucanas, como mostra a figura 25. A

banda larga de intensidade forte na região de 3400 cm-1 é atribuída a vibração de

estiramento O-H (PAVIA et al., 2010; BUDDANA, VARANASI, SHETTY, 2015;

KRICHEN et al., 2015), presente nas glucanas nativas e modificadas como hidroxilas

livres.

A banda em aproximadamente 2900 cm-1 é característica de estiramento C-H

sp3 (PAVIA et al., 2010; BUDDANA, VARANASI, SHETTY, 2015), presente em

polissacarídeos como as glucanas, que são constituídas principalmente por ligações

entre carbono e hidrogênio. A banda de média intensidade em 1600 cm-1 é atribuída

à vibração de estiramento do anel de glicose (XU et al., 2009).

Bandas de baixa intensidade entre 1400 e 1200 cm-1 indicam vibrações de

deformação de C-H e O-H, típicas de carboidratos (CALEGARI et al., 2017), as quais

podem apresentar pequenas variações de intensidade e número de onda em função

da natureza do polissacarídeo (CALEGARI et al., 2017). Além disso, há um sinal na

66

região 1060 cm-1 característico da vibração de alongamento C-O do anel piranose

presente na glicose (CALEGARI et al., 2017; LUNA et al., 2018). A absorção na região

880 cm-1 indica a configuração do tipo β neste polissacarídeo (CALEGARI et al., 2017;

WAN-MOHTAR et al., 2016) sendo enfraquecida nos derivados sulfatados.

Figura 25. Espectros de infravermelho da LAS-N, LAS-S1:10, LAS-S1:6, LAS-S1:4 e LAS-S1:5. Fonte: Autoria própria.

Nos espectros dos derivados sulfatados (LAS-S1:10, LAS-S1:6, LAS-S1:4 e

LAS-S1:5) surgem bandas características das ligações envolvendo o enxofre e grupos

sulfônicos, diferentemente das bandas verificadas no espectro da LAS-N, como

monstra a figura 26. Nesta figura são comparados os espectros da LAS-N e da

lasiodiplodana sulfatada de maior grau de substituição obtido (DS=1,61).

67

Figura 26. Sobreposição dos espectros de infravermelho da LAS-N e LAS-S1:5 (DS=1,61). Fonte: Autoria própria.

Para melhor visualização e comparação dos espectros de IV-TF da amostra de

lasiodiplodana nativa e sulfatada (LAS-S1:5, DS=1,61) apresentados na Figura 26,

foram feitas ampliações em regiões específicas, onde podem ser observadas

diferenças notórias entre as amostras nativa e sulfatada (Figura 27).

Figura 27. Ampliações nas regiões entre (A) 4000 e 2700 cm-1, (B) 1600 e 1100 cm-1 e (C) 1100 e 400 cm-1, comparando a LAS-N e a lasiodiplodana sulfatada (LAS-S1:5). Fonte: Autoria própria.

Na figura 27 (A), é possível verificar que na região entre 4000 e 2500 cm-1 a

banda característica de estiramento O-H diminui a intensidade após reação de

derivatização (KRICHEN et al., 2015). A redução de intensidade desta banda pode

68

ser atribuída a diferenças de absorção na região do infravermelho entre as hidroxilas

constituintes da lasiodiplodana e as hidroxilas presentes no grupamento sulfatos (O-

SO3H).

Após sulfatação há desaparecimento das bandas características de vibrações

de deformação de C-H e O-H (WAN-MOHTAR et al., 2016) verificadas em 1400 cm-1

na amostra LAS-N (Figura 27 B), indicando a ocorrência de uma mudança estrutural

na molécula, causada pela derivatização realizada.

Outro aspecto observado é o surgimento de uma banda na região de 1250 cm- 1

nas amostras sulfatadas (Figuras 25 e 27B), a qual é atribuída a vibração de

alongamento assimétrico (forte) S=O, associado à distribuição de grupos sulfonato na

molécula (ANAND et al., 2018). Na figura 27 também pode ser observado aumento na

intensidade da banda em 1250 cm-1 concomitante ao aumento do grau de substituição

da amostra.

Na região de 810 cm-1 é verificada banda correspondente à vibração simétrica

C-O-S, associado ao grupo C-O-SO3, o que comprova a sulfatação das amostras

(CALEGARI et al., 2017; VASCONCELOS et al., 2013). Maior intensidade desta

banda é verificada nas amostras com maiores graus de substituição, conforme pode

ser visto nas figuras 25 e 27 C.

Similarmente, CALEGARI et al., (2017), verificaram em amostras de

lasiodiplodana sulfatada com baixo DS (0,24) o surgimento de sinais característicos

de grupos sulfônicos, como as bandas na região de 1240 e 810 cm-1 correspondentes

a vibrações assimétricas (forte) S=O e vibração simétrica C-O-S, respectivamente.

LIU et al., (2017) produziram um derivado sulfatado com alto DS (1,6) a partir

da glucana extraída do basidiomiceto Phellinus ribis, utilizando formamida e ácido

clorosulfônico como agente sulfatante. Tais autores também confirmaram a sulfatação

da amostra pelas bandas características nas regiões em 1251 cm-1 (vibração

assimétrica S=O) e 808 cm-1 (simétrica das ligações C-O-S associada ao grupo C-O-

SO3).

5.5 Análise das imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV)

69

As micrografias das amostras de lasiodiplodana nativa e dos derivados

sulfatados estão apresentadas na figura 28, nas amplitudes de 300x, 800x e 1200x.

Figura 28. Micrografias das amostras LAS-N, LAS-S1:10, LAS-S1:6, LAS-S1:4 e LAS-S1:5, nas amplitudes de 300x, 800x e 1200x. Fonte: Autoria própria.

70

A microscopia eletrônica de varredura mostra que a lasiodiplodana nativa (LAS-

N) apresenta uma superfície desuniforme contendo dobras e bordas irregulares

(Figura 28, LAS-N A e B) e apresentando porções semelhantes a filmes finos

translúcidos com torções ao longo da extensão (Figura 28 LAS-N A e C).

Similarmente, THEIS et al., (2017) verificaram que amostras de lasiodiplodana nativa

apresentaram macroestrutura irregular lembrando placas com dobras e torções em

sua extensão.

Por outro lado, em estudo desenvolvido por KAGIMURA et al., (2015b), as

micrografias de amostras de lasiodiplodana nativa, evidenciaram a presença de

grânulos esféricos em toda a superfície das placas que compunham a macroestrutura

do polímero. Tal diferença pode ser justificada pela forma em que se deu o cultivo

submerso. KAGIMURA et al., (2015b) conduziu a fermentação em biorreator de

bancada com condições fermentativas diferentes daquelas utilizadas no presente

estudo e também por THEIS et al., (2017).

A sulfatação promoveu mudanças morfológicas na superfície do biopolímero

levando ao surgimento de estruturas fibrilares e heterogêneas ao longo da área

superficial, conforme monstra a figura 28. O grau de substituição (DS) parece

influenciar na morfologia superficial da molécula, tendo sido observado nas amostras

com os maiores DS (LAS-S1:4 e LAS-S1:5) maior quantidade de estruturas fibrilares

associada a porções similares a filmes finos e translúcidos. Por outro lado, nas

amostras com menores graus de substituição (LAS-S1:10 e LAS-S1:6) há um menor

número de estruturas fibrilares ao longo da área superficial. As diferenças

morfológicas entre as amostras com maiores DS comparadas com as de menores DS,

possivelmente estão associadas com a intensidade da reação de sulfatação, visto que

para maior sulfatação, maiores quantidades de ácido clorosulfônico no reagente

sulfatante são utilizadas.

CALEGARI et al., (2017), reportaram intensas mudanças na área superficial de

amostras de lasiodiplodana sulfonada com DS de 0,24, comparadas à amostra não

derivatizada. Similarmente, WANG et al., (2005), também relataram mudanças

morfológicas na superfície de uma (1→3)-β-D-glucana sulfatada com DS de 0,36,

observando rupturas na área superficial e o surgimento de fibras ao longo da sua

extensão.

71

5.6 Perfil térmico das amostras de lasiodiplodana

Os perfis térmicos das amostras nativa e sulfatadas estão descritos nas figuras

29 e 30, nas curvas termogravimétrica (TGA) e termogravimétrica derivada (DTG).

A LAS-N foi estável até 200 °C e apresentou três estágios de perda de massa

conforme pode ser verificado nas curvas de TGA, DTA e DTG (Figura 29). A primeira

perda de massa (12%) ocorreu até 122 °C, correspondendo a eliminação de água de

hidratação. O segundo estágio de perda de massa (83%) ocorreu entre 200 e 377 °C

(curva TGA) indicado por um pico exotérmico em 301 °C (curva DTA) e

correspondendo à decomposição térmica da amostra. O terceiro e último pico (perda

de massa 100%) situado na faixa entre 376 a 548 °C (curva TGA) com pico exotérmico

em 442 °C (curva DTA) é atribuído à decomposição final (carbonização) da amostra.

Figura 29. Perfil térmico da amostra de lasiodiplodana nativa (LAS-N), pelas curvas de DTA, DTG e TGA. Fonte: Autoria própria.

Os perfis térmicos das amostras sulfatadas estão apresentados na figura 30.

72

Figura 30. Curvas de DTA, DTG e TGA das amostras sulfatadas: (a) LAS-S1:10, DS de 0,15, (b) LAS-S1:6, DS de 1,02, (c) LAS-S1:4, DS de 1,42 e (d) LAS-S1:5 com DS de 1,61. Fonte: Autoria própria.

A sulfatação das amostras promoveu mudanças no perfil térmico da

lasiodiplodana. As amostras sulfatadas apresentaram quatro estágios de perda de

massa, ao passo que a amostra nativa apresentou três estágios. O primeiro estágio

de perda de massa (14%), típico de eliminação de água intracelular, ocorreu até 160

°C, sendo esta faixa superior à temperatura de eliminação de água da amostra não

sulfatada (até 122 °C). Tal fenômeno pode ser atribuído à redução da hidrofobicidade

da macromolécula após a introdução do grupamento sulfatos (O-SO3H) pela

sulfatação. De fato, este comportamento corrobora com o aumento da solubilidade em

água dos derivados em relação a amostra nativa.

O segundo estágio ocorreu entre 160 a 290 °C, com perdas de massa variando

de 44% (LAS-S1:10, DS=0,15) a 43% (LAS-S1:5, DS=1,61), sendo evidenciado por

um pico exotérmico (curva DTA) em 200 °C e atribuído à decomposição térmica das

amostras. O terceiro estágio de perda de massa (73%) ocorreu entre 290 a 460 °C,

correspondendo a decomposição oxidativa da amostra e evidenciado pelo pico

exotérmico (curva DTA) em 400 °C. O último estágio (87%), correspondendo a

73

decomposição final da amostra (carbonização) ocorreu entre 440 a 570 °C e foi

evidenciado pelo pico exotérmico em 500 °C (curva DTA).

De maneira geral a sulfatação da lasiodiplodana contribuiu para um pequeno

aumento na estabilidade térmica. Este comportamento é evidenciado pelo aumento

na faixa de temperatura correspondente a oxidação do biopolímero (de 377 °C para

460 °C), bem como aumento na temperatura final de carbonização da amostra (548

°C a 570 °C).

Estudos desenvolvidos por DE MOURA NETO et al. (2011), avaliaram o perfil

térmico de amostras de polissacarídeos extraídos de cajueiros e derivatizados por

sulfatação. Neste trabalho, os autores também observaram que a amostra permanecia

estável termicamente até aproximadamente 200 °C, e verificaram três estágios de

perda de massa.

ZHANG et al. (2016) avaliou o perfil térmico de um exopolissacarídeo

microbiano, produzido por Streptococcus thermophilus GST-6 e seu derivado

sulfatado (DS 0,26). Estes autores reportaram a presença de apenas dois estágios de

perda de massa e destacam uma pequena diminuição da estabilidade térmica da

amostra.

5.7 Análise por difração de raios-X (DRX)

O perfil difratográfico das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatada são

apresentados na figura 31.

74

Figura 31. Difratogramas das amostras de lasiodiplodana nativa (LAS-N), e das sulfatadas (LAS-S1:5, LAS-S1:4, LAS-S1:6 e LAS-S1:10. Fonte: Autoria própria.

As amostras de lasiodiplodana nativa e derivatizada apresentam um perfil

difratográfico de amostra com característica predominantemente amorfa, conforme é

verificado na figura 31. Entretanto, dois picos afiados em 2θ com valores próximos de

21° e 23° são observados nas amostras de lasiodiplodana nativa e derivatizada com

menor grau de sulfatação (LAS-S1:10, DS=0,15), os quais podem estar associados a

uma estrutura levemente cristalina. Outro pico, este menos pronunciado é observado

na região próxima a 39° (2θ) nas amostras LAS-N, LAS-S:10 e LAS-S1:5.

Os picos observados nas regiões 21° e 23° (2θ) foram perdidos após sulfatação

nas amostras com DS de 1,02 (LAS-S1:6), 1,42 (LAS-S1:4), possivelmente devido a

formação de novas ligações químicas (sulfatação) na estrutura polimérica, as quais

podem ter perturbado alguma orientação molecular existente.

Perfil difratográfico similar foi reportado por CALEGARI et al. (2017) em

amostra de lasiodiplodana sulfonada com DS de 0,24, os quais também verificaram

picos agudos nas regiões próximas a 21° e 23° (2θ). Da mesma forma,

JAYAMANOHAR et al. (2018) reportaram uma α-(1→3)(1→6)-D-glucana produzida por

Entrococcus hirae KX577639, com perfil difratográfico típico de amostra amorfa com

regiões com certa cristalinidade (índice de cristalinidade 0,48).

75

5.8 Atividade antimicrobiana (MIC)

Na tabela 4 e apêndice 1 estão apresentados os resultados referentes ao

potencial antimicrobiano das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatadas.

76

Tabela 4. Potencial antimicrobiano das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatada contra diferentes cepas de bactérias e leveduras.

Microrganismo

Amostras (DS)

LAS-N LAS-S1:10

(0,15)

LAS-S1:6

(1,02)

LAS-S1:4

(1,42)

LAS-S1:5

(1,61)

Candida albicans ATCC 10231 + (0,15) + (0,26) ++ (0,20) - ++ (0,26)

Candida tropicalis ATCC 13803 + (0,26) + (0,26) + (0,20) - -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 - - - - -

Listeria monocytogenes ATCC 19111 + (0,15) - + (0,26) - -

Salmonella enterica Typhimurium ATCC 0028 - - + (0,26) - + (0,26)

Escherichia coli ATCC 25922 ++ (0,05) - + (0,20) - + (0,10)

+: inibição; - resistência; ++: bactericida ou fungicida; --: bacteriostática ou fungistática. Fonte: Autoria própria.

77

É possível verificar que as amostras de lasiodiplodanas nativa (LAS-N) e

sulfatadas apresentaram potencial de inibição microbiano tanto contra leveduras como

contra bactérias.

LAS-N apresentou efeito fungistático contra as leveduras Candida albicans e

Candida tropicalis nas concentrações de 0,15 mg mL-1 e 0,26 mg mL-1,

respectivamente. Similarmente, THEIS et al., (2017) encontraram efeito fungistático

da lasiodiplodana não modificada contra as mesmas leveduras em concentrações de

0,175 mg mL-1.

LAS-N também apresentou capacidade inibitória contra bactérias, sendo

verificado efeito bacteriostático contra L. monocytogenes (Gram positiva) na

concentração mínima de 0,15 mg mL-1, e efeito bactericida (MIC=0,05 mg mL-1) contra

Escherichia coli (Gram negativa).

Estudos anteriores desenvolvidos por THEIS et al., (2017), reportaram que

lasiodiplodana nativa demonstrou efeito bacteriostático (MIC = 17,5 mg mL-1), frente a

três cepas Gram negativas, Salmonella enterica Typhimurium ATCC 0028, E. coli

ATCC 25922 e Salmonella bongori ATCC 43975.

Da mesma forma, o polissacarídeo extracelular Lasiosana, produzido pelo

ascomiceto Lasiodiplodia sp. estirpe B2 demonstrou potencial antimicrobiano contra

diversas leveduras e bactérias (Staphylococcus aureus MTCC 96, Staphylococcus

aureus MLS16 MTCC 2940, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Micrococcus luteus

MTCC 2470, Escherichia coli MTCC 739, Klebsiella planticola MTCC 530,

Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Enterococcus faecalis MTCC 2729,

Bacillus subtilis MTCC 121, e antifúngicas contra Candida albicans MTCC 183,

Candida albicans MTCC 227, Candida albicans MTCC 854, Candida albicans MTCC

1637, Candida albicans MTCC 3017, Candida albicans MTCC 3958, Candida albicans

MTCC 4748, Candida albicans MTCC 7315, Candida albicans MTCC 3018, Candida

parapsilosis MTCC 1744, Candida aaseri TCC 1962, Candida glabrata MTCC 3019,

Issatchenkia orientalis MTCC 3020 e Issatchenkia hanoiensis MTCC 4755) (KUMAR;

MONGOLLA; POMBALA, 2018).

As amostras sulfatadas também apresentaram atividade antimicrobiana contra

os microrganismos estudados, com exceção da cepa Staphylococcus aureus, a qual

demonstrou resistência frente a todas as amostras.

78

O grau de sulfatação da amostra parece influenciar seu potencial

antimicrobiano, entretanto, sem haver uma correlação linear entre o grau de

substituição e a capacidade inibitória. Neste contexto, pode-se observar que a

amostra com DS 1,42 não apresentou atividade inibitória contra os microrganismos

avaliados, ao passo que, a amostra com menor grau de substituição (DS = 0,15)

apresentou atividade fungistática (MIC = 0,26 mg mL-1) contra C. albicans e C.

tropicalis. Da mesma forma, as amostras com DS 1,02 (MIC = 0,20 mg mL-1) e 1,61

(MIC = 0,26 mg mL-1) foram capazes de exercer atividade fungicida contra C. albicans,

porém a espécie C. tropicalis não foi inibida pela amostra com maior DS (1,61).

A sulfatação parece não ter efeito muito efetivo contra bactérias Gram positivas

(S. aureus e L. monocytogenes), havendo inibição apenas da bactéria L.

monocytogenes pela amostra com DS de 1,02 (MIC = 0,26 mg mL-1). Dentre todas as

amostras sulfatadas estudadas, a amostra com DS 1,02 foi a que demonstrou maior

potencial de atividade antimicrobiana (tabela 4 e apêndice 1).

Importante destacar que o processo de sulfatação (DS 1,02 e 1,61) promoveu

o desenvolvimento de atividade antimicrobiana contra Salmonella enterica

Typhimurium (Gram negativa), efeito este não observado na molécula nativa (LAS-N).

Outro aspecto a ser considerado, é que comumente as bactérias Gram negativas são

mais resistentes do que as Gram positivas em função da sua parede celular

diferenciada (CALO et al., 2015).

CALEGARI et al., (2017), obteve resultados interessantes em relação à

atividade antimicrobiana contra diferentes bactérias. A lasiodiplodana modificada por

sulfatação com DS 0,24, demonstrou atividade bacteriostática contra S. enterica

Typhimurium ATCC 0028 e E. coli ATCC 25922. Já frente a bactérias Gram positivas

não foi verificado atividade inibitória. Entretanto, da mesma forma, não são elucidados

neste trabalho o mecanismo de ação destas moléculas na célula microbiana.

LI e SHAH (2014), analisaram o potencial antimicrobiano de dois

polissacarídeos oriundos de Pleurotus eryngii (DS de 0,69) e Streptococcus

thermophilus (DS de 0,31) após sulfatação e verificaram a potencialização da

atividade antimicrobiana pela derivatização por sulfatação.

Os resultados de atividade antimicrobiana obtidos após sulfatação da

lasiodiplodana no presente trabalho, revela que esta macromolécula pode ser uma

boa alternativa ao combate de infecções fúngicas, como aquelas relacionadas a

79

leveduras do gênero Candida. Além disso, melhorias na solubilidade da molécula

poderia contribuir para o aumento desta bioatividade.

5.9 Potencial Antioxidante

5.9.1 Avaliação do poder de redução do íon férrico (FRAP)

Os resultados obtidos relativos ao potencial de redução do íon férrico frente das

amostras estão demonstrados na Figura 32.

Figura 32. Potencial de redução do íon férrico (FRAP) das amostras de LAS-N e LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15. Fonte: Autoria própria.

Neste ensaio foram avaliados o potencial de redução do íon férrico das

amostras LAS-N e LAS-S, do monômero glicose e do padrão antioxidante ácido

ascórbico.

80

O monômero glicose apresentou baixo potencial de redução do íon férrico à

ferroso (0,24 mmol L-1 FeSO4.7H2O) e a lasiodiplodana nativa não demonstrou

capacidade de redução do íon férrico em todas as concentrações estudadas. Estes

resultados indicam que há um comportamento de atividade antioxidante diferente

entre a glicose na sua forma isolada e como constituinte da glucana lasiodiplodana. O

padrão ácido ascórbico apresentou elevado potencial FRAP (5,87 mmol L-1

FeSO4.7H2O), o que já era esperado considerando que ele é um padrão antioxidante

de referência.

A sulfatação da lasiodiplodana promoveu a potencialização da capacidade de

redução do íon férrico, com exceção da amostra com baixo grau de substituição (0,15),

que não demonstrou atividade redutora. A introdução de um maior número de

grupamentos sulfatos na macromolécula contribuiu para maior potencial antioxidante

redutor. As amostras com maiores DS (LAS-S1:5, DS=1,61 e LAS-S1:4, DS=1,42)

foram as que apresentaram os maiores potenciais antioxidante redutor, sendo

verificados valores de 6,53 mmol L-1 FeSO4.7H2O (0,18 mg mL-1) e 4,6 mmol L-1

FeSO4.7H2O (0,26 mg mL-1), respectivamente.

Outro aspecto a ser destacado, é uma correlação entre concentração do

polissacarídeo sulfatado e a atividade redutora de íon férrico nas amostras com

diferentes valores de DS. Relação dose dependente entre concentração do

polissacarídeo sulfatado e poder redutor também foi reportado por LI e SHAH (2014),

os quais avaliaram o potencial FRAP de derivados sulfatados de um polissacarídeo

extraído Pleurotus enryngii e de um exopolissacarídeo obtido de Streptococcus

thermophilus ASCC 1275.

5.9.2 Avaliação da capacidade de sequestro do radical hidroxila

A capacidade de sequestro do radical hidroxila testado frente as amostras de

lasiodiplodana nativa (LAS-N) e sulfatadas (LAS-S), bem como glicose e ácido

ascórbico, estão demonstradas na Figura 33.

81

Figura 33. Potencial de capacidade de sequestro do radical OH• das amostras de LAS-N e LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15. Fonte: Autoria própria.

Dentre as metodologias de avaliação de atividade antioxidante testadas, as

amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatada apresentaram maior capacidade

antioxidante quando avaliadas pelo potencial de sequestro do radical hidroxila.

Como pode ser visto na figura 33, o padrão ácido ascórbico foi capaz de

remover 100% dos radicais OH. A glicose também apresentou considerável atividade

de remoção de OH• (66,66%). Da mesma forma, LAS-N foi capaz de eliminar 100%

dos radicais hidroxilas em todas as concentrações estudadas (0,26, 0,18 e 0,10 mg

mL-1).

As amostras de lasiodiplodanas sulfatadas também apresentaram elevado

atividade de sequestro de radicais hidroxilas (DS 0,15: 56,59% em 0,10 mg mL-1, DS

1,02: 88,37% em 0,10 mg mL-1, DS 1,42: 88% em 0,10 mg mL-1 e DS 1,61: 67,44%

em 0,18 mg mL-1), mas contrariamente ao observado com o potencial FRAP, a

sulfatação não potencializou a capacidade de remoção de hidroxilas, comparadas à

amostra nativa.

82

Diferentemente do comportamento observado no potencial FRAP, uma

correlação direta entre a capacidade de remoção do radical hidroxila e o grau de

substituição não foi observado. Da mesma forma, a concentração do polissacarídeo

sulfatado não demonstrou influenciar a capacidade de remoção do radical hidroxila,

visto que as maiores concentrações testadas não promoveram aumento na atividade.

XIE et al., (2016) derivatizaram um polissacarídeo extraído de Cyclocarya

paliurus por sulfatação pelo método CSA:Py, no qual obtiveram quatro derivados com

graus de substituição de 0,55 (1:1), 0,42 (1:4), 0,25 (1:6) e 0,12 (1:8). Nesta pesquisa

os autores avaliaram as amostras frente a algumas análises biológicas, como a

capacidade de sequestro do radical hidroxila. Como resultados, verificaram que as

amostras com menores DS promoveram maior remoção de OH•, 44,44% (DS=0,55)

e 90,16% (DS=0,25), o que sugere que não houve uma correlação entre DS e

capacidade de remoção do radical hidroxila.

5.9.3 Avaliação da capacidade de captura do radical DPPH

A capacidade de captura do radical DPPH das amostras LAS-N e LAS-S,

glicose e Trolox, estão monstrados na Figura 34.

83

Figura 34. Potencial de captura do radical DPPH das amostras de LAS-N e LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15. Fonte: Autoria própria.

Pelos resultados apresentados no gráfico acima, é possível verificar que o

padrão Trolox foi capaz de remover quase 100% do radical DPPH, e que a glicose

não demonstrou nenhuma atividade frente a esta metodologia.

Tanto a LAS-N quanto as amostras de lasiodiplodana sulfatada demonstraram

baixa atividade antioxidante referente ao radical DPPH e não há relação dose

dependente entre o grau de substituição e concentração da glucana. A lasiodiplodana

nativa (LAS-N) apresentou máxima capacidade de remoção (8,21%) na contração de

0,10 mg mL-1. Os maiores valores de remoção de DPPH foram encontrados nas

amostras com menores DS (DS 0,15 e 1,02), as quais removeram 15,67% e 22,88%,

respectivamente na concentração de 0,26 mg mL-1.

XIE et al., (2016), avaliaram a capacidade de captura do radical DPPH frente a

quatro derivados sulfatados com graus de substituição de 0,55 (1:1), 0,42 (1:4), 0,25

(1:6) e 0,12 (1:8) de um polissacarídeo extraído de Cyclocarya paliurus. Tais autores

observaram que as amostras demonstraram atividades de eliminação do radical

DPPH dependentes da concentração. Dentre as amostras sulfatadas, a amostra com

84

grau de substituição 0,12, demonstrou maior atividade na concentração de 0,25 mg

mL-1, com potencial de captura de 88,09%. As demais amostras sulfatadas também

apresentaram notável atividade, com valores de 87,02% (DS=0,55), 82,82%

(DS=0,42) e 86,08% (DS=0,25).

5.9.4 Avaliação da captura do radical cátion ABTS

O potencial de captura do radical ABTS das amostras lasiodiplodana nativa

(LAS-N), derivados sulfatados, glicose e ácido ascórbico estão apresentados na

Figura 35.

Figura 35. Potencial de captura do radical ABTS das amostras de LAS-N e LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42; LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15. Fonte: Autoria própria.

De acordo com os resultados demonstrados no gráfico acima, é possível

verificar que a lasiodiplodana nativa (LAS-N) e as amostras sulfatadas com baixo grau

85

de substituição (LAS-S1:10, DS 0,15) demonstraram potencial antioxidante contra o

radical ABTS.

As maiores atividades de captura do radical ABTS foram verificadas nos

ensaios com menores concentrações (0,10 mg mL-1) da glucana nativa (2,68 mmol L-

1 trolox equivalente/mL) ou sulfatada (7,18 mmol L-1 trolox equivalente/mL), ou seja, o

aumento da concentração do polissacarídeo não promoveu maior capacidade

antioxidante. A lasiodiplodana sulfatada com menor DS (0,15) apresentou potencial

de captura do ABTS 168% superior comparada a amostra LAS-N.

LI e SHAH (2017), reportaram que a sulfatação dos polissacarídeos obtidos de

Pleurotus eryngii (DS=0,73) e Streptococcus thermopilus ASCC 1725 (DS=0,37),

potencializou a capacidade de captura do radical ABTS, sendo verificadas remoções

de 70,8% e 61,6%, respectivamente. Tal aumento da atividade de captura do radical

ABTS foi justificado pelos autores em função das amostras sulfatadas terem maior

capacidade de doação de prótons para radicais ABTS.

As atividades antioxidantes da lasiodiplodana nativa e sulfatadas avaliadas pelo

método de remoção dos radicais DPPH e ABTS, foram inferiores as atividades

determinadas pelos métodos FRAP e remoção de OH•. Tal comportamento

possivelmente pode ser justificado em função do uso do etanol como solvente nos

protocolos de remoção dos radicais DPPH e ABTS, uma vez que polissacarídeos

podem ser insolubilizados frente a álcoois.

5.10 Avaliação da citotoxicidade sobre Saccharomyces cerevisiae

Os resultados do estresse oxidativo das amostras testadas (LAS-N e LAS-S)

estão apresentados na tabela 6.

86

Tabela 5. Estresse oxidativo frente as cepas de leveduras testadas das amostras de lasiodiplodana nativa e sulfatadas.

S. cerevisiae

Amostras (DS)

LAS-N 0,15 1,02 1,42 1,61 Menadiona

(mg mL-1) (m mol L-1)

Padrão* -- (0,20) -- (0,26) -- (0,20) - - ++ (18,5)

YLL060C∆GTT2 -- (0,20) -- (0,26) -- (0,20) - -- (0,26) ++ (18,5)

YIR038C∆GTT1 -- (0,20) -- (0,20) -- (0,20) - - ++ (18,5)

YSL101C∆GSH1 -- (0,20) -- (0,20) -- (0,20) - -- (0,26) ++ (18,5)

+: inibição; - resistência; ++: atividade biocida; --: atividade biostática.

*Padrão= Saccharomyces cerevisiae f.r bayanus; LAS-S. LAS-S1:5, DS=1,61; LAS-S1:4, DS=1,42;

LAS-S1:6, DS=1,02; LAS-S1:10, DS=0,15.

Fonte: Autoria própria.

Conforme verificado na tabela 6 e apêndice 2, a naftoquinona menadiona

(vitamina K3) demonstrou citotoxicidade letal contra as cepas de S. cerevisiae, mesmo

em concentrações bastante baixas. De fato, a menadiona é um importante agente

indutor do estresse oxidativo, o qual contribui para o aumento da produção de

espécies químicas reativas (ROS), e leva os níveis de ROS a excederem a capacidade

antioxidante endógena.

Por outro lado, a lasiodiplodana nativa (LAS-N) e as amostras sulfatadas não

demonstraram citotoxicidade letal contra as cepas de S. cerevisiae, nas

concentrações estudadas. Apenas a LAS-N demonstrou efeito inibitório (biostático)

durante 24 horas de incubação na concentração de 0,20 mg mL-1, tanto sobre a cepa

selvagem como as mutantes.

Similarmente, as amostras sulfatadas com os menores DS (0,15 e 1,02) não

demonstraram atividade biocida, apenas inibindo a atividade celular durante 24 horas

nas concentrações de 0,20 e 0,26 mg mL-1. Os derivados com maior grau de

87

substituição (1,42 e 1,61) apresentaram menor capacidade de indução ao estresse

oxidativo. Neste sentido, a amostra sulfatada com DS 1,42 não promoveu inibição à

viabilidade celular de nenhuma das cepas avaliadas. A amostra com maior grau de

sulfatação (1,61) promoveu atividade biostática em concentrações de 0,26 mg mL-1

apenas sobre os mutantes YLL060C e YSL101C.

Embora LAS-N e LAS-S demonstram atividade antioxidante, especialmente em

relação a capacidade de eliminação dos radicais hidroxila e atividade redutora do íon

férrico, possivelmente não há inibição da produção e acúmulo de determinadas

espécies reativas de oxigênio (ROS) pela lasiodiplodana. De fato, lasiodiplodana

possui atividade antimicrobiana contra determinadas espécies microbianas, como E.

coli e C. tropicalis estudadas neste trabalho. Entretanto, é importante notar que

mesmo não havendo eliminação de um desbalanço entre acúmulo de ROS e atividade

antioxidante, não houve letalidade das células das estirpes mutantes, as quais são

incapazes de produzir glutationa, sugerindo uma baixa toxicidade da macromolécula

lasiodiplodana, em relação a indução ao estresse oxidativo.

WAN-MOHTAR et al. (2016) avaliram a citotoxicidade de uma β-glucana nativa

(G) extraída do cogumelo Ganoderma lucidum BCCM 31549 e seu derivado sulfatado

(GS) frente a células de próstata humana (PN2TA) e linfócitos caucasianos de

linfomas histiocítico humano (U937). Tais autores verificaram que tanto os polímeros

G e GS não apresentaram efeito citotóxico sobre as células de próstata humana

(PN2TA). Em relação as células U937, as amostras demonstraram efeito

antiproliferativo dose dependente. A glucana sulfatada (GS) demonstrou ser mais

potente quanto a atividade antiproliferativa na concentração de 60 µg mL-1,

promovendo uma inibição de crescimento celular de 40%, quando comparada com a

glucana nativa (10%).

88

6 CONCLUSÕES

O protocolo analítico empregado no processo de sulfatação da lasiodiplodana

foi efetivo e promoveu a obtenção de derivados com diferentes graus de substituição

(1,61, 1,42, 1,02 e 0,15). A proporção ácido clorossulfônico-piridina empregadas no

protocolo de sulfatação demonstrou ter influência direta sobre o grau de substituição

da macromolécula.

A derivatização por sulfatação contribuiu para pequeno aumento na

solubilidade da lasiodiplodana, ocorrendo aumento de solubilidade com o aumento do

DS.

Os espectros de IV-TF confirmaram a sulfatação da lasiodiplodana, sendo

verificada bandas em 1250 cm-1 atribuída a vibração de alongamento assimétrico

(forte) S=O e 810 cm-1 correspondente a vibração simétrica C-O-S, associado ao

grupo C-O-SO3.

A sulfatação promoveu mudanças morfológicas na superfície do biopolímero,

levando ao surgimento de estruturas fibrilares e heterogêneas ao longo da área

superficial. O grau de substituição demonstrou ter influência nas mudanças

morfologicas da macromolécula.

Lasiodiplodana nativa apresentou elevada estabilidade térmica, ocorrendo

oxidação do biopolímero em temperaturas próximas a 377 °C. A sulfatação promoveu

aumento da estabilidade térmica, ocorrendo oxidação do biopolímero em

temperaturas próximas a 460 °C.

Análise por DRX demonstrou que as amostras de lasiodiplodana nativa e

sulfatadas apresentam perfil cristalográfico predominantemente amorfo, característico

de polissacarídeos.

Lasiodiplodana nativa (LAS-N) e derivados sulfatados demonstraram potencial

de inibição microbiana. LAS-N apresentou efeito fungistático contra C. albicans e C.

tropicalis, efeito bacteriostático contra L. monocytogenes e bactericida contra E. coli.

A sulfatação da macromolécula ampliou sua atividade antimicrobiana, especialmente

contra a C. albicans e S. enterica Typhimurium, exercendo efeito fungicida e

bacteriostático, respectivamente.

89

Lasiodiplodana nativa e sulfatada demonstraram potencial antioxidante. LAS-N

apresentou maior capacidade de remoção do radical hidroxila, enquanto os derivados

sulfatados apresentaram maior potencial FRAP.

Lasiodiplodana nativa e sulfatadas não demonstraram citotoxicidade letal

contra as cepas selvagem e mutantes de S. cerevisiae, nas concentrações estudadas.

Amostras com maiores DS (1,42 e 1,61) apresentaram menor potencial de indução ao

estresse oxidativo promotor de letalidade celular.

90

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103

8 APÊNDICES

Apêndice 1.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

nativa (LAS-N) frente às cepas de leveduras, à esquerda C. albicans e à direita C.

tropicalis. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05

mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de fluconazol (controle positivo); G: salina 0,9% (controle

negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

nativa (LAS-N) frente às cepas bactérias Gram positivas, à esquerda S. aureus e à

104

direita L. monocytogenes. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10

mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo); G: salina

0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

nativa (LAS-N) frente às cepas bactérias Gram negativas (S. enterica Typhimurium à

esquerda e E. coli à direita). A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D:

0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo); G:

salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

105

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:6) frente às cepas de leveduras, à esquerda C. albicans e à direita

C. tropicalis. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E:

0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de fluconazol (controle positivo); G: salina 0,9% (controle

negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:6) frente às cepas de bactérias Gram positivas, a cima S. aureus e

106

abaixo L. monocytogenes. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10

mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo); G: salina

0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:6) frente às cepas de bactérias Gram negativas, à esquerda S.

enterica Typhimurium e à direita E. coli. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

107

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:10) frente às cepas de leveduras, à esquerda C. albicans e à direita

C. tropicalis. Onde A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10 mg mL-

1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de fluconazol (controle positivo); G: salina 0,9%

(controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:10) frente às cepas de bactérias Gram positivas, à esquerda S.

aureus e à direita L. monocytogenes. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

108

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:10) frente às cepas de bactérias Gram negativas, à esquerda S.

enterica Typhimurium e à direita E. coli. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:4) frente às cepas de leveduras, à esquerda C. albicans e à direita

C. tropicalis. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E:

0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de fluconazol (controle positivo); G: salina 0,9% (controle

negativo).

Fonte: Autoria própria.

109

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:4) frente às cepas de bactérias Gram positivas, à esquerda S.

aureus e à direita L. monocytogenes. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:4) frente às cepas de bactérias Gram negativas, à esquerda S.

enterica Typhimurium e à direita E. coli. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

110

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:5) frente às cepas de leveduras, à esquerda C. albicans e à direita

C. tropicalis. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D: 0,10 mg mL; E:

0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo); G: salina 0,9% (controle

negativo).

Fonte: Autoria própria

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:5) frente às cepas de bactérias Gram positivas, à esquerda S.

aureus e à direita L. monocytogenes. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg

mL-1; D: 0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo);

G: salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

111

Resultados referentes à análise antimicrobiana (MIC) da amostra de lasiodiplodana

sulfatada (LAS-S1:5) frente às cepas de bactérias Gram negativas, à cima S. enterica

Typhimurium, e a baixo E. coli. A: 0,26 mg mL-1; B: 0,20 mg mL-1; C: 0,15 mg mL-1; D:

0,10 mg mL-1; E: 0,05 mg mL-1; F: 5 mg mL-1 de tetraciclina (controle positivo); G:

salina 0,9% (controle negativo).

Fonte: Autoria própria.

112

Apêndice 2

Análise de citotoxicidade da lasiodiplodana nativa e derivados sulfatados sobre a S.

cerevisiae.

Fonte: Autoria própria.