Αλληλούχιση DNA

ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΑΝΟΙΚΤΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΚΑΘΗΓΗΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ

ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ DNA.

ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ.

ΔΙΔΑΚΤΙΚΟ ΣΕΝΑΡΙΟ ΣΕ ΜΑΘΗΤΕΣ ΛΥΚΕΙΟ

ΟΝΟΜΑ ΦΟΙΤΗΤΗ

ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΜΟΥΡΑΤΙΔΗΣ

ΟΝΟΜΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗ

ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ

ΠΑΤΡΑ

ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ, 2015

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.

Περικλής Μουρατίδης Σελίδα 1

Περιεχόμενα

Πρόλογος………………………………………………………………………….5

1. Πριν το DNA… τι;………………………………………………………………..5

1.1 Από τις ιδέες του Πλάτωνα μέχρι την υλική υπόσταση………………………6

1.2 Τιμήθηκαν με βραβείο Νομπέλ για την περίφημη διπλή έλικα……………….7

1.3 Διεθνής αναγνώριση…………………………………………………………..9

1.4 Πρωτοπόροι της Γενετικής……………………………………………………9

2. Η ανακάλυψη της μοριακής δομής του DNA……………………………………10

2.1 Τι είναι το DNA;……………………………………………………………..13

2.2 Επιλύνοντας τον γρίφο. Η δομή του DNA…………………………………...14

2.3 Όλοι μοιραζόμαστε τα ίδια στοιχεία…………………………………………18

2.4 Μια Νέα Εποχή………………………………………………………………20

2.5 Η έλικα του DNA…………………………………………………………….20

3 Πως φτάσαμε στην αλληλούχιση………………………………………………...22

4 Οι πρώτες ιδέες…………………………………………………………………...24

5 Η επιτυχία………………………………………………………………………...26

6 Οι πρωτοπόροι……………………………………………………………………28

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7 Οι πρώτες τεχνικές….……………………………………………………………32

7.1 Η μέθοδος συν-πλην………………………………………………………….33

7.2 Η μέθοδος Maxam – Gilbert…………………………………………………39

7.3 Η μέθοδος της διδεοξυαλληλούχισης………………………………………...43

7.3.1 Η μέθοδος της διδεοξυ-αλληλούχισης στην αρχική της μορφή………..43

7.3.2 Η μέθοδος της διδεοξυ-αλληλούχισης με χρήση φθορίζουσας ουσίας..49

7.4 Μαζική Αλληλούχιση Shotgun………………………………………………53

7.5 Η μέθοδος της πυραλληλούχισης (ή προσδιορισμός αλληλούχισης μέσω

πυροφωσφορικού)……………………………………………………………………58

7.5.1 Στρατηγικές της πυροαλληλούχισης…………………………………...61

7.5.2 Προετοιμασία των εκμαγείων για την πυροαλληλούχιση……………..63

7.5.3 Επεκτείνοντας το μήκος αλληλούχισης με την μέθοδο της

Πυροαλληλούχισης…………………………………………………………………..64

7.5.4 Εφαρμογές της πυραλληλούχισης……………………………………...65

7.5.4.1 Γονοτυποποίηση πολυμορφισμών μεμονωμένων νουκλεοτιδίων..65

7.5.4.2 Αναγνώριση μικροβίων…………………………………………..66

7.5.4.3 Επαναλληλούχιση………………………………………………...66

8 Next Generation Sequencing (NGS) Αλληλούχιση Επόμενης Γενιάς……………..66

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


8.1 Η μέθοδος Massively parallel signature sequencing (MPSS) «μαζική

αλληλούχιση παράλληλης υπογραφής»……………………………………………...68

8.2 Αλληλούχιση Polony (Polymerase-colony) ή αποικίες πολυμεράσης……….76

8.3 454 Πυροαλληλούχιση……………………………………………………….79

8.3.1 Διαδικασία……………………………………………………………..80

8.4 Illumina (Solexa) sequencing………………………………………………..82

8.4.1 Μεθοδολογία…………………………………………………………..83

8.5 Μέθοδος SOLiD……………………………………………………………..90

8.5.1 Η δομή των οκταμερών………………………………………………...92

8.5.2 Η διαδικασία αλληλούχισης……………………………………………93

8.6 Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) by Life Technologies………97

8.6.1 Μεθοδολογία…………………………………………………………...99

9. Σήμερα…………………………………………………………………………...102

9.1 Αλληλούχιση Nanopore…………………………………………………….103

9.2 Προοπτική και εξέλιξη……………………………………………………...104

10. Συμπεράσματα………………………………………………………………….106

11. Πρόταση διδασκαλίας της αλληλούχισης του DNA σε μαθητές Λυκείου……..107

Περίληψη………………………………………………………………………..123

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Abstract………………………………………………………………………….125

Βιβλιογραφία………………………………………………………………………..127

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Πρόλογος

Με την ανακάλυψη του DNA, της δομής του και της λειτουργίας του ξεκίνησαν

και οι σκέψεις για το ποιος είναι ο ρόλος της ύπαρξής του. Ο συνδυασμός των

τεσσάρων βάσεων που το αποτελούν είναι ένας δύσκολος γρίφος, την επίλυσή του

οποίου οι επιστήμονες ξεκίνησαν να αναζητούν λίγα χρόνια μετά την ανακάλυψη της

ύπαρξής του. Άμεσα αναγνώρισαν ότι η σειρά με την οποία τοποθετούνται παίζει

κάποιο ρόλο στην λειτουργία των οργανισμών.

1. Πριν το DNA….. τι;

Η ιστορία για το DNA ξεκινά πολλά χρόνια πριν την επίσημη ανακάλυψη του.

Συγκεκριμένα ανακαλύφθηκε το 1869 από τον Ελβετό γιατρό Johann Friedrich

Miescher όταν εργαζόταν στην πόλη Tubingen της Γερμανίας. Ο Miescher έλαβε

εκχυλίσματα από πληγές τις οποίες μελετούσε. Αυτά περιείχαν ανθρώπινα

λευκοκύτταρα (πύον) τα οποία ήταν ακατέργαστο DNA και χρωμοσωματική

πρωτεΐνη .[1,4]

Βέβαια, για σχεδόν 100 χρόνια δεν ήξερε κανείς τι είναι και τι ακριβώς κάνει το

DNA. Καθώς προχωρούσε ο εικοστός αιώνας και μαζί του προχωρούσε και η

βιολογία, οι επιστήμονες άρχισαν να υποψιάζονται ότι ίσως και να χρησιμεύει στην

μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας από γενιά σε γενιά. Κανείς δεν ήταν σίγουρος

όμως, μάλιστα επικρατούσε η αντίθετη άποψη, ότι η γενετική πληροφορία είναι

αποθηκευμένη σε πρωτεΐνες, είχε αρκετούς διάσημους υποστηρικτές μεταξύ των

οποίων και ο δύο φορές νομπελίστας Λάινους Πόλινγκ.[1]

Μόλις όμως οι Κρικ, Γουότσον και Φράνκλιν επιβεβαίωσαν την διπλή ελικοειδή

δομή του DNA, το 1954, ήταν φως φανάρι ότι με τέτοιο απλό μηχανισμό

κλωνοποίησής του είναι ιδανικό μόριο για αποθήκευση και μεταβίβαση πληροφορίας.

Κι έτσι, στο δεύτερο μισό του εικοστού αιώνα ο ρυθμός εξέλιξης της βιολογίας

εκτινάχθηκε.[5]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


1.1 Από τις ιδέες του Πλάτωνα μέχρι την υλική υπόσταση

Στην αρχαιότητα οι αναφορές από αρχαίους συγγραφείς για την πηγή της ζωής

δεν είναι λίγες. Σε μια από αυτές ο Πλάτωνας στον Τίμαιο κάνει αναφορά για την

δομή την οποία θα μπορούσαμε να το παρομοιάσουμε με το σημερινό DNA.

Η ιστορία της ανακάλυψης αρχίζει από τα τέλη του 19ου αιώνα όταν ο Γρηγόριος

Μέντελ με διασταυρώσεις απέδειξε ότι η κληρονομικότητα από γενιά σε γενιά

μεταβιβάζεται διά μέσου γονιδίων, στοιχείων φύσεως μοναδιαίας, που δεν

συμπεριφέρονται ως υγρά, δηλαδή δεν αναμειγνύονται αλλά μεταβιβάζονται με τη

μορφή διακριτών μονάδων. [2]

Από την πρώτη δεκαετία του 20ού αιώνα μέχρι περίπου και την τρίτη, στις ΗΠΑ

η σχολή του Μόργκαν (Τ. Η. Μοrgan, 1866-1945) κατάφερε να πείσει όλους ότι τα

γονίδια δεν αποτελούν την έκφανση πλατωνικών ιδεών (όπως ισχυριζόταν ο Άγγλος

γενετιστής W. Bateson) αλλά έχουν υλική υπόσταση, εδράζεται καθένα τους σε

ορισμένη θέση σε χρωμόσωμα του πυρήνα του κυττάρου. Με τους μαθητές του

κατάφερε να συντάξει «χάρτες» χρωμοσωμάτων με τις θέσεις των διαφόρων

γονιδίων, χρησιμοποιώντας μόνο τα αριθμητικά αποτελέσματα από διασταυρώσεις.

Αυτοί οι χάρτες των χρωμοσωμάτων επαληθεύθηκαν με άλλους παρόμοιους χάρτες,

καμωμένους όμως με διαφορετικό τρόπο, δηλαδή από ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων

λόγω θραύσεών τους και επανασυγκολλήσεων. Μέχρι τον Δεύτερο Παγκόσμιο

Πόλεμο κάθε γονίδιο έμοιαζε να κατέχει συγκεκριμένη θέση σε ένα χρωμόσωμα και

να επηρεάζει την μορφή και λειτουργία του οργανισμού. [3]

Στις αρχές της δεκαετίας του 1930 μια επί πλέον ανακάλυψη αποκατέστησε την

υλικότητα του γονιδίου: ο Ρώσος γενετιστής Ν.Τimoféev - Ressovsky (1899-1981)

στο Βερολίνο, υπολόγισε το μέγεθος του γονιδίου (με τη χρήση μεταλλαγών, δηλαδή

απότομων αλλαγών που υφίσταται το γονίδιο από τις ακτίνες Χ): ήταν περίπου ίσο με

το μέγεθος ενός βιολογικού μεγαλομορίου. Τέτοια μόρια στον οργανισμό είναι οι

πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα. Την περίοδο του Δεύτερου Παγκοσμίου Πολέμου,

δύο Αμερικανοί, οι G. Beadle και Ε. L.Tatum, στην εργασία τους παρατήρησαν ότι τα

γονίδια επιδρούν στη μορφή και στη λειτουργία του οργανισμού καθένα τους με την

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


παραγωγή εξειδικευμένου ενζύμου.[4]

Το γονίδιο λοιπόν είχε δύο ιδιότητες, τη μία να πολλαπλασιάζεται αντιγραφόμενο

πιστά και τη δεύτερη να κατασκευάζει πρωτεΐνη. Από ποια όμως χημική ένωση

αποτελείται; Η πρώτη και κυρίαρχη άποψη ήθελε τα γονίδια να είναι πρωτεΐνες, αφού

αυτές παρήγαν τα γονίδια (τα ένζυμα αποτελούνται από πρωτεΐνη ή έχουν σημαντικό

πρωτεϊνικό τμήμα), οι πρωτεΐνες έχουν την αναγκαία πολυπλοκότητα (είναι αλυσίδες

αμινοξέων, είκοσι περίπου διαφορετικών ειδών). Όμως αργά αλλά σταθερά

συσσωρεύονταν οι ενδείξεις ότι τα γονίδια αποτελούνται από DNA

(δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ). Οι ενδείξεις αυτές προέρχονταν από τις ομάδες που

μελετούσαν τη γενετική των βακτηρίων και των ιών. Η πιο σημαντική ένδειξη

προερχόταν από το φαινόμενο της μεταμόρφωσης: ένα μη μολυσματικό βακτήριο

μπορούσε να μετατραπεί σε μολυσματικό αν προσθέταμε εκχύλισμα σκοτωμένου με

θέρμανση μολυσματικού βακτηρίου. Ενδελεχείς βιοχημικές αναλύσεις απέδειξαν ότι

ο ενεργός παράγων υπεύθυνος για τη μεταμόρφωση ήταν το DΝΑ! [5]

Τότε αποφάσισε ο Salvador Luria (Ιταλός μετανάστης στις ΗΠΑ και γενετιστής

των ιών, που είχε διαφύγει από την Ιταλία, εξ αιτίας της εβραϊκής καταγωγής του, την

περίοδο του 2ου Παγκοσμίου Πολέμου) να στείλει τον πρώτο του μαθητή, και νέο

διδάκτορα, τον James Watson με υποτροφία στην Ευρώπη για να ενημερωθεί στη

βιοχημεία ώστε να ερευνήσει τη χημική σύσταση του γονιδίου που πίστευε ότι ήταν

από DΝΑ.

1.2 Τιμήθηκαν με βραβείο Νομπέλ για την περίφημη διπλή έλικα.

Έπειτα από άγονη παραμονή του στη Δανία ο Watson επέλεξε να μεταβεί στο

Κέμπριτζ της Αγγλίας όπου συναντήθηκε με τον Francis Crick με τον οποίον

δημιούργησε στενό φιλικό δεσμό. Ο Watson ενημέρωσε τον φίλο του για τις

γενετικές όψεις του προβλήματος, ενώ ο Crick, που είχε σπουδάσει φυσική, τον

μύησε στα μυστικά της μελέτης της δομής των κρυστάλλων από τις εικόνες

περίθλασής τους όταν ακτινοβοληθούν με ακτίνες Χ. Ήταν μια ατελής μεν, η μόνη

όμως δυνατότητα να αναγνωστούν με βεβαιότητα ορισμένες πληροφορίες για τη δομή

του μορίου. Όταν οι ακτίνες Χ πέσουν στο μόριο σκεδάζονται. Στην περίπτωση

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


κρυστάλλων, που όλα τα μόρια έχουν τον ίδιο προσανατολισμό στον χώρο, οι

σκεδασμοί ενισχύουν ο ένας τον άλλο και δημιουργούνται εστίες που αποτυπώνονται

σε φωτογραφικό χαρτί. Από αυτές τις εστίες-κηλίδες, τη θέση τους, μπορεί ο

κρυσταλλογράφος να συλλέξει μερικές ενδείξεις για τις θέσεις και τη δομή

ορισμένων τμημάτων του μελετώμενου μορίου. Έτσι μπορεί να βοηθηθεί στην

κατασκευή υποθετικών μοντέλων του μορίου αυτού. [6]

Οι δύο φίλοι άρχισαν να συλλέγουν κρυσταλλογραφικές πληροφορίες από

κρυσταλλογράφους που δούλευαν στη δομή του DNA κοντά τους στο ίδιο

συγκρότημα εργαστηρίων, από τον Maurice Wilkins (ο οποίος πρόθυμα

συνεργάσθηκε) και από τη Rosalind Franklin, η οποία προτιμούσε τη μοναξιά της,

είχε εξαιρετική τεχνική αλλά δεν κατανοούσε τη σημασία του προβλήματος. Η

συνεχής κατασκευή μοντέλων, απόρριψη εκείνων που δεν πληρούσαν τις

κρυσταλλογραφικές προϋποθέσεις, κατέληξε στην υιοθέτηση μιας δομής δύο μακρών

ελίκων που αντικριστά ενώνονταν μεταξύ τους. Το DNA αποτελείται από σειρά

ενωμένων απλούστερων τμημάτων, των νουκλεοτιδίων, που αποτελούνται από ένα

υδατάνθρακα-σάκχαρο (δεοξυριβόζη) ένα φωσφορικό οξύ και μια από τις τέσσερις

δυνατές οργανικές βάσεις: την αδενίνη (Α), τη θυμίνη (Τ), τη γουανίνη (G) και την

κυτοσίνη (C). Ο Watson θέλησε να αποτυπώσει την πιστότητα αντιγραφής ενώνοντας

εσωτερικά τις δύο αλυσίδες με δεσμούς μεταξύ των υδρογόνων των αντικριστών

βάσεων των νουκλεοτιδίων. Αρχικά ένωσε Α με Α, Τ-Τ, G-G, και C-C. Όμως η

κατασκευή δεν φαινόταν δυνατή. Παίζοντας με τις διάφορες βάσεις αντιλήφθηκε ότι

αν ένωνε μια αδενίνη με μια θυμίνη ή μια γουανίνη με μια κυτοσίνη και τα

αντίστροφά τους (Τ-Α, C-G) όχι μόνο το υπόδειγμα είχε ευστάθεια αλλά εξηγούσε

απόλυτα τον μηχανισμό του πολλαπλασιασμού: αν μια ελικοειδής αλυσίδα

απομακρυνόταν από τη συμπληρωματική της μπορούσε να προσελκύσει τα

«συμπληρωματικά» της νουκλεοτίδια και έτσι να δομηθεί ολόκληρη η

συμπληρωματική της αλυσίδα! Και κάτι που δεν το περίμεναν: επιτέλους μπορούσαν

να εξηγήσουν τα αποτελέσματα των χημικών αναλύσεων του βιοχημικού Erwin

Chargaff, ο οποίος σε διάφορα DNA έβρισκε ίδιες ποσότητες αδενίνης με θυμίνη, και

ίδιες γουανίνης με κυτοσίνη! Αυτό το είχε ανακοινώσει λίγα χρόνια πριν σε ένα

συνέδριο και ένας φίλος μου παρευρισκόμενος κατηγορούσε εκ των υστέρων τον

εαυτό του και τους άλλους παραυρισκόμενους ότι κανένα από τα 200 άτομα που ήταν

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


παρόντα (ερευνητές υψηλής νοημοσύνης) δεν κατάλαβε τη σημασία αυτού του

δεδομένου! Ο ίδιος ο Chargaff τόσο ενοχλήθηκε που του διέφυγε κάτι τέτοιο ώστε

αρχικά αρνιόταν ότι η «διπλή έλικα» των Watson και Crick ήταν ορθή! [7]

1.3 Διεθνής αναγνώριση

Το 1962 οι Watson, Crick και Wilkins τιμήθηκαν με το βραβείο Νομπέλ για την

ανακάλυψή τους, ενώ η Rosalind Franklin, που πέθανε νέα το 1958 δεν τιμήθηκε (το

βραβείο απονέμεται μόνο σε ζώντες). Είχαν όμως κατ’ επανάληψη προταθεί για

βράβευση οι τρεις τους, όπως φανερώνουν τα αρχεία της Σουηδικής Ακαδημίας. Από

τους πρωτεργάτες ο Crick προσέφερε πολλά στον τομέα της μοριακής γενετικής ενώ

στη συνέχεια στράφηκε στη μελέτη του νευρικού συστήματος και της

αυτοσυνειδησίας. Πέθανε το 2004. Ο Watson έγινε γνωστός για τη σύλληψη και

καθοδήγηση του προγράμματος καταγραφής της αλληλουχίας των βάσεων του

ανθρωπίνου γονιδιώματος και για τη συγγραφή του συναρπαστικού βιβλίου του «The

Double Helix» που εξιστορεί την ανακάλυψή τους. Ο Crick έγραψε και αυτός ένα

βιβλίο με το ίδιο περιεχόμενο αλλά απευθυνόταν σε κοινό με πιο εξειδικευμένες

επιστημονικές γνώσεις («What mad pursuit»). Σ’ αυτό το βιβλίο ήθελα να περιγράψει

τις εμπειρίες του πριν και τα την διάρκεια της κλασικής περιόδου της μοριακής

βιολογίας από την ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA το 1953 μέχρι κατανόηση

του γενετικού κώδικα το 1966.[8]

1.4 Οι πρωτοπόροι στη γενετική

Ο Γρηγόριος Μέντελ απέδειξε στα τέλη του 19ου αιώνα ότι η κληρονομικότητα

από γενιά σε γενιά μεταβιβάζεται διά μέσου γονιδίων, στοιχείων φύσεως μοναδιαίας,

που δεν συμπεριφέρονται ως υγρά, δηλαδή δεν αναμειγνύονται.

Ο όρος γενετική εισάγεται το 1905 από το βιολόγο William Bateson ο οποίος

ήταν ένας από αυτούς που ανακάλυψαν την δουλειά που είχε πραγματοποιήσει ο

Mendel, o οποίος ήταν από τους πρώτους που εισηγούνται τους νόμους του Mendel

για την γενετική.[10]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η κρυσταλλογράφος Rosalind Franklin, απεβίωσε το 1958 και ως εκ τούτου δεν

τιμήθηκε με το βραβείο Νoμπέλ, το οποίο απονέμεται μόνο σε ζώντες. Ο ρόλος,

ωστόσο, της Franklin στην ανακάλυψη της δομής του DNA ήταν καθοριστικός.

Ο Maurice Wilkins συνέγραψε μαζί με δύο συνεργάτες του κρυσταλλογράφους

ένα από τα τρία διαδοχικά άρθρα για τη δομή του DNA στο διεθνούς κύρους

επιστημονικό περιοδικό Nature πριν από εξήντα χρόνια.

2. Η ανακάλυψη της μοριακής δομής του DNA.

Η ανακάλυψη της διπλής έλικα του DNA ήταν αυτή θα άλλαζε όλα τα δεδομένα

στον χώρο της βιολογίας και γενικότερα στο χώρο των επιστημών. Η φράση «Η δομή

αυτή έχει νέα χαρακτηριστικά σημαντικού βιολογικού ενδιαφέροντος» με την οποία

ξεκινούν το επιστημονική τους δημοσίευση τον Απρίλιου του 1953, μπορεί να είναι

μια από τα πιο διάσημες εκφράσεις της επιστήμης της οποίας το περιεχόμενο κανείς

δεν μπορούσε να καταλάβει την περίοδο εκείνη. [6]

Εικ. 1 .Η εφαρμογή των νόμων του Mendel στην Drosophila

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Τον Απρίλιο του 1953 οι James Watson και Francis Crick παρουσιάζουν την

εργασία τους στο περιοδικό NATURE «η δομή της DNA έλικας» του μορίου που

μεταφέρει και μεταβιβάζει την τις γενετικές πληροφορίες από γενιά σε γενιά.[6]

Σε μια επιστολή του ο F. H. Crick προς τον δωδεκάχρονο γιό του λίγες ημέρες

μετά την δημοσίευση της εργασίας του με το J. D. Watson περιέγραφε :

«… o Jim Watson και εγώ κάναμε μάλλον μια πολύ σημαντική ανακάλυψη.

Κατασκευάσαμε ένα μοντέλο για την δομή του δεσ-οξυ-ριβο-νουκλεϊκού οξέος

(διάβασέ το προσεκτικά) που ονομάζεται D.N.A. […] Όταν γυρίσεις σπίτι θα σου

δείξω το μοντέλο. […] Με άλλα λόγια πιστεύουμε ότι ανακαλύψαμε τον μηχανισμό

αντιγραφής από τον οποίο η ζωή προέρχεται από τη ζωή» Εικ. 3.

Εικ. 2 Από το χρωμόσωμα στο DNA

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εννέα χρόνια αργότερα, το 1962, μοιράστηκαν το βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας ή

Ιατρικής με τον Maurice Wilkins, για την επίλυση ενός από τα πιο σημαντικά από

όλα τα βιολογικά αινίγματα. Μισό αιώνα αργότερα, σημαντικές νέες συνέπειες αυτής

της συμβολή στην επιστήμη συνεχίζουν να έρχονται στο φως.

2.1 Τι είναι το DNA;

Πολλοί επιστήμονες άνοιξαν τον δρόμο για την ανακάλυψη του DNA. Ένα αιώνα

πριν την απόδοση του Nobel στους Watson και Crick, το 1868 ένα νεαρός Ελβετός

φυσικός ο Friedrich Miescher απομόνωσε κάτι που κανένας πιο πριν δεν είχε

παρατηρήσει στους πυρήνες των κυττάρων. Την ονόμασε «nuclein» «νουκλένιο».

Ήταν αυτό που σήμερα ονομάζουμε νουκλεϊκό οξύ Είναι το τμήμα “NA” του DNA

(δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) και RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ).[9,10]

Δύο χρόνια νωρίτερα, ο Τσέχος μοναχός Γκρέγκορ Μέντελ, είχε τελειώσει μια

σειρά πειραμάτων με αρακά. Οι παρατηρήσεις του κατέληξαν να είναι στενά

Εικ. 3 Γράμμα του Crick προς τον γιό του για την ανακάλυψη του DNA.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


συνδεδεμένες με την ανακάλυψη των νουκλεϊκών οξέων. Ο Μέντελ ήταν σε θέση να

αποδείξει ότι ορισμένα χαρακτηριστικά στα μπιζέλια, όπως το σχήμα ή το χρώμα

τους, κληρονομήθηκαν σε διάφορες θέσεις. Τις θέσεις αυτές σήμερα τις γνωρίζουμε

ως γονίδια. [3,16]

Για πολλά χρόνια η σχέση μεταξύ των νουκλεϊκών οξέων και των γονιδίων ήταν

άγνωστη. Το 1944 o αμερικανικός επιστήμονας Oswald Avery κατάφερε να

μεταφέρει στέλεχος των βακτηρίων από ένα στο άλλο, που είχαν την ικανότητα να

προκαλούν ασθένεια. Αλλά δεν ήταν μόνο αυτό. Τα προηγουμένως αβλαβή βακτήρια

τα οποία είχαν προσβληθεί μπορούσαν επίσης να περάσουν το χαρακτηριστικό αυτό

στην επόμενη γενιά. Αυτό που η Avery είχε μεταφέρει ήταν νουκλεϊκά οξέα. Αυτό

αποδεικνύει ότι τα γονίδια είναι κατασκευασμένα από νουκλεϊκά οξέα. [17]

2.2 Επιλύνοντας τον γρίφο. Η δομή του DNA.

Στα τέλη της δεκαετίας του 1940, τα μέλη της επιστημονικής κοινότητας

γνώριζαν ότι το DNA ήταν πιθανότατα το μόριο της ζωής, ακόμη και αν πολλοί ήταν

επιφυλακτικοί, δεδομένου ότι ήταν τόσο «απλό». Ήξεραν επίσης ότι το DNA

περιλαμβάνονται διάφορα ποσά από τις τέσσερις βάσεις αδενίνη, θυμίνη, γουανίνη

και κυτοσίνη (συνήθως συντετμημένο Α, Τ, G και C), αλλά κανείς δεν είχε την

παραμικρή ιδέα για το πώς το μόριο μπορεί να μοιάζει. [11,12]

Προκειμένου να απαντηθεί το ερώτημα της δομής του DNA, ένα ζευγάρι των

διακριτών κομματιών των πληροφοριών πρέπει να τεθούν δίπλα δίπλα. Υπήρχαν δύο

απόψεις. Η πρώτη ήταν ότι ο φωσφορικός σκελετός ήταν στο εξωτερικό με βάσεις

στο εσωτερικό και η άλλη ότι το μόριο ήταν μια διπλή έλικα. Ήταν επίσης σημαντικό

να καταλάβουμε ότι οι δύο κλώνοι τρέχουν σε αντίθετες κατευθύνσεις και ότι το

μόριο είχε μια συγκεκριμένη βάση ζευγαρώματος.[13]

Όπως και στην επίλυση άλλων σύνθετων προβλημάτων, το έργο πολλών

ανθρώπων ήταν αναγκαίο για να καθιερώσει την πλήρη εικόνα του μορίου. [8]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Οι Watson και Crick χρησιμοποιώντας το μοντέλο ραβδί-και-μπάλα δοκίμαζαν τις

ιδέες τους για την πιθανή δομή του DNA. Άλλοι επιστήμονες χρησιμοποίησαν

πειραματικές μεθόδους αντί αυτού. Μεταξύ αυτών ήταν και Rosalind Franklin και

Maurice Wilkins, οι οποίοι χρησιμοποιούσαν την περίθλαση ακτίνων Χ για να

κατανοήσουν τη φυσική δομή του μορίου του DNA.[15]

Όταν βάλλεις με ακτίνες Χ σε κάθε είδους κρύσταλλο – αλλά και ορισμένα

βιολογικά μόρια, όπως το DNA, μπορεί να σχηματίσει κρυσταλλική δομή. Εάν

πειραματιστούμε με διάφορους τρόπους - οι αόρατες ακτίνες Χ αναπηδούν στο

δείγμα. Οι ακτίνες στη συνέχεια δημιουργούν πολύπλοκα σχήματα σε φωτογραφικό

φιλμ. Με την εξέταση των προτύπων, είναι δυνατό να καταλάβουμε σημαντικά

στοιχεία σχετικά με τις δομές που συνθέτουν το κρύσταλλο.[15]

Εικ. 4 Το πραγματικό μοντέλο από τους

Watson και Crick

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ο επιστήμονας Linus Pauling ήταν πρόθυμος να λύσει το μυστήριο του σχήματος

που έχει το DNA. Το 1954 βραβεύτηκε με βραβείο Νόμπελ Χημείας για την

πρωτοποριακή εργασία του σχετικά με τους χημικούς δεσμούς και τη δομή των

μορίων και των κρυστάλλων. Στις αρχές του 1953 είχε δημοσιεύσει ένα έγγραφο

όπου πρότεινε μια τριπλή ελικοειδή δομή για το DNA. Οι Watson και Crick είχαν

επίσης εργαστεί στο παρελθόν για ένα μοντέλο τριών ελικοειδών το 1951. Αλλά η

θεωρία τους ήταν λανθασμένη.[13]

Το λάθος τους εν μέρει βασιζόταν στον Watson ο οποίος θυμόταν εσφαλμένα ένα

διάλογό που του με την Rosalind Franklin όπου ανέφερε ότι είχε βρει την

περιεκτικότητα σε νερό του DNA με κρυσταλλογραφικές μεθόδους ακτίνων Χ. Αλλά

ο Watson δεν κρατούσε σημειώσεις, και θυμόταν τους αριθμούς λανθασμένα.[13]

Αντ’ αυτού, ήταν γνωστή η κρυσταλλογραφία ακτίνων X της Franklin που

αποκάλυψε τελικά την ελικοειδή δομή του DNA για τους Watson και Crick το 1953.

Αυτή η εικόνα του DNA που είχε κρυσταλλωθεί υπό συνθήκες υγρασίας δείχνει μία

ασαφής εικόνα Χ στο μέσον του μορίου, μια δομή που υποδηλώνει την ελικοειδής

δομή του DNA (Εικ. 5).[14]

Εικ. 5 Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ που είχε τραβήξει η Ρόζαλιντ Φράνκλιν και βοήθησε

τους Γουάτσον και Κρικ στην αποσαφήνιση της δομής..

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Το μυστήριο του τρόπου με τον οποίο ζευγαρώνουν οι βάσεις είχε λυθεί εν μέρει

από την βιοχημικό Erwin Chargoff μερικά χρόνια νωρίτερα. Το 1949 έδειξε ότι αν

και διαφορετικοί οργανισμοί έχουν διαφορετικές ποσότητες του DNA, η ποσότητα

της αδενίνης ισούται πάντοτε την ποσότητα της θυμίνης. Το ίδιο ισχύει και για το

ζευγάρι γουανίνη και κυτοσίνη. Για παράδειγμα, το ανθρώπινο DNA αποτελείται από

Εικ. 6 Μοντέλο της άλφα-έλικας

Εικ. 7 Ίση αναλογία Αδενίνης – Θυμίνης και

Γουανίνης - Κυτοσίνης

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


περίπου 30 % σε αδενίνη και θυμίνη, και 20 % σε γουανίνη και κυτοσίνη.[15]

Με αυτές τις πληροφορίες στα χέρια του ο Watson ήταν σε θέση να καταλάβει

τους κανόνες αντιστοίχισης. Στις 21 Φεβρουαρίου του 1953 ξεκλείδωσε το αίνιγμα,

όταν είδε ότι ο δεσμός αδενίνη-θυμίνη ήταν ακριβώς του ίδιου μήκους με το δεσμό

κυτοσίνης-γουανίνης. Εάν οι βάσεις ζευγάρωναν κατ’ αυτό τον τρόπο, κάθε σκαλί της

ελικοειδούς σκάλας στην έλικα θα είναι ίδιου μήκους και η ραχοκοκαλιά σακχάρου-

φωσφορικού θα είναι ομαλή. [15]

«Δεν μας διαφεύγει το γεγονός ότι η συγκεκριμένη αντιστοίχιση που έχουν

πιθανόν να υποδηλώνει έναν μηχανισμό αντιγραφής του γενετικού υλικού», έγραψαν

οι Watson και Crick στην επιστημονική εργασία που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό

Nature, 25 Απριλίου 1953.[6]

Αυτή ήταν πράγματι μια σημαντική ανακάλυψη στη μελέτη του τρόπου με τον

οποίο το γενετικό υλικό περνά από γενιά σε γενιά. Μόλις κατασκευάστηκε το

μοντέλο, η απλή δομή του άφησε να εννοηθεί ότι το DNA ήταν πράγματι ο φορέας

του γενετικού κώδικα και έτσι το βασικό μόριο της κληρονομικότητας, αναπτυξιακής

βιολογίας και της εξέλιξης.[18]

Η ειδική σύζευξη βάσεων διέπει την τέλεια αντιγραφή του μορίου, η οποία είναι

απαραίτητη για την κληρονομικότητα. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης,

το μόριο DNA είναι σε θέση να "ανοίξει σαν φερμουάρ" σε δύο κομμάτια. Ένα νέο

μόριο του DNA σχηματίζεται από κάθε εκμαγείο, και λόγω του ειδικού

ζευγαρώματος αυτό δημιουργεί δύο πανομοιότυπα αντίγραφα θυγατέρων από κάθε

μητρικό μόριο.[15]

2.3 Όλοι μοιραζόμαστε τα ίδια στοιχεία

Το DNA είναι η συνταγή της επιτυχίας για τη συσκευασία του γενετικού υλικό.

Ως εκ τούτου, σχεδόν όλοι οι οργανισμοί - τα βακτήρια, τα φυτά, η μαγιά και τα ζώα

- μεταφέρουν γενετικές πληροφορίες καταγεγραμμένες στο DNA. Μια εξαίρεση είναι

ορισμένοι ιοί που χρησιμοποιούν το RNA ως το γενετικό τους υλικό.[5]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Διαφορετικά είδη χρειάζονται διαφορετικές ποσότητες DNA. Για το λόγο αυτό η

αντιγραφή του DNA, προηγείται της κυτταρικής διαίρεσης, διαφέρει μεταξύ των

οργανισμών. Για παράδειγμα, το DNA στο βακτήριο E. coli αποτελείται από 4

εκατομμύρια ζευγών βάσεων και το σύνολο του γονιδιώματος έχει μήκος ένα

χιλιοστό. Ένα μονοκύτταρο βακτήριο μπορεί να αντιγράψει το γονιδίωμά του και να

διαιρεθεί σε δύο νέα κύτταρα κάθε 20 λεπτά.

Το DNA των ανθρώπων, από την άλλη πλευρά, αποτελείται από περίπου 3

δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων, που συνθέτουν μια αλυσίδα μήκους σχεδόν ενός

μέτρου κατά το τέντωμα της, την οποία συναντούμε σε κάθε κύτταρο στο σώμα μας.

Για να χωρέσει μια τόσο μεγάλου μήκους αλυσίδα, θα πρέπει το DNA να

Εικ. 8 Όλοι οι οργανισμοί αποτελούνται από

τα ίδια δομικά στοιχεία

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


συσκευαστεί σε μια πολύ συμπαγή μορφή. Στο E. coli, το ενιαίο κυκλικό μόριο DNA

είναι κουλουριασμένο σε μια συμπυκνωμένη μορφή, ενώ το ανθρώπινο DNA είναι

συσκευασμένο σε 23 διακριτά ζεύγη χρωμοσωμάτων. Εδώ το γενετικό υλικό είναι

σφιχτά τυλιγμένο σε δομές που ονομάζονται ιστόνες. [16]

2.4 Μια Νέα Εποχή

Αυτή η γνώση του πώς το γενετικό υλικό αποθηκεύεται και αντιγράφεται έχει

οδηγήσει σε ένα νέο τρόπο θεώρησης και χειρισμό των βιολογικών διεργασιών, που

ονομάζεται μοριακή βιολογία. Με τη βοήθεια των ενζύμων περιορισμού, τα μόρια

του DNA μπορούν κα κοπούν σε συγκεκριμένα τμήματα, στη συνέχεια τα κομμάτια

του DNA που έχουν κοπεί μπορούν να βγουν τελείως ή να ξαναμπούν σε

διαφορετικές θέσεις.[19]

Στη βασική επιστήμη, όταν θέλεις να κατανοήσεις το ρόλο όλων των

διαφορετικών γονιδίων στον άνθρωπο και τα ζώα, αναπτύσσονται νέες τεχνικές.

Σήμερα είναι δυνατόν να δημιουργηθούν ποντίκια που έχουν τροποποιηθεί γενετικά

και στερούνται συγκεκριμένων γονιδίων. Από τη μελέτη αυτών των ζώων οι

επιστήμονες προσπαθούν να καταλάβουν πως το γονίδιο αυτό μπορεί να

χρησιμοποιηθεί για σε φυσιολογικά ποντίκια. Αυτό ονομάζεται η τεχνική νοκ-άουτ,

δεδομένου ότι τα τμήματα του DNA που έχει ληφθεί και απομακρυνθεί, ή νοκ άουτ.

Οι επιστήμονες έχουν επίσης τη δυνατότητα να εισάγουν νέα κομμάτια του DNA

σε κύτταρα που στερούνται συγκεκριμένα κομμάτια γονιδίων ή ολόκληρων γονιδίων.

Με αυτό το νέο DNA, το κύτταρο καθίσταται ικανό να παράγει γονιδιακά προϊόντα

που δεν μπορούσαν να παράγουν πριν. Η ελπίδα είναι ότι, στο μέλλον, ασθένειες που

προκύπτουν λόγω της έλλειψης μίας συγκεκριμένης πρωτεΐνης θα μπορούσαν να

θεραπευθούν με αυτό το είδος γονιδιακής θεραπείας.[19]

2.5 Η έλικα του DNA

Η ραχοκοκαλιά σακχάρου-φωσφορικού είναι προς τα έξω και οι τέσσερις

διαφορετικές βάσεις βρίσκονται στο εσωτερικό του μορίου του DNA. Τα δύο σκέλη

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


της διπλής έλικας είναι αντι-παράλληλα, πράγμα που σημαίνει ότι κινούνται σε

αντίθετες κατευθύνσεις. Η ραχοκοκαλιά σακχάρου-φωσφορικού είναι στο εξωτερικό

της έλικας, (Εικ. 9β) και οι βάσεις στο εσωτερικό. Η ραχοκοκαλιά μπορεί να

θεωρηθεί ως πλευρές μιας σκάλας, ενώ οι βάσεις στη μέση σχηματίζουν τα

σκαλοπάτια της σκάλας.[19]

Το κάθε σκαλοπάτι αποτελείται από δύο ζεύγη βάσεων. Είτε ένα ζεύγος αδενίνης-

θυμίνης που σχηματίζουν ένα διπλό δεσμό υδρογόνου, ή ένα ζεύγος κυτοσίνης-

γουανίνης το οποίο σχηματίζει ένα τριπλό δεσμό υδρογόνου (Εικ. 9α). Το ζευγάρωμα

των βάσεων είναι έτσι προκαθορισμένο.

Ο περιορισμός αυτός είναι πολύ σημαντικός όταν το DNA αντιγράφεται. Το DNA

αρχικά ξετυλίγεται και ανοίγει σε δύο μεγάλα τμήματα του σακχάρου-φωσφορικού

Εικ. 9α Η διπλή έλικα έχει ένα σταθερό σκελετό,

που αποτελείται από επαναλαμβανόμενα μόρια

φωσφορικής ομάδας δεοξυριβόζης ενωμένων με

φωσφοδιεστερικό δεσμό. Ο σκελετός αυτός είναι

υδρόφιλος και βρίσκεται στο εξωτερικό του μορίου.

Προς το εσωτερικό του σταθερού αυτού σκελετού

βρίσκονται οι αζωτούχες βάσεις που είναι

υδρόφοβες.

Εικ. 9β To DNA αποτελείται από

δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες

που σχηματίζουν στο χώρο μία

δεξιόστροφη διπλή έλικα.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


σκελετού με μια γραμμή ελευθέρων βάσεων οι οποίες έχουν κολλήσει πάνω σ’ αυτόν,

όπως τα δόντια μιας χτένας. Κάθε τμήμα θα είναι τότε το εκμαγείο για ένα νέο,

συμπληρωματικό κλώνο. Ειδικοί μηχανισμοί στο εσωτερικό του κυττάρου

τοποθετούν τις αντίστοιχες ελεύθερες βάσεις πάνω στους ανοιχτούς κλώνους

ελέγχοντας ταυτόχρονα το αποτέλεσμα της τοποθέτησης για να βρει και να διορθώσει

τυχόν λάθη. Μετά τον διπλασιασμό αυτό έχουν δημιουργεί δύο ακριβή αντίγραφα του

αρχικού μορίου DNA.[19]

Οι περιοχές κωδικοποίησης στον κλώνο του DNA, τα γονίδια, συνθέτουν μόνο

ένα κλάσμα της συνολικής ποσότητας του DNA. Τα τμήματα που υπάρχουν μεταξύ

κωδικοποιημένων περιοχών ονομάζονται εσώνια, και αποτελούνται από μη-

κωδικοποιημένο DNA. Τα εσώνια εκλαμβάνονται ως σκουπίδια κατά τις πρώτες

ημέρες. Σήμερα, βιολόγοι και γενετιστές πιστεύουν ότι αυτή η μη-κωδικοποιημένη

περιοχή του DNA μπορεί να είναι απαραίτητη, προκειμένου να εκθέσει τις περιοχές

κωδικοποίησης και να ρυθμίζουν τον τρόπο που τα γονίδια εκφράζονται.[19]

3. Πως φθάσαμε στην αλληλούχιση του DNA;

Δεκαπέντε χρόνια μεσολάβησαν από την ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA

(1953) έως την πρώτη αλληλούχιση του DNA (1968). Η καθυστέρηση αυτή

προερχόταν από διάφορους παράγοντες:

Οι χημικές ιδιότητες διαφορετικών μορίων DNA ήταν τόσο όμοιες που ήταν

δύσκολος ο διαχωρισμός τους

Το μήκος του δεσμού που συναντούμε στα μόρια DNA είναι πολύ μεγαλύτερο

από αυτό των προτεϊνών των οποίων η αλληλούχιση έμοιαζε απλησίαστη.

Τα είκοσι αμινοξέα που συναντούμε στις πρωτεΐνες έχουν μια ευρεία ποικιλία

ιδιοτήτων οι οποίες έχουν αποδειχθεί χρήσιμες στο διαχωρισμό των

πεπτιδίων. Η παρουσία μόνο τεσσάρων βάσεων στο DNA έκανε το πρόβλημα

της αλληλούχιση να δείχνει δυσκολότερο από αυτό των πρωτεϊνών.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Δεν ήταν γνωστά τα τμήματα που κόβουν οι δεοξυριβονουκλεάσες. Η

αλληλούχιση των πρωτεϊνών εξαρτιόταν από πρωτεάσες που διασπούν

συγκεκριμένους δεσμούς σε αμινοξέα.[18]

Αρχικά αλληλουχίθηκαν μόρια RNA τα οποία δεν αντιμετώπιζαν τα παραπάνω

προβλήματα που αναφέρθηκαν όπως τα μόρια του DNA. Συγκεκριμένα τα tRNA

μόρια είναι μικρά και μερικά μεμονωμένα είδη μπορούν να καθοριστούν.

Ριβονουκλεάσες με ικανότητα να αναγνωρίζουν συγκεκριμένες βάσεις ήταν γνωστές

έτσι δημιουργήθηκαν μέθοδοι ανάλογες με αυτές που χρησιμοποιούνταν στις

πρωτεΐνες θα μπορούσαν να εξελιχθούν.

Έτσι το tRNA μόριο της E. coli alanine ήταν το πρώτο νουκλεϊκό οξύ που

αλληλουχίθηκε το 1965 από τον Holley. Σε αντίθεση με την αλληλούχιση των

αμινοξέων τα οποία δεν είχαν διερευνηθεί μέχρι τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης

δομής των πρωτεϊνών, η οποία προσδιορίστηκε κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Τα

Εικ. 10 Αλληλούχιση tRNA μορίων.

Παρατηρούνται οι δίκλωνες περιοχές στις τρείς

αναπαραστάσεις.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


μοντέλα για την δομή του tRNA μπορούν να συνταχθούν υιοθετώντας ένα ανάλογο

ζευγάρωμα των ζευγών βάσεων με αυτό που συναντάμε στη διπλή έλικα του DNA.[20]

Το πρώτο μόριο DNA με καθορισμένη ομοιογένεια ήταν το γονιδίωμα του

βακτηριοφάγου ϕX174 όπως αναφέρθηκε από τον Sinsheimer το 1959. Η

φυγοκέντριση του ϕX έδωσε καθαρό δείγμα από το οποίο εύκολα με εκχύλιση

φαινόλης μπορούσε να απομονωθεί DNA. Το DNA από ϕX αποδείχθηκε ότι ήταν

μονόκλωνο κυκλικό μόριο το οποίο εκτιμάτε ότι ήταν μήκους 5000 νουκλεοτιδίων.[21]

4. Οι πρώτες ιδέες

Οι πρώτες θεωρίες για την κληρονομικότητα διατυπώνονται από τον Ιπποκράτη

και τον Αριστοτέλη. Η θεωρία του Ιπποκράτη είναι όμοια με τις νεότερες απόψεις του

Μέντελ της Πανγένεσης. Στην θεωρία αυτή το γενετικό υλικό συλλέγεται από όλο το

σώμα. Ο Αριστοτέλη αντ’ αυτού πρότεινε ότι η μορφή ενός οργανισμού δίδεται μέσω

του σπέρματος το οποίο θεωρεί ως μια μορφή καθαρού αίματος και του έμμηνου

αίματος της μητέρας, τα οποία αλληλεπιδρούν στην μήτρα της για την εξέλιξη του

οργανισμού. Τόσο για τον Αριστοτέλη όσο και για τον Ιπποκράτη αλλά και για τους

νεότερούς τους μελετητές μέχρι τα τέλη του 19ου αιώνα η μεταβίβαση συγκεκριμένων

χαρακτηριστικών ήταν υποτίθεται μια πολύ καλά θεμελιωμένη υπόθεση όπου

οποιαδήποτε θεωρία άλλη θα έπρεπε να ερμηνεύει την μεταβίβαση των

χαρακτηριστικών. [22]

Κατά την Ινδική ιατρική τα κληρονομούμενα χαρακτηριστικά στο παιδί

καθορίζονται από τέσσερις παράγοντες:

1ος από μητρικό γενετικό υλικό

2ος από το σπέρμα του πατέρα

3ος από την διατροφή της μητέρας κατά την διάρκεια της εγκυμοσύνης

4ος εκείνων που συνοδεύουν την ψυχή που εισέρχεται στο έμβρυο.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Καθένας από τους τέσσερις αυτούς παράγοντες έχει τέσσερις παραμέτρους οι

οποίες δημιουργούν δεκαέξι παράγοντες των οποίων το κάρμα των γονέων και η

ψυχή καθορίζουν ποια χαρακτηριστικά θα κληρονομηθούν. [23]

Η εκ νέου ανακάλυψη των νόμων του Mendel, οι οποίοι είχαν παραγκωνιστεί,

επανήλθαν στο προσκήνιο τις αρχές του 20ου αιώνα, πυροδοτώντας την σκέψη των

επιστημόνων της εποχής για την κατανόηση της φύσης και της γενετικής

πληροφορίας, το περιεχόμενο της οποίας είχε ωθήσει την κοινωνία των επιστημόνων

τα τελευταία εκατό χρόνια. Η επιστημονική πρόοδος μπορεί να διαχωριστεί σε

τέσσερις περιόδους που αντιστοιχούν στις τέσσερις περιόδους ενός αιώνα:

Κατά το πρώτο τέταρτο εδραιώνεται η άποψη ότι η βάση της

κληρονομικότητας είναι το κύτταρο μέσα από τα χρωμοσώματα.

Στο δεύτερο προσδιορίστηκε η μοριακή βάση της κληρονομικότητας η οποία

είναι η διπλή έλικα του DNA.

Στο τρίτο αναγνωρίστηκε ο μηχανισμός της κληρονομικότητας με τον οποίο

τα κύτταρα διαβάζουν την πληροφορία που είναι αποθηκευμένη στα γονίδια

με την ανακάλυψη της τεχνική του ανασυνδεμένου DNA, της τεχνικής της

κλωνοποίησης και του προσδιορισμού της αλληλουχίας βάσεων στο μόριο του

DNA όπου οι επιστήμονες κατάφεραν να κάνουν αυτό που η φύση επιλέγει να

κάνει.

Στο τελευταίο τέταρτο του αιώνα σηματοδοτήθηκε από το τεράστιο

ενδιαφέρον που έδειξαν οι επιστήμονες για την αποκρυπτογράφηση. Αρχικά

αποκρυπτογράφησαν γονίδια και ακολούθησε η αποκωδικοποίηση ολόκληρων

γωνιδιωμάτων. Τα πρώτα αποτελέσματα αυτής της προσπάθειας

περιλαμβάνουν την αλληλούχιση περίπου 600 ιών και ιοειδών.

Αλληλουχίθηκαν ακόμη φυσικά πλασμίδια, οργανίδια, ευβακτήρια, αρχαία,

μύκητες ακόμη δύο ζώα και ένα φυτό. [24]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


5. Η επιτυχία

Η πρώτη ολοκληρωμένη προσπάθεια αλληλούχισης πραγματοποιείται το 1965

από την ομάδα του Holley στο πανεπιστήμιο Cornell. Συγκεκριμένα ασχολήθηκαν με

το tRNA μόριο της αλανίνης το οποίο κατάφεραν να απομονώσουν από ζύμη.

Επέλεξαν το μόριο του tRNA διότι είναι το μικρότερο ενεργό μόριο νουκλεϊκού

οξέος. Ο ρόλος του είναι να μεταφέρει ενεργά αμινοξέα για την σύνθεση πρωτεϊνών.

Κατά την διάρκεια της σύνθεση πρωτεϊνών η αλληλουχία αμινοξέων της

πολυπεπτιδικής αλυσίδας καθορίστηκε από την αλληλεπίδραση του mRMA με το

tRNA για ένα συγκεκριμένο αμινοξύ. Η ομάδα έλαβε από ζύμη αλανίνης, τυροσίνης

και βαλίνης τρία (3) μόρια tRNA τα οποία καθορίστηκαν στο εργαστήριό τους.

Ο προσδιορισμός της δομής περιελάμβανε την αναγνώριση μικρών τμημάτων που

προέκυπταν από την πέψη RNA με παγκρεατικές ριβονουκλεάσες ακολουθούμενες

από τον προσδιορισμό της δομής από διαδοχικά κομμάτια μέχρι την πλήρη

αλληλούχιση του RNA.

Οι παγκρεατικές ριβονουκλεάσες είναι ένα ένζυμο που κόβει την αλυσίδα του

RNA στις πυριμιδίνες δηλαδή στην U και την C δίνοντας τα 19 τμήματα που

φαίνονται στην εικόνα 11.

Εικ. 11 Τμήματα που προέκυψαν από πέψη RNA

αλανίνης με παγκρεατικές νουκλεάσες

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Με πλήρη πέψη του DNA με ribonuclease T1 ένα υψηλής εξειδίκευσης ένζυμο το

οποίο διασπά επιλεκτικά την αλυσίδα του DNA κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες

δίπλα σε G- και I- δίνοντας 17 τμήματα όπως υπάρχουν στην εικόνα 12. Η εύρεση

της δομής αλληλουχίας των προϊόντων αυτών απαιτεί την χρήση και των παλαιών

αλλά και των νεότερων μεθόδων αλληλούχισης.[25]

Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων που αναφέρονται στις εικόνες 11 και 12

επιτρέπει την περιγραφή της δομής τμημάτων της RNA αλανίνης όπως φαίνεται στην

εικόνα 13. Τα δεδομένα αυτά που περιγράφονται στις εικόνες 11 και 12 δεν είναι σε

θέση να τοποθετηθούν σε μια σειρά η οποία θα δίνει την αλληλουχία με μόνη

εξαίρεση τα δύο άκρα. Η παρουσία του 5΄ φωσφόρου στο pG-G-G-C υποδηλώνει ότι

αυτό είναι το αριστερό άκρο του RNA. Αντίθετα η παρουσία του 3΄ υδρόφιλο στη

ακολουθία U-C-C-A-C-C-AOH υποδηλώνει ότι αυτό είναι το δεξιό άκρο.

Η δομής της RNA αλανίνης παρουσιάζεται στην αρχή της εικόνας 14. Σημαντικά

τμήματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την απόδειξη της δομής υπάρχουν στην

κάτω τμήμα της ίδιας εικόνας.

Εικ. 12 Τμήματα της RNA αλανίνης που προέκυψαν από

πέψη με ribonuclease Τ1

Εικ. 13 Τα 16 τμήμα που αλληλουχίθηκαν με μικρό αριθμό

νουκλεοτιδίων που προέκυψε από την σύγκριση των

τμημάτων των εικόνων 11 και 12

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 14 Η δομή της RNA αλανίνης από ζύμη. Στο κάτω τμήμα της εικόνας παρουσιάζονται

τμήματα τα οποία βοήθησαν στην πλήρη αλληλούχισή της.

Με την εργασία τους αυτή για τη δομής της RNA αλανίνης έδειξαν ότι και η δομή

άλλων νουκλεϊκών οξέων μπορεί να προσδιοριστεί δημιουργώντας μια βάση για νέες

προσπάθειες προσδιορισμού της αλληλουχίας άλλων νουκλεϊκών οξέων. [26]

6. Οι πρωτοπόροι

Η πρώτη μέθοδος προσδιορισμού της αλληλουχίας παρουσιάζεται από τον Ray J.

Wu στο πανεπιστήμιο Cornell το 1970. Η εργασία του αυτή είχε τίτλο Nucleotide

sequence analysis of DNA. I. Partial sequence of the cohesive ends of bacteriophage λ

and 186 DNA. Η εργασία αυτή έβαλε τα θεμέλια για την εξέλιξη στις τεχνικές

αλληλούχισης. Η τεχνική ήταν ένα θεμελιώδες ερευνητικό εργαλείο το οποίο θα

βοηθούσε στην εξέλιξη της ιατρικής, της γεωπονίας και άλλων επιστημών αλλά θα

δημιουργούσε και νέες κατευθύνσεις-προσανατολισμό στην έρευνα. Σήμερα το

πρόγραμμα της αναγνώρισης του ανθρώπινου γονιδιώματος δεν θα μπορούσε να

πραγματοποιηθεί χωρίς αυτή την εργασία.[27]

Σ’ αυτή την εργασία έχει εξελιχθεί η διαδικασία προσδιορισμού της αλληλουχίας

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


δεοξυνουκλεοτιδίων σε μια περιοχή του DNA. Όταν αυτή η περιοχή είναι μονόκλωνη

όπως συμβαίνει με τον βακτηριοφάγο λ, η DNA πολυμεράση της E. coli μπορεί να

χρησιμοποιηθεί για την επιδιόρθωση της μονόκλωνης περιοχής εισάγοντας

ραδιενεργά νουκλεοτίδια στο 3΄ άκρο τερματίζοντας στο 5΄ άκρο την μονόκλωνης

περιοχής. Το μερικώς σημασμένο DNA μπορεί να κοπούν με νουκλεάσες και κατ’

αυτό τον τρόπο μπορούν τα ραδιοσημασμένα ολιγονουκλεοτίδια να απομονωθούν και

να προσδιοριστεί η αλληλουχία τους.[28]

Κάνοντας χρήση της μεθόδου αυτής έγινε δυνατό να αλληλουχιθούν μικρά

μονόκλωνα τμήματα δεοξυνουκλεοτιδίων (DNA) των βακτηριοφάγου λ και 186

DNA. Για την περίπτωση του βακτηριοφάγου λ το δεξιό συνδετικό άκρο είχε

αναλυθεί. Τα πρώτα οκτώ ραδιενεργά νουκλεοτίδια προστέθηκαν στο 3΄ άκρο έχουν

αλληλουχία dpGpGpGpCpGpGpCpG καθρεφτίζοντας την συμπληρωματική

αλληλουχία dpCpGpCpCpGpCpCpC για τα οκτώ εσωτερικά νουκλεοτίδια του δεξιού

προεξέχοντος κλώνου ο οποίος προσφέρει το εκμαγείο για την επιδιόρθωση που θα

πραγματοποιήσει η DNA πολυμεράση. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν ότι κάθε ένα από τα

δύο συμπληρωματικά άκρα του DNA έχουν μήκος περίπου 12 νουκλεοτιδίων, τα 2/3

της αλληλουχίας των ζευγών των νουκλεοτιδίων της συνδετικής περιοχής του λ έχει

προσδιοριστεί με την συγκεκριμένη ανάλυση. Το 186 DNA έχει συνεκτικά άκρα

μήκους 17 νουκλεοτιδίων αλληλουχίθηκε με την ίδια τεχνική. Τα τέσσερα πρώτα

νουκλεοτίδια που προστέθηκαν στο 3΄ άκρο του δεξιά συνεκτικού άκρου έχουν την

ακολουθία dpGpGpCpG, η οποία διαφέρει από την ακολουθία του λ.[27]

Για την αλληλούχιση θα πρέπει να ξεπεραστούν τρία βασικά εμπόδια. Το πρώτο

είναι η δυσκολία να επιτευχθούν μεγάλες ποσότητες DNA. Το δεύτερο είναι ο

τεράστιος αριθμός νουκλεοτιδίων που θα πρέπει να αναγνωριστούν ακόμα και στο

μικρότερου μήκους μορίου DNA το οποίο μπορεί να περιέχει ακόμα και μερικές

χιλιάδες νουκλεοτίδια. Και τρίτων η ικανότητα των ριβονουκλεσών να διασπούν την

αλυσίδα του DNA σε συγκεκριμένες θέσεις. Αν και υπάρχουν υψηλής ικανότητας

ριβονουκλεάσες όπως οι ριβονουκλεάση T1 και η παγκρεατική ριβονουκλεάση για

την διάσπαση της αλυσίδας του DNA σε συγκεκριμένα σημεία. Ωστόσο δεν

υπάρχουν υψηλής διακριτικής ικανότητας ριβονουκλεάσες για την διάσπαση του

DNA με σκοπό την αλληλούχιση του DNA. [27]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


O R. WU σ' αυτή του εργασία παρουσιάζει τις προσπάθειές του για να ξεπεράσει

τα εμπόδια ενσωματώνοντας ραδιενεργά σημασμένα δεοξυνουκλεοτίδια μέσα στο

DNA. Έτσι μπόρεσε να αναλύσει μικρές ποσότητες ξεπερνώντας την ανάγκη για

μεγάλες ποσότητες ομογενούς DNA. [27]

Ξεκίνησε κάνοντας χρήση του βακτηριοφάγου λ με τον οποίο είχε δύο

προτερήματα. Πρώτον μπορούσε να προετοιμαστεί σε ομογενή μορφή και δεύτερον

το κάθε μόριο του DNA είχε μονόκλωνο 5' άκρο το οποίο προσέφερε ένα μοναδικό

εκμαγείο για την DNA πολυμεράση η οποία ενσωμάτωνε τα ραδιενεργά σημασμένα

δεοξυνουκλεοτίδια σε χαμηλές θερμοκρασίες. Έτσι η αλληλουχία του μονόκλωνου

τέλους του λ DNA μπορεί να αναλυθεί χωρίς την παρεμβολή πολύ μεγάλων μη

σημασμένων τμημάτων του DNA. [27]

Σε παλαιότερη εργασία του ο WU (με τον Kaiser το 1968) στηρίχθηκε σε ένα ή

δύο μόνο ραδιενεργά σεσημασμένα νουκλεοτίδια, την κυτοσίνη και την γουανίνη.[29]

Κατά την εργασία αυτή ένας μικρός αριθμός νουκλεοτιδίων αλληλουχίθηκε στα δύο

άκρα του λ DNA. Για την αλληλούχιση μεγαλύτερων ακολουθιών νέες διαδικασίες

μεταξύ των οποίων η μερική πέψη σημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων. Σ' αυτή την

εργασία τα άκρα του λ DNA σημάνθηκαν με pG και pC. Η αλληλουχία που

Εικ 15 Η μερική αλληλούχιση των δύο άκρων του βακτηριοφάγου λ

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


επιβεβαιώθηκε ήταν η pG pG pG pC pG pG pC pG.[27]

Όπως παρατηρούμε στην παραπάνω εικόνα 15 στην δομή Ι τα σημασμένα οκτώ

νουκλεοτίδια ενσωματώθηκαν στο δεξί συνεκτικό άκρο του λ DNA επιμηκύνοντας

τον 3' κλώνο. Αυτή η ενσωμάτωση καθοδηγείται από τη συμπληρωματική

αλληλουχία στην μονόκλωνη περιοχή η οποία διακόπτεται από το άκρο 5' με το Α

(δομή ΙΙ). Η ενσωμάτωση διακόπτεται όταν φθάσει στο όγδοο C νουκλεοτίδιο υπό

την παρουσίας μόνο των dGTP και dCTP. Αίτιο αυτής της διακοπής είναι η παρουσία

θυμίνης (T) ή αδενίνης (A) μετά από το όγδοο νουκλεοτίδιο. Υπάρχουν ενδείξεις ότι

τα δύο άκρα (το δεξί με το αριστερό) είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους όπως

φαίνεται στην δομή ΙΙΙ.[27]

Όταν η ενσωμάτωση των ραδιενεργών νουκλεοτιδίων στο μονόκλωνο άκρο γίνει

κάτω από τις ιδανικότερες συνθήκες το μήκος των δύο άκρων μπορεί να

προσδιοριστεί. Η εκτιμώμενη τιμή που παίρνουμε είναι 12 νουκλεοτίδια σε κάθε

άκρο για τον λ DNA.

Για να γίνει ακριβέστερη αυτή η εκτίμηση το επόμενο βήμα ήταν η σήμανση του

λ DNA και με τα τέσσερα νουκλεοτίδια συνθέτοντας τα δύο μονόκλωνα άκρα

μετατρέποντας τα σε δύο τμήματα με 12 ραδιενεργά σημασμένα νουκλεοτίδια. Στο

δεξιό τμήμα η αλληλουχία των οκτώ νουκλεοτιδίων ήταν είδη γνωστή και το 3'

σημασμένο άκρο έπρεπε να είναι η Τ (θυμίνη). Έτσι θα είναι σχετικά εύκολο να

καθοριστεί η ακολουθία όλου του δεξιού συνεκτικού άκρου. Το αριστερό θα πρέπει

να είναι συμπληρωματικό του δεξιού αλλά η αλληλουχία θα πρέπει να προσδιοριστεί

πειραματικά χρησιμοποιώντας τους ίδιους κανόνες.[27]

Για την εξέλιξη της ανάλυσης της αλληλούχισης του DNA ο λ φάγος ήταν μια

ιδανική αφετηρία για μετέπειτα εξέλιξη της ενσωμάτωσης ραδιενεργά σημασμένων

νουκλεοτιδίων κάνοντας χρήση της DNA πολυμεράσης. Προχωρώντας παραπέρα με

την πέψη συγκεκριμένων τμημάτων με εξωνουκλεάση ΙΙΙ η οποία απομακρύνει

νουκλεοτίδια από το 3' άκρο δίκλωνου DNA μορίου. Στη συνέχεια ο μονός κλώνος

θα γίνει το εκμαγείο για την συμπλήρωσή του με ραδιενεργά σημασμένα

νουκλεοτίδια. Έτσι στο τμήμα αυτό μπορεί να προσδιοριστεί. [27]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7. Οι πρώτες τεχνικές αλληλούχισης

Μέχρι και τα μέσα της δεκαετίας του 1970 ήταν δυνατή η απομόνωση και η

παραγωγή γονιδίων σε μεγάλους αριθμούς. Αλλά δεν ήταν δυνατή η αναγνώριση –

ανάγνωση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας αυτού του κλωνοποιημένου DNA. Η

αναγνώριση της αλληλουχίας του DNA αφορούσε μικρά μόρια tRNA με μήκος

περίπου 75-80 νουκλεοτιδίων.[30]

Η αλλαγή θα έρθει από τον Frederick Sanger στα τέλη της δεκαετίας του 1960

όταν και αλλάζει το πεδίο εργασίας του. Μέχρι τότε τον απασχολούσε η αλληλούχιση

των πρωτεϊνών άλλα στρέφει την προσοχή του στην αλληλούχιση μεγαλύτερων

μορίων αναπτύσσοντας μεθόδους γρηγορότερες και απλούστερες. Έτσι προσδιόριζαν

την αλληλουχία του DNA έμμεσα, χρησιμοποιώντας αρχικά την RNA πολυμεράση

Εικ. 16 Φιλμ αλληλούχισης σε gel

πολυακρυλαμίδης με ραδιοϊσότοπα

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


για την σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας RNA από το DNA και στη

συνέχεια αλληλουχώντας αυτή την αλυσίδα του RNA που είχε παραχθεί πριν. [30]

Το 1973 ο Sanger με την ομάδα του σε μια μη δημοσιευμένη τους εργασία

περιγράφουν τον προσδιορισμό δύο νουκλεοτιδικών ακολουθιών αλληλούχισης σε

βακτηριοφάγο του DNA κάνοντας χρήση της DNA πολυμεράσης με συνθετικά

ολιγονουκλεοτίδια. Κατά την μέθοδο αυτή η σύνθεση γίνεται σε κατάλληλο

συμπληρωματικό τμήμα της μονόκλωνης αλυσίδας του DNA όπου θα προστεθούν

τριφωσφορικά νουκλεοσίδια υπό την επίδραση της DNA πολυμεράση στο 3' άκρο

του εκκινητή. Χρησιμοποιώντας ραδιενεργό φώσφορο 32P, δημιουργήθηκε το

ραδιενεργό συμπληρωματικό αντίγραφο της συγκεκριμένης μονόκλωνης περιοχής

του DNA, το οποίο στη συνέχεια αλληλουχίθηκε. [31]

Η πρώτη επιτυχής μέθοδος αλληλούχισης τμημάτων DNA με μήκος μεταξύ 100

και 500 νουκλεοτιδίων αναπτύχθηκε από τον Sanger το 1975 με όνομα συν-πλην

(plus-minus method). Στην μέθοδο αυτή εισάγει κάτι νέο, την ηλεκτροφόρηση σε

πήκτωμα πολυακρυλαμίδης η οποία του επέτρεψε το γρήγορο προσδιορισμό

μεγάλους μέρους της αλληλουχίας του γονιδιώματος του μικρού φάγου φΧ174. [30]

7.1 Η μέθοδος συν-πλην

Στην παρακάτω εικόνα 17 παρουσιάζεται συνοπτικά η αρχή της μεθόδου. Η

εφαρμογή της γίνεται σε ένα υποθετικό μικρό τμήμα μια αλυσίδας του DNA.[32] Σ'

αυτή την μέθοδο αλληλούχισης ο Sanger χρησιμοποιεί DNA πολυμεράση Ι

Escherchia coli και DNA πολυμεράση από βακτηριοφάγο Τ4 με διαφορετικούς

περιορισμούς στην χρήση τριφωσφορικών νουκλεοσιδίων και διαχωρισμό τους με

βάση το μήκος τους με ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμίδης.[33] Η DNA

πολυμεράση Ι αρχικά χρησιμοποιείται για την επιμήκυνση του εκκινητή

ολιγονουκλεοτιδίων αντιγράφοντας παράλληλα το εκμαγείο του DNA υπό την

παρουσία τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων. Να σημειωθεί ότι

μόνο το ένα από τα τέσσερα είδη έχει σημανθεί με 32P.[32] Στην ιδανική περίπτωση

της σύνθεσης δεν θα έπρεπε να είναι συγχρονισμένη. Δηλαδή να είναι όσο το δυνατό

τυχαία έτσι ώστε ο αριθμός των ολιγονουκλεοτιδίων που θα δημιουργηθούν να έχουν

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


διαφορετικό μήκος ξεκινώντας πάντα από τον εκκινητή που έχει δημιουργηθεί. Το

μείγμα αυτό στη συνέχεια θα απαλλαχθεί από τα περιττά τριφωσφορικά

δεοξυριβονουκλεοτίδια που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί και το δείγμα θα υποστεί την

ακόλουθη διαδικασία. [32]

Την διαδικασία που ακολούθησε ο Sanger κατά την “πλην” μέθοδό του έχει

στηριχθεί σε μια αρχή την οποία χρησιμοποίησαν ο Wu και ο Kaiser το 1968 κατά

την οποία η DNA πολυμεράση ενεργεί και συνθέτει τον δεύτερο κλώνο από τον

κλώνο εκμαγείο υπό την απουσία ενός εκ των τεσσάρων τριφωσφορικών

νουκλεοσιδίων. Όταν η σύνθεση φθάσει στο σημείου του dΝΤΡ που απουσιάζει τότε

Εικ. 17 Προσθήκη dNTPs το ένα εκ των οποίων έχει σημανθεί με 32P

Εικ. 18 Η μέθοδος πλήν απουσιάζοντας η Α

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


σταματά η αντιγραφή. [29]

Στο τυχαίο δείγμα που δημιουργήσαμε όπως φαίνεται στην εικόνα 18 τα

ολιγονουκλεοτιδίων συνεχίζουν να είναι υβρισμένα με τον κλώνο εκμαγείο. Υπό την

παρουσία της DNA πολυμεράσης I πραγματοποιείται η διαδικασία της συμπλήρωσης

του κλώνου αυτού υπό την παρουσία των τριών εκ των τεσσάρων dNTP. Αυτή θα

συνεχιστεί μέχρι του σημείου 3' άκρου στο οποίο θα χρειαστεί να τοποθετηθεί το

dNTP το οποίο απουσιάζει. Εκεί η διαδικασία σταματά. Αυτή θα επαναληφθεί ξανά

απουσιάζοντας αυτή την φορά ένα άλλο dNTP μέχρι να πραγματοποιηθεί και για τα

τέσσερα dNTP. [32]

Οι νεοσυσταθέντες κλώνοι θα διαχωριστούν από τον κλώνο εκμαγείο και θα

τοποθετηθούν σε gel πολυακρυλαμίδης για ηλεκτροφόρηση. Εξαιτίας του

διαφορετικού τους μήκους, άρα και μάζας τους θα μετακινηθούν κατά μήκος της

στήλης ξεχωρίζοντας το ένα από το άλλο (όταν διαφέρουν κατά ένα νουκλεοτίδιο)

στην ιδανική των περιπτώσεων. Εξ αιτίας του ραδιοσημασμένου φωσφόρου που

υπάρχει στα ολιγονουκλεοτίδια θα αποτυπωθεί μετά από ραδιοαυτογραφία. Κάθε

γραμμή θα αντιστοιχεί σε μια θέση πριν το νουκλεοτίδιο που απουσιάζει. Συνεπώς η

θέση αυτού του νουκλεοτιδίου μπορεί να προσδιοριστεί. Με την ίδια διαδικασία

μπορούν να προσδιοριστούν οι θέσεις και των υπολοίπων νουκλεοτιδίων. [32]

Η τεχνική αυτή από μόνη της δεν είναι σε θέση να προσδιορίσει πλήρως την

ακολουθία των νουκλεοτιδίων, έτσι μια δεύτερη παρόμοια τεχνική χρησιμοποιείται

Εικ. 19 Η μέθοδος συν υπό της παρουσίας της Α

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


για να την συμπληρώσει. Αυτή είναι μέθοδος “συν” εικ. 19.

Κατά την “συν” μέθοδο γίνεται χρήση μιας μεθοδολογίας κατά την οποία

παρουσία ενός μόνο τριφωσφορικού δεοξυριβονουκλεοτιδίου η DNA πολυμεράση

του βακτυριοφάγου Τ4 είναι σε θέση να μετουσιώσει το δίκλωνο DNA από το 3'

άκρο. Αυτή η δράση εξωνουκλεάσης μπορεί να σταματήσει εξαιτίας της παρουσίας

του ενός τριφωσφορικού που υπάρχει στο μείγμα. Σε τυχαίο μείγμα εφαρμόζεται

αυτή η διαδικασία η οποία περιέχει μόνο το ένα είδος dNTP π.χ. dATP. Υπό την

παρουσία της Τ4 πολυμεράσης και του ενός dNTP όλες οι αλυσίδες σταματούν στη

θέση που υπάρχει το ένα dNTP (η +Α). Οι θέσεις όπου υπάρχουν τα Α θα

προσδιοριστούν με ραδιοαυτογραφία αφού προηγουμένως έχει γίνει ο διαχωρισμός

τους σε gel ακρυλαμίδης. Οι θέσεις αυτές θα είναι πολύ κοντά με αυτές του –Α (θα

απέχουν κατά ένα νουκλεοτίδιο). Αν αυτή η απόσταση είναι μεγαλύτερη αυτό

σημαίνει ότι υπάρχουν περισσότερα του ενός Αs διαδοχικά. Όσο μεγαλύτερη είναι

αυτή η απόσταση τόσο περισσότερες βάσεις υπάρχουν. [32]

Αν μελετήσουμε την εικόνα 20 μπορούμε να προσδιορίσουμε την αλληλουχία των

βάσεων. Ο μικρότερος αριθμός των νουκλεοτιδίων είναι στο -Τ το οποίο υποδεικνύει

την παρουσία στην αμέσως επόμενη θέση της θυμίνης. Αυτό το επιβεβαιώνει η

παρουσία του +Τ στο αμέσως μεγαλύτερο ολιγονουκλεοτίδιο. Από την προσεκτική

παρακολούθηση της εικόνας παρατηρούμε ότι το +Τ έχει την ίδια θέση με το -Α που

Εικ. 20 Συνολικό αποτέλεσμα της συν-πλην μεθόδου

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


δηλώνει ότι στο 3' άκρο ακολουθεί η αδενίνη την θυμίνη. Αυτό θα το επιβεβαιώσει η

θέση του +Α. Ακολούθως το αμέσως μεγαλύτερο νουκλεοτίδιο είναι το C στη

συνέχεια το Α και το C όπως φαίνονται στη ίδια εικόνα.

Εικ 21 Συνολικό αποτέλεσμα αλληλούχισης με την μέθοδο συν-πλην. Στο αριστερά τμήμα

παρατηρούμε την φωτογραφία με τα ραδιενεργά σημασμένα νουκλεοτίδια κα δεξιά η

αποκωδικοποίηση που έχει γίνει στη συνέχεια.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 22 Συνολική παρουσίαση της μεθόδου συν-πλην

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7.2 Η μέθοδος Maxam – Gilbert ή μέθοδος της χημικής

αποικοδόμησης των αλυσίδων του DNA.

Η δεύτερη σημαντική μέθοδος αλληλούχισης εξελίχθηκε από τους Maxam και Gilbert

η οποία δημοσιεύθηκε το 1976 η οποία είναι γνωστή ως “Αλληλούχιση του DNA με

την μέθοδο της χημικής αποικοδόμησης”.[34] Πριν φθάσουν σ' αυτή την επιτυχημένη

τους προσπάθεια οι Maxam και Gilbert το 1973 είχαν την πρώτη τους επιτυχημένη

αλληλούχιση με μικρό αριθμό βάσεων 24 του Lac οπερονίου συγκεκριμένα, η οποία

είναι γνωστή ως ανάλυση του περιπλανώμενου σημείου (Wandering-Spot

Analysis).[35]

Εικ. 23 Διαχωρισμός τμήματος

DNA. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα

200V και 20mA. Το πλακίδιο

εκτέθηκε σε φιλμ για 10 λεπτά.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η δεύτερη βελτιωμένη τους εργασία έκανε την διαφορά ως προς τον αριθμό των

ζευγών βάσεων που αλληλουχίθηκαν. Κατά την μέθοδο αυτή το ένα άκρο του DNA

σημαδεύεται διασπώντας το στη αδενίνη, τη γουανίνη, την κυτοσίνη και την θυμίνη

με χημική επεξεργασία. Η μερική διάσπαση σε κάθε βάση δημιουργεί μια ομάδα

ραδιενεργών τμημάτων που ξεκινούν από το ραδιενεργό άκρο και καταλήγουν σε μια

βάση που επιθυμούμε κάθε φορά.[30] Αλλάζοντας κάθε φορά τα χημικά

αντιδραστήρια η διάσπαση γίνεται και σε διαφορετική θέση (διαφορετική βάση).

Κάνοντας χρήση του ενός αντιδραστηρίου π.χ. 2 Μ NaCl γίνεται επιλεκτικά η

διάσπαση σε κυτοσίνη.

Τα διαφορετικού μήκους προϊόντα της διάσπασης θα τοποθετηθούν σε πήκτωμα

πολυακρυλαμίδης για να διαχωριστούν ανάλογα με το μήκος τους. Η διαδικασία αυτή

θα επαναληφθεί και για τις υπόλοιπες βάσεις παίρνοντας κάθε φορά το φιλμ καμένο

σε διαφορετικές θέσεις. Έτσι τοποθετώντας τα όλα μαζί το ένα δίπλα στο άλλο είναι

εύκολο να προσδιοριστεί η αλληλουχία άμεσα. Αν για παράδειγμα, στο πρώτο δείγμα

το οποίο τελειώνει σε γουανίνη, διαπιστωθεί μετά την αυτοραδιογραφία η παρουσία

τμημάτων με μήκος πέντε, δέκα, και δεκατρία νουκλεοτίδια, καταλήγουμε στο

συμπέρασμα ότι το πέμπτο, το δέκατο και το δέκατο τρίτο είναι γουανίνη. Μ' αυτή

την μέθοδο ο Greg Sutcliffe στο εργαστήριο του Gilbert κατάφερε να αλληλουχίσει

τον ιό SV40 με μήκος 5243 bp και το μικρό πλασμίδιο pBR322 με μήκος 4362.[34]

Εικ.24 Σημεία στα οποία στοχεύουν τα χημικά αντιδραστήρια κατά την μέθοδο

Maxam-Gilbert

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Στα πρώτα πειράματα που έκαναν οι Maxam και Gilbert βρήκαν εμπόδια στο

μήκος-αριθμό των βάσεων που μπορούν να αλληλουχίσουν. Εμπόδιο τους ήταν το

πήκτωμα πολυακρυλαμίδης το οποίο δεν τους επέτρεψε να αλληλουχίσουν τμήματα

που το μήκος τους ήταν μεγαλύτερο από 100 ζεύγη βάσεων από το ραδιοσημασμένο

άκρο.[34]

Ένα από τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου έναντι της “συν – πλην” του

Sanger είναι ότι μπορεί να εφαρμοστεί σε δίκλωνο DNA άλλα απαιτεί τον

διαχωρισμό των δυο κλώνων ή ισοδύναμες ποσότητες από κάθε ένζυμο περιορισμού

η οποία την κάνει ιδιαίτερα επίπονη.

Εικ 25 Αλληλούχιση σε gel πολυακρυλαμίδης συμπληρωματικού κλάδου DNA που τον

αποτελούν 64 bp.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 26 Συνοπτικά τα βήματα που ακολουθούνται κατά την μέθοδο Maxam Gilbert

Διάσπαση του ίδιου τμήματος DNA σε διαφορετικά σημεία που δημιουργούν κομμάτια με

διαφορετικό μέγεθος. Τα κομμάτια αυτά στη συνέχεια θα διαχωριστούν με

ηλεκτροφόρηση. Τα μικρότερα τμήματα διατρέχουν μεγαλύτερη απόσταση και τα

βρίσκουμε στο κάτω τμήμα των διαδρομών της εικόνας.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7.3 Η μέθοδος της διδεοξυαλληλούχισης

7.3.1 Η μέθοδος της διδεοξυ - αλληλούχισης στην αρχική της μορφή

Δύο χρόνια μετά ο Sanger εξελίσσει την μέθοδό του “συν-πλην” με μια νέα η

οποία θα κάνει την μεγάλη διαφορά και θα γίνει η πάγια τεχνική αλληλούχισης

εξαιτίας της καλύτερης απόδοσής της και της χρήση λιγότερων τοξικών υλικών

συγκρίνοντάς την με την μέθοδο των Maxam-Gilbert. Στην συγκεκριμένη τεχνική ο

Sanger έκανε χρήση τριφωσφορικών 2', 3' διδεοξυ νουκλεοτιδίων (ddNTP), τα οποία

προκαλούν τερματισμό της επιμήκυνσης της αλυσίδας του DNA (εικ. 27). [30]

Εικ 27 Η διαφορά μεταξύ δεοξυνουκλεοτιδίου και διδεοξυνουκλεοτιδίου. Η παρουσία του Η

στο ddNTP προκαλεί τον τερματισμό επιμήκυνσης της αλυσίδας του DNA.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Παρασκευάζονται 2΄,3΄-διδεοξυ νουκλεοτίδια (ddNTP) για καθεμία από τις τέσσερις βάσεις. Τα

μόρια αυτά μπορούν να ενσωματωθούν από την DNA πολυμεράση σε ένα νεοσυντιθέµενο κλώνο

DNA, διότι φέρουν την 5΄ τριφωσφορική ομάδα. Παρ’ όλα αυτά, μετά την ενσωμάτωσή τους τα

ddNTP δεν μπορούν να σχηματίσουν φωσφοδιεστερικό δεσμό με το επόμενο dNTP που θα έρθει να

προστεθεί και έτσι η αντιγραφή της συγκεκριμένης αλυσίδας DNA σταματά. (α) Στην αντίδραση

αλληλούχισης με τη μέθοδο του Sanger συμμετέχει ο κλώνος DNA που πρόκειται να αλληλουχιθεί,

ένα τμήμα DNA μικρού μήκους (ο εκκινητής), το οποίο είναι συμπληρωματικό προς την 3΄ περιοχή

αυτού του κλώνου, τα τέσσερα φυσιολογικά dNTP και ένα συγκεκριμένο ddNTP (σε μία προσεκτικά

προσδιορισμένη αναλογία σε σχέση µε τα φυσιολογικά dNTP). Περιλαμβάνεται επίσης μία μικρή

Εικ. 28 Η διαδικασία αλληλούχισης DNA με τη μέθοδο του Sanger, που βασίζεται στη χρήση

διδεοξυνουκλεοτιδίων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


ποσότητα ενός ή περισσότερων ραδιοσημασμένων dNTP, για να είναι δυνατή η ανίχνευση των

νεοσυντιθέμενων μορίων DNA με αυτοραδιογραφία. (β) Προστίθεται DNA πολυμεράση και ξεκινά ο

πολυμερισμός από τον εκκινητή. Όταν σε μία αλυσίδα προστεθεί τυχαία ένα ddNTP, η αλυσίδα αυτή

παύει να αυξάνεται. Αν έχει επιλεχθεί η σωστή αναλογία ddNTP:dNTP, θα προκύψουν πολλοί

διαφορετικοί σημασµένοι κλώνοι, τα μήκη των οποίων θα εξαρτώνται από τη θέση στην οποία

ενσωματώθηκε το ddNTP. (γ) Τα σημασμένα τμήματα που προκύπτουν ως προϊόντα της αντίδρασης

διαχωρίζονται με βάση το μήκος της αλληλουχίας τους σε ένα πήκτωμα ακρυλαμίδης και ακολουθεί

αυτοραδιογραφία. Το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των τμημάτων φανερώνει την αλληλουχία του DNA.

Στις σύγχρονες μεθόδους αλληλούχισης τα προϊόντα εντοπίζονται συνήθως με ανίχνευση του

φθορισμού που εκπέμπουν χρωστικές, οι οποίες είναι συζευγμένες με τα ddNTP. Με τη χρήση

διαφορετικής χρωστικής για κάθε ddNTP, η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί σε μία μόνο

αντίδραση και η ανάλυση να γίνει σε μία μόνο στήλη του πηκτώματος. [30]

Στην εργασία τους οι Sanger et al. αναφέρουν ως παρόμοια μέθοδο το ίδιο

ταχύτατη και απλή σαν τεχνική με την “συν – πλην” με την οποία έγινε εφικτός ο

προσδιορισμός της αλληλούχισης του γονιδιώματος του βακτηριοφάγου φΧ174.

Εξαρτάται από την δράση της πολυμεράσης στο να αντιγράψει συγκεκριμένες

περιοχές του DNA κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Ωστόσο η τεχνική αυτή είναι

μακράν ταχύτερη και απλούστερη από τις άλλες τεχνικές αλληλούχισης.

Μεμονωμένα ούτε η “συν” τεχνική ούτε η “πλην” είναι απόλυτα ακριβείς. Αλλά για

να υπάρχει ακρίβεια στην αλληλούχιση πρέπει να χρησιμοποιηθούν ταυτόχρονα και

μερικές φορές η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων είναι επιβεβλημένη. [36]

Η αρχή πάνω στην οποία στην οποία στηρίχθηκαν ήταν μια εργασία των Atkinson

et al. [37] οι οποίοι απέδειξαν ότι η ανασταλτική δράση της DNA πολυμεράσης Ι στο

τριφωσφορικό 2', 3' διδεοξυνουκλεοτιδίου εξαρτάται από την ενσωμάτωση στον

αυξανόμενο κλάδο του DNA στην θέση του θυμιδιλικού οξέως. Εξ αιτίας της μη

ύπαρξης της 3' – ΟΗ ομάδας στο μόριο του ddNTP η επιμήκυνση της αλυσίδας

σταματά. Αν δημιουργήσουμε μείγμα προς αντιγραφή στο οποίο περιέχονται

εκκινητές, εκμαγεία και οι αντίστοιχες βάσεις ddNTP και dNTP (η μια από τις οποίες

έχει σημανθεί με 32P) παρουσία της DNA πολυμεράσης Ι θα πραγματοποιηθεί η

αντιγραφή του εκμαγείου η οποία θα σταματήσει όταν το 5' άκρο της προηγούμενης

βάσης συμπληρωθεί με μια ddNTP βάση εξ αιτίας μη ύπαρξης της 3'- ΟΗ. Αυτή η

διαδικασία θα επαναληφθεί και με τις άλλες τρεις βάσεις.[36] Σε κάθε ένα από αυτά τα

τέσσερα μείγματα θα προκύψουν πολλές διαφορετικές αλυσίδες που θα έχουν

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


τερματιστεί στο σημείο όπου θα έχει ενσωματωθεί σε αυτές ένα ddNTP. Για να

βρεθεί η αλληλουχία του μορίου τα προϊόντα από τις τέσσερις αντιδράσεις θα

ηλεκτροφορηθούν σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης. Τα μεγαλύτερου μήκους μόρια δεν

θα διατρέξουν μεγάλες αποστάσεις σε σχέση με τα μικρότερου μήκους τα οποία θα

κινηθούν περισσότερο. Έτσι θα διαχωριστούν μεταξύ τους. Η θέση του κάθε μορίου

θα προσδιοριστεί με την διαδικασία της αυτοραδιογραφίας στην οποία θα

εμφανιστούν οι θέσεις τους με την μορφή αμαυρωμένων ζωνών. Τοποθετώντας τα

αποτελέσματα δίπλα - δίπλα καταλήγουμε στην αλληλούχιση.[30]

Η μέθοδος αυτή έχει αρκετά πλεονεκτήματα έναντι της προηγούμενής μεθόδου

του “συν-πλην”. Αρχικά είναι ευκολότερο να την πραγματοποιήσεις διότι δεν απαιτεί

καμιά εκ των προτέρων επέκταση. Απαιτεί την DNA πολυμεράση Ι την οποία είναι

πολύ εύκολο να την προμηθευθεί στην αγορά. Τα αποτελέσματα είναι περισσότερο

ξεκάθαρα και τα αποτελέσματα μπορούν να αξιοποιηθούν ευκολότερα συγκρίνοντας

Εικ. 29 Αυτοραδιογραφία σε gel πολυακρυλαμίδης. Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές Α12d και

Α14. Από τα αριστερά προς τα δεξιά χρησιμοποιήθηκαν ddGTP, ddATP, ddTTP και araCTP.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


την με την “συν-πλην”. Τα ενδιάμεσα νουκλεοτίδια στις διαδρομές εμφανίζονται σαν

ζώνες αποφεύγοντας τα λάθη, εκτιμώντας τον αριθμό των νουκλεοτιδίων που

υπάρχουν σ' αυτή την διαδρομή. Θεωρητικά η ένταση των ζωνών στις διαδρομές μετά

την αυτοραδιογραφία θα περιμέναμε να έχουν την ίδια ένταση αλλά αυτό δεν

συμβαίνει πάντα. Στις περισσότερες περιπτώσεις το πρώτο έχει και την μεγαλύτερη

ένταση αλλά στην περίπτωση του ddCTP το δεύτερο είναι το ισχυρότερο. Ποιο είναι

το αίτιο αυτών των αποτελεσμάτων δεν είναι κατανοητό από τους ερευνητές αλλά δεν

δημιουργούσε και κάποιο πρόβλημα στο να προσδιοριστεί η αλληλουχία των βάσεων.

Για μεγαλύτερες ακολουθίες νουκλεοτιδίων όταν οι ξεχωριστές ζώνες κατά μήκος

των διαδρομών δεν μπορούν να διαχωριστούν η εμπειρία έχει δείξει ότι είναι συχνά

δυνατός ο προσδιορισμός του αριθμού των νουκλεοτιδίων από την ισχύ και το εύρος

των νουκλεοτιδίων. [36]

Με την μέθοδο αυτή μπορούν να βρεθούν αλληλουχίες από 15 έως 200

νουκλεοτίδια από τον εκκινητή και έχουν σημαντική ακρίβεια χρησιμοποιώντας μονό

εκκινητή. Είναι εφικτό να αλληλουχιθούν ακολουθίες με 300 νουκλεοτίδια, κάτω από

συγκεκριμένες συνθήκες.

Το σημαντικότερο μειονέκτημα όμως της μεθόδου είναι η συσσώρευση των

ζωνών οι οποίες προκαλούνται κατά τον σχηματισμό φουρκετών εξ αιτίας του

ζευγαρώματος των βάσεων κατά την ηλεκτροφόρηση τους στο gel ακρυλαμίδης.

Αυτές τις συσσωρεύσεις τις παρατηρούμε στην ίδια θέση ή συχνά πιο κοντά την μια

με την άλλη κατά την ηλεκτροφόρηση. Το συγκεκριμένο πρόβλημα λαμβάνει χώρα

σε διαφορετικές θέσεις όταν ο εκκινητής τοποθετείται στην αντίθετη κατεύθυνση

κατά μήκος του DNA της ίδιας ακολουθίας. Το αποτέλεσμα αυτό το βλέπουμε στην

φωτογραφία (εικ. 31) στην θέση 4330 όπου υπάρχει μια ευρεία ζώνη στο G διάδρομο.

Πιθανότατα δημιουργούνται δεσμοί με τις τέσσερις κυτοσίνες (C) των θέσεων 4323-

4326. Το σημαντικότερο πρόβλημα της μεθόδου ήταν η δυσκολία να βρεθούν όλοι οι

αναστολείς στην αγορά και ιδιαίτερα ο ddGTP.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 30 Συνοπτική παρουσίαση και σύγκριση της μεθόδου Maxam-Gilbert (Α) – Sanger (Β)

και η μεταξύ τους σύγκριση.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7.3.2 Η μέθοδος της διδεοξυαλληλούχισης με χρήση φθορίζουσας ουσίας

Το επόμενο σημαντικό βήμα σε ότι αφορά την αλληλούχιση του DNA

σημειώθηκε όταν ο Leroy Hood ανέπτυξε μια μέθοδο σήμανσης του ddNTP με

Εικ. 31 Αυτοραδιογραφία με εκκινητές R4 σε κλώνο ΦΧ174 DNA. Παρατηρούμε την ευρεία

ζώνη στην θέση 4330.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


χρωστική φθορίζουσα ουσία διαφορετικού χρώματος για το κάθε νουκλεοτίδιο.[30]

Σκοπός τους ήταν να βελτιωθούν οι υπάρχουσες τεχνικές οι οποίες είχαν τον ίδιο

περίπου κορμό. Τα αποτελέσματα και της ενζυμικής μεθόδου αλλά και της χημικής

θα πρέπει να οδηγηθούν σε gel πολυακρυλαμίδης τα τμήματα θα διαχωριστούν

ανάλογα με το μήκος τους και θα προσδιοριστεί η αλληλουχία αφού αυτά τα

αποτελέσματα οδηγηθούν στην συσκευή της ραδιοαυτογραφίας.[39] Και οι δύο

τεχνικές είναι πολύ αποτελεσματικές αλλά επίπονες με ιδιαίτερα αυξημένο κόστος, με

επικινδυνότητα και με αστάθεια τους εξαιτίας των ραδιοϊσοτόπων που

χρησιμοποιούνται για την ραδιοαυτογραφία.[38] Με αυτή την μέθοδο μπορούσε να

πραγματοποιηθεί μια μόνο αντίδραση παρουσία και των τεσσάρων ddNTP καθώς

ήταν δυνατή η διάκριση των τμημάτων που τελείωναν σε καθένα από τα τέσσερα

ddNTP. Έτσι είναι εφικτή η αλληλούχιση σε πραγματικό χρόνο με την χρήση

ηλεκτρονικών υπολογιστών. Από τις δύο τεχνικές επέλεξαν την τεχνική του Sanger.

Εικ. 32 Πως γίνεται η αλληλούχιση του DNA. a.Η DNA πολυμεράση αντιγράφει τον κλώνο

εκμαγείο. b. Η εισαγωγή βάσης με διδέοξυνουκλεοτιδο σταματά την διαδικασία. Κάθε κλάδος

έχει διαφορετικό μήκος. Το κάθε τμήμα διαχωρίζεται με βάση το μέγεθος του . Τα μικρότερου

μήκους τμήματα είναι στην βάση της εικόνας διότι έχουν διατρέξει μεγαλύτερη απόσταση

ένατη των μεγαλυτέρων που διατρέχουν μικρότερη. c. Ο κάθε τερματικός όρος έχει σημανθεί

με δείκτη διαφορετικού χρώματος ώστε να είναι εύκολος ο διαχωρισμός των βάσεων. d. Η

αλληλούχιση μετά από εξεργασία των δεδομένων από ηλεκτρονικό υπολογιστή παρουσιάζεται.

Κάθε κορυφή αντιστοιχεί και σε ένα νουκλεοτίδιο.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Σ' αυτή χρησιμοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε νουκλεοτίδια στα οποία τοποθετήθηκαν

διαφορετικού χρώματος φθορίζουσες ουσίες.

Η χρήση χρωμάτων εξυπηρετούσε τον ένα από τους σκοπούς που είχαν θέσει. Ο

πρώτος από αυτούς ήταν να αναλυθούν τα δεδομένα με χρήση ηλεκτρονικών

υπολογιστών με τους οποίους θα επιτύγχαναν την επιθυμητή ακρίβεια. Με αυτή την

διαδικασία θα ήταν δυνατή η μεταφορά των δεδομένων σε πραγματικό χρόνο με ένα

ακόμη σημαντικό αποτέλεσμα την μείωση της κούρασης που την προκαλούσε η

επανειλημμένη μελέτη των φιλμ της αυτοραδιογραφίας. Αντ' αυτού η χρήση ενός και

μόνο gel ηλεκτροφόρησης λαμβάνεται μια διαχωρισμένη ακολουθία

νουκλεοτιδίων.[38]

Ο δεύτερος σκοπός τους ήταν να μην χρησιμοποιήσουν ραδιενεργά υλικά τα

οποία είναι και επικίνδυνα, κοστίζουν ακριβά και είναι ασταθή. Έχοντας στο μυαλό

τους τα παραπάνω, εξέλιξαν την τεχνική του Sanger με κύριο σκοπό τους την

αυτοματοποίηση της διαδικασίας η οποία βασίστηκε στου δύο σκοπούς που

αναφέρθηκα ήδη. Βασίστηκαν στον φθορισμό για τον προσδιορισμό των

νουκλεοτιδίων αλληλουχιών αντί της ακτινοβολίας. Με τον φθορισμό επιτυγχάνεις

αυξημένη ευαισθησία για παρατήρηση των αποτελεσμάτων σε πραγματικό χρόνο για

μικρές ποσότητες του DNA που υπάρχουν στις διαδρομές αλληλούχισης του DNA (~

10-15 mol/ζώνη). Επόμενο πλεονέκτημα της νέας μεθόδου ήταν η χρήση τεσσάρων

διαφορετικών χρωμάτων για κάθε ένα διαφορετικό είδος νουκλεοτιδίου - βάσης. Τα

προϊόντα που θα παραχθούν όπως περιγράφει η μέθοδος του Sanger θα συν-

ηλεκτροφορηθούν και τα τμήματα του DNA που θα παραχθούν από κάθε αντίδραση

θα αναγνωριστούν από το χρώμα τους. Τα δεδομένα θα επιβεβαιωθούν και θα

αποθηκευθούν σε ηλεκτρονικούς υπολογιστές και αναλυθούν για τον προσδιορισμό

της ακολουθίας. Η παρακάτω εικόνα 33 περιγράφει απλοποιημένα την διαδικασία

που ακολουθήθηκε.[38]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ένα από τα ερωτήματα τα οποία αναδύονται είναι πώς μπορεί να γίνει σύγκριση

μεταξύ της ευαισθησίας της μεθόδου με φθορισμό και αυτής με ραδιοαυτογραφία. Η

σύγκρισή τους δεν είναι μια εύκολη διαδικασία. Συγκεκριμένα με την μέθοδο της

ραδιοαυτογραφίας το αποτέλεσμα που προκύπτει από την αμαύρωση του φιλμ γίνεται

όλο και πιο έντονο με το πέρασμα του χρόνου. Σε αντίθεση η μέθοδος του φθορισμού

που χρησιμοποιεί λήψεις σε πραγματικό χρόνο η ικανότητα να κάνουν σωστή λήψη

του φωτεινού σήματος είναι σημαντικά μικρότερη. Αίτιο είναι η μικρή χρονική

απόσταση μεταξύ των λήψεων του σήματος. Αν κάποιος παραλείψει αυτή την

παράμετρο σφάλματος είναι φανερό ότι η μέθοδος της αυτοραδιογραφίας έχει

Εικ. 33 α. Απλοποιημένο διάγραμμα αλληλούχισης b. Έξοδος των αποτελεσμάτων μετά

από εξεργασία με Η/Υ

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


μεγαλύτερη ακρίβεια.

Η μέθοδος αλληλούχισης του Sanger μπορούσε να δώσει αποτελέσματα αλλά δεν

μπορούσε να φθάσει σε ένα σημαντικό αριθμό νουκλεοτιδίων μετά του εκκινητές το

πολύ μέχρι 100 nt -1000 nt. Ελάχιστα προϊόντα παράγονται πέρα από αυτό τον

αριθμό εξαιτίας του τερματισμού της αλυσίδας του DNA.[40] Έτσι για να

αλληλουχιθούν μεγαλύτερα τμήματα του DNA απαιτείται μια ιδιαίτερη μέθοδος. Μια

μέθοδος που θα μπορούσε να ακολουθηθεί θα ήταν η σύνθεση νέων εκκινητών οι

οποίο θα συνεχίζουν την αλληλούχιση από εκεί που σταματούν οι προηγούμενοι και

η διαδικασία επαναλαμβάνεται. Είναι μια ικανοποιητική λύση αλλά αυτό που θα

πετυχαίναμε θα ήταν να αλληλουχιθούν 500 βάσεις σε μια ημέρα. Με αυτή την

ταχύτητα η αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος που αποτελείται από

δισεκατομμύρια βάσεις θα ήταν ακατόρθωτη. [41]

7.4 Μαζική Αλληλούχιση Shotgun

Μια άλλη προσέγγιση που θα μπορούσε να πετύχει την αλληλούχιση μεγάλων

ποσοτήτων του DNA όπως ολόκληρου του DNA του ανθρώπου είναι η αλληλούχιση

Shotgun (μαζική αλληλούχιση). Με αυτή την διαδικασία το DNA αρχικά χωρίζεται

σε μικρότερα κομμάτια – θραύσματα τα οποία μπορούν να αλληλουχιθούν

μεμονωμένα. Η αλληλουχίες αυτών των θραυσμάτων στην συνέχεια μπορούν να

επανασυναρμολογηθούν στην αρχική τους αλληλουχία βασιζόμενοι στις επικαλύψεις

που θα υπάρχουν με τα διαδοχικά κομμάτια. Έτσι μπορεί να επιτευχθεί η πλήρης

αλληλουχία των βάσεων του γονιδιώματος. [42]

Το σημαντικότερο πρόβλημα της μεθόδου είναι ο τρόπος με τον οποίο θα γίνει ο

τεμαχισμός ο οποίος μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού ή

μηχανικά. Η τοποθέτηση των επικαλυπτόμενων τμημάτων στη σειρά μπορεί να γίνει

χρησιμοποιώντας Η/Υ. Για την περίπτωση του ανθρώπινου γονιδιώματος, του οποίο

το μήκος είναι τεράστιο, απαιτείται υπερύψηλη τεχνολογία. [41]

Κατά την διαδικασία αυτή τα κομμάτια που δημιουργούνται έχουν το επιθυμητό

μήκος το οποίο είναι 1000 βάσεων (bp) τα οποία τοποθετούνται σε ένα φορέα

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


κλωνοποίησης. [41]

Οι βιβλιοθήκες που δημιουργούνται παίρνονται τυχαία και αλληλουχούνται,

δημιουργώντας μια βάση αλληλουχιών. Αυτές στη συνέχεια συναρμολογούνται ώστε

να δημιουργήσουν μια συνεχόμενη ακολουθία δημιουργώντας μια πλήρη

ακολουθία.[41]

Κατά την συνεχόμενη αλληλούχιση ξεκινούμε από το πρωτότυπο δίκλωνο DNA

το οποίο φαίνεται με κόκκινο και πράσινο χρώμα στην παρακάτω φωτογραφία 36.

Αυτό διασπάται σε μικρότερα τμήματα τα οποία κλωνοποιούνται σε πλασμίδια. Είναι

σημαντικό τα θραύσματα να επικαλύπτουν το ένα το άλλο και να αλληλουχιθούν και

οι δύο κλώνοι του DNA. Αν και αυτό μπορεί να θεωρηθεί ως χάσιμο χρόνου

σύμφωνα με τους κανόνες ζευγαρώματος των βάσεων από τους Watson-Crick το

βέβαιο είναι ότι περιοχές του ενός κλώνου είναι δύσκολο να αλληλουχιθούν με

ακρίβεια λόγω τοπικού σχηματισμού δευτεροταγούς δομής. Στον άλλο κλώνο όμως

δεν θα υπάρξουν προβλήματα. Χρησιμοποιώντας εκκινητές από τα αντίθετα άκρα

Εικ. 34 Το τμήμα προς αλληλούχιση τεμαχίζεται στο επιθυμητό μήκος.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


είναι δυνατό να δοθεί ακολουθία και από τους δύο κλώνους.[44] Έχοντας

αλληλουχίσει έναν αριθμό κομματιών ο Η/Υ είναι σε θέση να βρει τις περιοχές

αλληλοεπικάλυψης και να τις τοποθετήσει σε μια σειρά δημιουργώντας την πλήρη

ακολουθία.

Οι αντιδράσεις αλληλούχισης πραγματοποιούνται με ενιαίους εκκινητές με τυχαία

επιλογή των κλώνων από αυτούς που δημιουργήθηκαν. Οι αλληλουχίες που πήραμε

τοποθετούνται στη σειρά αναγνωρίζοντας τα κενά που θα δημιουργηθούν (εκεί όπου

δεν υπάρχει διαθέσιμη αλληλουχία) και τις μονόκλωνες περιοχές (όπου υπάρχει

αλληλουχία μόνο από τον ένα κλώνο). Το ιδανικό μήκος που θα πρέπει να έχουν

αυτές οι περιοχές πρέπει να είναι τριπλάσιο του μήκους που πρέπει να έχουν οι

περιοχές που πρόκειται να αλληλουχιθούν. Το περιττό αν το ονομάσουμε τμήμα

αντιστοιχεί στην περιοχή επικάλυψης. Αυτές οι περιοχές στη συνέχεια θα

Εικ. 36 Η αλληλούχιση γίνεται και στους δύο κλώνους για να μην δημιουργηθούν κενά.

Εικ. 35 Τα τμήματα κλωνοποιούνται σε φορείς

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αλληλουχιθούν στοχευμένα έτσι ώστε να παραχθεί η πλήρης αλληλούχιση του

μορίου. [45]

Εικ. 37 Σφάλματα κατά την αλληλούχιση. Τα σημεία αυτά σε δεύτερη επανάληψη θα

επιλεχθούν κατάλληλα για να αλληλουχιθούν

Εικ. 38 Παράδειγμα μαζικής αλληλούχισης.

Φάση Ι. Τυχαία φάση

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 39. Φάση ΙΙ. Τακτοποίηση ευθυγράμμιση, Φάση ΙΙΙ. Τελική φάση

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


7.5 Η μέθοδος της πυραλληλούχισης (ή προσδιορισμός

αλληλούχισης μέσω πυροφωσφορικού)

Όλα ξεκινούν από την ανάγκη για μια νέα μέθοδο αλληλούχισης η οποία να είναι

ευκολότερη, γρηγορότερη αλλά και οικονομικότερη από την ευρέως διαδεδομένη

μέθοδο του Sanger.[46] Τον Ιανουάριο του 1986 κατά την διάρκεια μια απογευματινής

βόλτας που πραγματοποιούσε ο Pål Nyrén έκανε την εξής σκέψη για μια εναλλακτική

μέθοδο αλληλούχισης. Στην μέθοδο του Sanger η όλη διαδικασία έπρεπε να γίνεται

χειροκίνητα, χρησιμοποιώντας ραδιενεργά σημασμένα νουκλεοτίδια και

κατασκευασμένες στο χέρι διαδρομές με gel ακρυλαμίδης για τον διαχωρισμό των

νουκλεοτιδίων. Η μέθοδος ήταν επίπονη και ιδιαιτέρα χρονοβόρα απαιτώντας

εβδομάδες πρακτικής εξάσκησης στο να γνωρίζεις με ιδιαίτερη λεπτομέρεια το κάθε

της βήμα. Θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε την δραστικότητα της DNA

πολυμεράσης κατά την διάρκεια της προσθήκης των νουκλεοτιδίων στον ένα κλάδο

του DNA αναλύοντας την ποσότητα του πυροφωσφορικού που απελευθερώνεται. [47]

Κατά την διάρκεια του διδακτορικού που πραγματοποιούσε εργάστηκε στην

απομόνωση και την μελέτη ενός ενδογενούς ενζύμου σε ένα φωτοσυνθετικό

βακτήριο. Το ένζυμο proton-translocating inorganic pyrophosphatase εμπλέκεται

στην φωτοφωσφορυλίωση κατά την οποία καταλύτης είναι το φως με το οποίο

συντίθεται πυροφωσφορικό. Η μεγάλη επανάσταση για την εξέλιξη της μεθόδου ήταν

η βελτίωση μιας λουμινομετρικής μεθόδου η οποία ήταν σε θέση να ακολουθεί την

σύνθεση του πυροφωσφορικού σε πραγματικό χρόνο.[48] Η νέα ιδέα ήταν να

ακολουθηθεί η δραστικότητα της DNA πολυμεράσης χρησιμοποιώντας την

πυροφωσφορική μέθοδο. Έτσι θα ήταν εφικτή η παρακολούθηση της ενσωμάτωσης ή

όχι μιας βάσης στον κλώνο του DNA κατά την διάρκεια της σύνθεση του.[47]

Έτσι θα ήταν εύκολη η αποκρυπτογράφηση του πρότυπου κλώνου κατά την

προσθήκη ενός γνωστού νουκλεοτιδίου. Οι προσπάθειες του Nyrén για την ανάδειξη

της μεθόδου που είχε σκεφτεί δεν βρήκαν πρόσφορο έδαφος εξ αρχής. Έτσι

αναγκάστηκε να χάσει αρκετά χρόνια μέχρι την επιβεβαίωση της μεθόδου του. Αλλά

ακόμα και τότε δεν μπορούσε να βρει την κατάλληλη χρηματοδότηση για την

παραπέρα συνέχιση της έρευνάς του. Η μέθοδος αυτή είχε μεγαλύτερη ευαισθησία

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


συγκρινόμενη με άλλες μεθόδους που είχαν εξελιχθεί την ίδια περίπου περίοδο. [47]

Η διαδικασία στην οποία είχε καταλήξει για την πραγματοποίηση της μεθόδου

του παρουσιάζεται στην παρακάτω εικόνα 40.

Κατά το πρώτο βήμα κάθε πιθανό νουκλεοτίδιο προσπαθεί να προστεθεί στην

αντίδραση πολυμερισμού.[49] Θα πρέπει να σημειωθεί ότι κάθε φορά ένα είδος

νουκλεοτιδίου προστίθεται κατά την διαδικασία της συμπλήρωσης του κλάδου. Όταν

προσληφθεί κάποιο από αυτά (dATP, dCTP, DGTP ή dTTP) από την DNA

πολυμεράση θα απελευθερωθεί πυροφωσφορικό PPi. Το ελεύθερο αυτό

πυροφωσφορικό θα μετατραπεί σε ATP (τριφωσφορική αδενοσίνη) από την ATP

σουλφουρυλάση.[50] Η ATP σουλφουρυλάση προέρχεται από την ανασυνδυασμένη

μορφή από την ζύμη Saccharomyces cerevisiae. Στη συνέχεια η τριφωσφορική

αδενοσίνη με την παρουσία λουσιφερίνης και την καταλυτική δράση της

λουσιφεράσης των πυγολαμπίδων της Αμερικής (Photinus pyralis) μετατρέπεται σε

οξυλουσιφερίνη με παράλληλη εκπομπή φωτός. Η παραγωγή των εκπεμπόμενων

φωτονίων σε κάθε συμπλήρωση της αλυσίδας του DNA είναι ανάλογη του αριθμού

Εικ. 40 Τα τέσσερα είδη dNTP προσθέτονται διαδοχικά. Αν

γίνει η προσθήκη θα απελευθερωθεί PPi το οποίο αντιδρά με

την σουλφουριλάση και την λουσιφεράση διαδοχικά

παράγοντας φως. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται με άλλο

dNTP. To dNTP που δεν θα ενσωματωθεί, θα αποικοδομηθεί.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


των νουκλεοτιδίων που θα συνδεθούν κατά την διαδικασία αυτή.[51] Με μια

ιδιαιτερότητα, τα παραγόμενα φωτόνια είναι ανάλογα του αριθμούν των

νουκλεοτιδίων που συνδέονται μόνο όταν ο αριθμός τους είναι μικρός.

Αυτό το φωτεινό σήμα είναι η βάση πάνω στην οποία θα γίνει και η αλληλούχιση

του δεδομένου τμήματος. Συγκεκριμένα μετρώντας το ύψος του παραγόμενου

φωτεινού σήματος είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε τον αριθμό των νουκλεοτιδίων

Εικ. 41 Διάγραμμα μετά από πυροαλληλούχιση. Το λαμβάνουμε κατά την αλληλούχιση

με πυροφωσφορικό. Το ύψος της κάθε κορυφής είναι ανάλογο του αριθμού των

νουκλεοτιδίων που ενσωματώνονται κατά την διαδικασία. Σύγκριση μεταξύ

αλληλούχισης με ssDNA (b) και dsDNA (a).

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


που συνδέθηκαν σ’ αυτό τον κύκλο όπως φαίνεται στην εικόνα 39. [52]

Το ποσό του εκπεμπόμενου φωτεινού σήματος που θα ληφθεί σ’ αυτό τον κύκλο

είμαστε σε θέση να το μετρήσουμε με μια (ADP) φωτοδίοδο χιονοστιβάδων, με

φωτοπολλαπλασιαστικό σωλήνα ή ακόμα και με μια CCD κάμερα.

7.5.1 Στρατηγικές της πυροαλληλούχισης

Η πυροαλληλούχιση μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο βασικές μεθόδους

(προσεγγίσεις) οι οποίες εξελίχθηκαν με μια χρονική διαφορά περίπου δύο χρόνων.

Την πρώτη από αυτές την ονομάζουμε αλληλούχιση στερεάς φάσης και την δεύτερη

αλληλούχιση υγρής φάσης.[50]

Κατά την αλληλούχιση στερεάς φάσης απαιτείται μείγμα τριών ενζύμων τα οποία

βοηθούν στην απομάκρυνση – έκπλυση των περιττών νουκλεοτιδίων, δηλαδή των

νουκλεοτιδίων που δεν χρησιμοποιήθηκαν – συνδέθηκαν με την αλυσίδα κατά την

Εικ. 42 Σχηματική απόδοση της αλληλούχισης στερεάς φάσης. Τέσσερα διαφορετικά

νουκλεοτίδια προστίθενται κάθε φορά στο ακινητοποιημένο εκκινητή. Η διαδικασία γίνεται

παρουσία του ενζύμου ATP σουλφουράση και λουσιφεράση. Μετά την ολοκλήρωση κάθε

βήματος τα εναπομείναντα απομακρύνονται με πλύση για την αποφυγή σφαλμάτων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


περίοδο δράσης της DNA πολυμεράσης και της τριφωσφορικής αδενοσίνης που

απέμεινε κατά την δράση της σουλφουρυλάσης. [53]

Εναλλακτικά κατά την συγκεκριμένη προσέγγιση το εκμαγείο μπορεί να

προσδεθεί σε ένα στερεό υπόστρωμα (όπως για παράδειγμα σε ένα μαγνητικό

μικροσφαιρίδιο) με το οποίο θα αποφευχθεί η μείωση του εκπεμπόμενου σήματος. [33]

Κατά την αλληλούχιση υγρής φάσης (μείγμα τεσσάρων διαφορετικών ενζύμων

ένα για κάθε διαφορετικό νουκλεοτίδιο) χρησιμοποιώντας ένζυμα πέψης (όπως η

απυράση) των νουκλεοτιδίων που δεν ενσωματώθηκαν για να παραλειφθεί το στάδιο

της έκπλυσης. Κατά την διαδικασία αυτή απομακρύνονται τα νουκλεοτίδια που δεν

χρησιμοποιήθηκαν καθώς και το εναπομένων ATP (τριφωσφορική αδενοσίνη). [54]

Στην φάση αυτή τα ένζυμα πέψης που επιδρούν πρέπει να έχουν τις ακόλουθες

ιδιότητες:

Αρχικά τα ένζυμα πρέπει να υδρολύσουν όλο τα τριφωσφορικά

δέοξυνουκλεοτιδια με τον ίδιο περίπου ρυθμό. Δεύτερον θα πρέπει να υδρολύσουν το

ATP που απέμεινε από το κύκλο δράσης έτσι ώστε να αποφευχθεί η μεγάλη

συγκέντρωσή του μεταξύ των κύκλων. Τρίτον ο χρόνος αποικοδόμησης των

νουκλεοτιδίων από τα ένζυμα πέψης πρέπει να είναι πιο αργός από την ενσωμάτωση

των νουκλεοτιδίων από την DNA πολυμεράση. Είναι επίσης ιδιαιτέρα σημαντικό ότι

η απόδοση της ενσωμάτωσης των εκκινητών [54]

Το 2000 ο Ronaghi πρότεινε μια νέα μέθοδο χρησιμοποιώντας μονόκλωνο DNA

στο οποίο θα προσδένονται πρωτεΐνες.[55] Συγκεκριμένα αυτές οι πρωτεΐνες

αντικαθιστούν τους εκκινητές οι οποίοι προσδέθηκαν σε συγκεκριμένες θέσεις του

DNA έτσι ελαχιστοποιούν τα μη ειδικά σήματα. Η μέθοδος αυξάνει την ικανότητα

των ενζύμων. Μειώνει την πιθανότητα να χαθούν οι εκκινήσεις, αυξάνει την ένταση

του σήματος, επιτυγχάνει μεγαλύτερη ακρίβεια στην αναγνώριση όμοιων

νουκλεοτιδίων και πετυχαίνει αναγνώριση περισσότερων από 30 νουκλεοτίδια.

Η Προετοιμασία των εκμαγείων είναι χρονοβόρα εξ αιτίας του ότι το μονόκλωνο

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


DNA θα πρέπει να πολλαπλασιαστεί με PDR Το 2000 ο Nordstrorm πρότεινε μια

απλούστερη ενζυμική μεθοδολογία για την προετοιμασία των εκμαγείων όχι του

μονόκλωνου DNA αλλά του δίκλωνου κατά την οποία μπορεί να πετύχει

μεγαλύτερης ακρίβειας αποτελέσματα χρησιμοποιώντας διάφορους συνδυασμούς

ενζύμων.[55,56]

7.5.2 Προετοιμασία των εκμαγείων για την πυροαλληλούχιση

Η δημιουργία του πρότυπου δεν είναι μια δύσκολή διαδικασία. Με χρήση της

μεθόδου PCR θα παραχθούν τα εκμαγεία τα οποία στη συνέχεια θα καθαριστούν πριν

την διαδικασία της πυροαλληλούχιση. Τα μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια και οι

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR θα πρέπει να απομακρυνθούν πριν την

έναρξη της πυροαλληλούχισης διότι η παρουσία τους διαταράσσει την αντίδραση. Τα

άλατα που υπάρχουν κατά την διάρκεια της PCR αντίδρασης πρέπει να αφαιρεθούν ή

Εικ. 43 Αναπαράσταση της διαδικασίας της ενζυμικής αντίδρασης στην πυραλληλούχιση

υγρής φάσης. Εκμαγείο DNA στο οποίο έχουν προστεθεί τέσσερα ένζυμα που επιρεάζουν την

διαδικασία. Τα τέσσερα διαφορετικά νουκλεοτίδια προστίθενται σταδιακά και

ενσωματώνονται υπό την επίδραση ATP σουλφουράσης και λουσιφεράσης. Τα νουκλεοτίδια

καταστρέφονται υπό την επίδραση ενός ενζύμου επιτρέποντας την προσθήκη του επόμενου

νουκλεοτιδίου

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


να αραιωθούν διότι αναστέλλουν την δραστικότητα των ενζύμων. [50]

7.5.3 Επεκτείνοντας το μήκος αλληλούχισης με την μέθοδο της

Πυροαλληλούχισης

Υπάρχει ένα τεράστιο πλήθος από εφαρμογές όπως η αλληλούχιση του

ανθρώπινου αλλά και άλλων γονιδιωμάτων καθώς επίσης η αλληλούχιση γονιδίων,

όπου επιθυμούμε να τα έχουμε αναγνώσει. Για πραγματοποιηθεί η μεγάλου μήκους

πυραλληλούχιση θα πρέπει να ικανοποιηθούν αρκετές προϋποθέσεις ταυτόχρονα.

Αρχικά το σύστημα των ενζύμων θα πρέπει να είναι σταθερό, θα πρέπει να

υπάρχει μικρή πιθανότητα λάθους ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων και η επέκταση των

νουκλεοτιδίων να είναι ταυτόχρονη. Το σύστημα των ενζύμων δείχνει να είναι

σταθερό στο δικό του σύστημα κατά την αντίδραση της αλληλούχισης καθώς η

ένταση του λαμβανόμενου σήματος δείχνει να είναι σταθερή κατά την προσθήκη

κάθε επιμέρους νουκλεοτιδίου εικ. 43. [50]

Στην περίπτωση που εργαστούμε με τέσσερα ένζυμα η καταστροφή όλων αυτών

Εικ. 44Αναπαράσταση αυτοματοποιημένου συστήματος αλληλούχισης υγρής φάσης. Τέσσερις

κατανομείς κινούνται στις δύο διαστάσεις προσθέτοντας νουκλεοτίδια. Το πλαίσιο αναδεύεται

συνεχώς . ΤΟ παραγόμενο φως ανιχνεύεται από CCD κάμερα.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


των παραγόντων που επηρεάζουν αρνητικά την αλληλούχιση και μειώνοντας την, το

φαινόμενο της αραίωσης μπορεί να οδηγήσει μέχρι και στην αλληλούχιση 200

βάσεων.[50] Παρά το γεγονός ότι στην περίπτωση πυραλληλούχισης υπάρχουν σήματα

θορύβου κατά την μέτρηση, η λανθασμένη ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων είναι το

σημαντικότερο πρόβλημα στην αλληλούχιση μεγάλου αριθμού νουκλεοτιδίων.

Πιθανότατα η λανθασμένη ενσωμάτωση οδηγεί σε τερματισμό των εκκινητήριων

κλώνων οι οποίοι έχουν ως αποτέλεσμα την μείωση του εκπεμπόμενου σήματος κατά

την αλληλούχιση.

7.5.4 Εφαρμογές της πυραλληλούχισης

Η πυραλληλούχιση άνοιξε νέους δρόμους στην αλληλούχιση του DNA. Με το

αυτοματοποιημένο σύστημα PSQ 96 επέτρεψε στην τεχνική να πραγματοποιηθούν

υψηλής ποιότητας αναλύσεις. Μερικές από αυτές είναι οι παρακάτω.

7.5.4.1 Γονοτυποποίηση πολυμορφισμών μεμονωμένων νουκλεοτιδίων.

Για την αλληλούχιση πολυμορφισμών μεμονωμένων νουκλεοτιδίων (SNPs) με

την πυροαλληλούχιση το 3’ άκρο του εκκινητή σχεδιάζεται με τρόπο τέτοιο ώστε να

υβριδοποιείται κατά ένα ή και περισσότερα νουκλεοτίδια πριν την θέση του

Εικ. 45 Πυρόγραμμα. Το ύψος του κάθε νουκλεοτιδίου αντιστοιχεί στον αριθμό που

ενσωματώθηκε.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


πολυμορφισμού. Ένα ιδιαίτερο γνώρισμα των πυροδιαγραμμάτων κατά την ανάλυση

SNP είναι ο πλήρης διαχωρισμός των διαφορετικών γογοτύπων. Κάθε συνδυασμός

αλληλόμορφων (ομόζυγων ή ετερόζυγων) μπορεί να δώσει ένα συγκεκριμένο μοτίβο

συγκρινόμενο με τις δύο άλλες παραλλαγές. [57, 58]

7.5.4.2 Αναγνώριση μικροβίων

Οι ιχνηθέτες του DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για της περιοχές ενός

μικροβίου που παραμένουν αμετάβλητες αλλά και για τις περιοχές που έχουν

μεταβληθεί. Ξεκινώντας από μια περιοχή η οποία είναι διατηρημένη ή δεν έχει

υποστεί πολλές αλλαγές είναι εφικτό να προσδιοριστεί η μη διατηρημένη περιοχή. Ας

πάρουμε ως παράδειγμα το βακτήριο 16S rRNA το οποίο χρησιμοποιείται για την

αναγνώριση διαφόρων ειδών στελεχών. Αλληλουχώντας 20-100 νουκλεοτίδια στο

16S rRNA είναι δυνατή η ταξινόμηση διαφόρων βακτηρίων από τα οποία είμαστε σε

θέση αν πάρουμε πληροφορίες για τα στελέχη τους. [59]

7.5.4.3 Επαναλληλούχιση

Η πυραλληλούχιση λόγω της αυξημένης ταχύτητας με την οποίο μπορούμε να

πάρουμε αποτελέσματα είμαστε σε θέση να συγκρίνουμε τα νεότερα αποτελέσματα

με τα παλαιότερα για πιθανές μεταλλάξεις που μπορεί να έχουν πραγματοποιηθεί. Με

βάση αυτή την μέθοδο προσδιορίστηκαν επιτυχώς και ποσοτικώς οι μεταλλάξεις του

γονιδίου καταστολέα του καρκίνου p53.[60]

8 Next Generation Sequencing (NGS) Αλληλούχιση

Επόμενης Γενιάς

Η αλληλούχιση του DNA και του RNA έγινε επιτακτικής ανάγκης τα επόμενα

χρόνια. Η επιθυμία να αλληλουχιθούν μόρια που περιέχουν μεγαλύτερους αριθμούς

βάσεων με μικρότερο κόστος και σε συντομότερο χρονικό διάστημα έκανε ολοένα

και περισσότερους επιστήμονες να στραφούν σ’ αυτό τον τομέα της βιολογίας.

Συγκεκριμένα την δεκαετία του 2000 η αλληλούχιση νουκλεϊκών οξέων αυξήθηκε

εκθετικά και η μεθοδολογία της αλληλούχισης έγινε απαραίτητη στα ανά την υφήλιο

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


ερευνητικά εργαστήρια. Η μεγαλύτερη πρόκληση για την αλληλούχιση του DNA

ήταν το σχέδιο του ανθρώπινου γονιδιώματος το οποίο κόστιζε 3 δισεκατομμύρια

Δολάρια των ΗΠΑ και θα διαρκούσε 13 χρόνια. Το πρόγραμμα αυτό

πραγματοποιήθηκε βασιζόμενο στην μέθοδο του Sanger.[61]

Αυτό που όλοι επιθυμούσαν μετά την ολοκλήρωση του προγράμματος του

ανθρώπινου γονιδιώματος ήταν μια νέα μέθοδο η οποία θα είχε μικρότερο κόστος με

ταυτόχρονη αύξηση της ταχύτητας της μεθόδου. Αποτέλεσμα αυτών των πιέσεων

ήταν η ανάπτυξη νέων μεθόδων προσδιορισμού της αλληλούχισης δεύτερης γενιάς ή

αλληλούχισης επόμενης γενιάς όπως επικράτησε να λέγεται.

Με τις μεθόδους επόμενης γενιάς είμαστε σε θέση να πραγματοποιήσουμε μαζικά

παράλληλες αλληλουχίες κατά τις οποίες εκατομμύρια νουκλεοτίδια από ένα απλό

δείγμα μπορούν να αναγνωριστούν. [62]

Με την μαζική παράλληλη αλληλούχιση επιτυγχάνουμε αλληλούχιση υψηλής

απόδοσης η οποία μας επιτρέπει να γνωρίσουμε ολόκληρη την αλληλουχία ενός

γονιδιώματος σε λιγότερο από μια ημέρα. Πολλές μέθοδοι αλληλούχισης επόμενης

γενιάς εξελίχτηκαν οι οποίες έχουν χαμηλό κόστος και υψηλή απόδοση. Έτσι η

αλληλούχιση έγινε προσιτή σε περισσότερα εργαστήρια, αυξάνοντας τον αριθμό των

ερευνητικών προγραμμάτων και της κλινικής διάγνωσης που μπορεί να επιτευχθεί με

την αλληλούχιση νουκλεϊκών οξέων. [61]

Εικ. 46 Κόστος αλληλούχισης ως συνάρτηση του αριθμού βάσεων που αλληλουχούνται ανά

εβδομάδα και χρονιά μετά το 2000.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ 47 Αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος ανά δεκαετίες. Το 2014 αλληλουχίθηκαν

18000 ανθρώπινα γονιδιώματα σε ένα χρόνο.

Το 2005 με το Genome Analyzer σε ένα κύκλο αλληλούχισης μπορεί να πετύχει

παραγωγή ενός εκατομμυρίου βάσεων. Το 2014 ο αριθμός αυτός σκαρφάλωσε στο

1,8 δισεκατομμύρια βάσεις σε ένα κύκλο δηλαδή μια αύξηση της τάξης του 103 των

βάσεων. Είναι άξιο λόγου να σημειώσουμε ότι η αλληλούχιση του ανθρώπινου

γονιδιώματος ολοκληρώθηκε μετά από 15 χρόνια προσπαθειών και δημοσιεύθηκε

2001 στο επιστημονικό περιοδικό Science and Nature. Το πρόγραμμα κόστισε τρία

εκατομμύρια δολάρια Αμερικής. Για να γίνει αντιληπτό το μέγεθος της επιτυχίας που

φέρνει η αλληλούχιση επόμενης γενιάς σημειώνουμε τα αποτελέσματα της

HiSeqX™Ten μεθόδου η οποία τέθηκε σε κυκλοφορία 2014 και είναι σε θέση να

πραγματοποιήσει την αλληλούχιση 45 ανθρωπίνων γονιδιωμάτων σε μια ημέρα με

κόστος μόνο 1000 δολάρια Αμερικής ανά γονιδίωμα.

8.1 Η μέθοδος Massively parallel signature sequencing (MPSS)

«μαζική αλληλούχιση παράλληλης υπογραφής»

H MPSS είναι μια νέα προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας η οποία δεν κάνει

χρήση της βάσης με gel πολυακρυλαμίδης πάνω στην οποία θα γίνει η

ηλεκτροφόρηση των τμημάτων του DNA. Με την μέθοδο αυτή, in vitro

κλωνοποιούνται εκατομμύρια προτύπων σε ξεχωριστά μικροσφαιρίδια διαμέτρου

5μm. Μετά την δημιουργία μιας βιβλιοθήκης μικροσφαιριδίων με εκμαγεία DNA που

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


πραγματοποιήθηκαν με in vitro κλωνοποίηση, δημιουργούμε πάνω σε ένα επίπεδο

πλακίδιο συστοιχίες του ενός εκατομμυρίου προτύπων μικροσφαιριδίων με

περιεκτικότητα μεγαλύτερη των 3·106 μικροσφαιρίδια/cm2. Οι αλληλουχίες των

ελεύθερων άκρων των κλωνοποιημένων προτύπων κάθε μικροσφαιριδίου αναλύονται

άμεσα χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βάσεις χωρίς να χρειάζεται ο διαχωρισμός

τους.[63] Σε αντίθεση με τις περισσότερες μεθόδους που βασίζονται στη χρήση

μικροσφαιριδίων λαμβάνοντας δεδομένα τα οποία είναι σε αναλογικά η MPSS είναι

μια νέα μέθοδος η δημιουργεί δεδομένα τα οποία έχουν ψηφιακή μορφή.[64]

Με την μέθοδο MPSS μπορούμε να προσδιορίσουμε τα επίπεδα έκφρασης του

mRNA μετρώντας τον αριθμό των μεμονωμένων μορίων mRNA που παράγονται από

κάθε γονίδιο σε ιστούς και κύτταρα. Είναι “ανοιχτού τέλους” με την έννοια ότι

μπορεί να αναλύσει εικονικά τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων ενός δείγματος

καταμετρώντας τον αριθμό των ανεξάρτητων mRNA που παράγονται από το κάθε

γονίδιο.[64]

Ένα δείγμα με mRNA αρχικά μετατρέπεται σε συμπληρωματικό DNA (cDNA)

χρησιμοποιώντας την αντίστροφη μεταγραφάση με την οποία οι μετέπειτα χειρισμοί

γίνονται ευκολότεροι. Αυτά τα cDNA συντήκονται σε ένα μικρό ολιγονουκλεοτίδιο

“ετικέτα” το οποία επιτρέπει στο cDNA να ενισχυθεί με την PCR και στη συνέχεια να

ζευγαρώσει σε μικροσφαιρίδια. Μετά από μερικούς επαναληπτικούς γύρους

προσδιορισμού της αλληλουχίας χρησιμοποιώντας την υβριδοποίηση φθοριζουσών

ιχνηθετών ανιχνευτών, μια ακολουθία υπογραφή από 16-20 ζεύγη βάσεων (bp)

προσδιορίζεται από κάθε σφαιρίδιο. Η φθορίζουσα επιφάνεια απεικόνισης λαμβάνει

το σήμα από όλα τα σφαιρίδια καθώς προσαρμόζεται σε μια επιφάνεια, έτσι ώστε

όλες οι αλληλουχίες να προσδιοριστούν από όλα τα σφαιρίδια παράλληλα. Υπάρχει

κάποια ενίσχυση στο αρχικό υλικό έτσι το τέλος της διαδικασίας θα έχουν

αλληλουχιθεί περίπου 1000000 ακολουθίες ανά πείραμα. [65]

Όλα τα γονίδια αναλύονται ταυτόχρονα με εργαλεία βιοπληροφορικής ώστε να

βρεθεί ο αριθμός των mRNA σε κάθε γονίδιο. Τουλάχιστον ένα εκατομμύριο μόρια

θα μετρηθούν από κάθε δείγμα, ακόμα και γονίδια τα οποία εκφράζονται σε χαμηλά

επίπεδα μπορούν να ποσοτικοποιηθούν με υψηλή ακρίβεια. Το γεγονός ότι τα

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


δεδομένα έχουν ψηφιακή μορφή παρέχουν μια ιδιαίτερη ευχέρεια στην δημιουργία

βάσεων δεδομένων όπου μερικώς αναγνωρισμένα δεδομένα μπορούν να

προσδιοριστούν πλήρως με διασταύρωση των αποτελεσμάτων από άλλα είδη

κυττάρων ηλεκτρονικά. [66]

Η καταμέτρηση των mRNA με την MPSS βασίζεται στην ικανότητα να

αναγνωρίζει μεμονωμένα κάθε μόριο mRNA στο δείγμα. Αυτό επιτυγχάνεται

δημιουργώντας μια ακολουθία 17 βάσεων για κάθε mRNA σε μια ειδική θέση

ανοδικά κατά μήκος της πολύ Α ουράς. Αυτή η ακολουθία των 17 βάσεων στη

συνέχεια θα χρησιμοποιηθεί ως ένα mRNA που θα κάνει την επαλήθευση (σαν

υπογραφή). Για να μετρήσουμε το ύψος έκφρασης κάθε γονιδίου ο συνολικός

αριθμός των επαληθεύσεων που έγιναν γι’ αυτό καταμετρώνται.[65]

Η παραγωγή των “υπογραφών” για ένα δείγμα mRNA παράγεται αλληλουχώντας

τμήματα δίκλωνου DNA (ds cDNA) που ενσωματώνεται σε μικροσφαιρίδια

χρησιμοποιώντας την μέθοδο Lynx Megaclone. (εικόνα 48). Σ’ αυτή την διαδικασία

συμπληρωματικό DNA (cDNA) προετοιμάζεται από το poly (Α) RNA

χρησιμοποιώντας βιότινο - σημασμένο ολίγο dT εκκινητή. Ο εκκινητής με τον μικρό

αριθμό θυμίνης (oligo dT) σχεδιάζεται έτσι ώστε να εκκινήσει τα μόρια του mRNA

στη θέση που υπάρχει η πολύ Α “poly(A)” ουρά. Τα τμήματα του cDNA στη

συνέχεια πέπτονται με DpnII (αναγνωρίζει σημεία με αλληλουχία GATC). Τα 3’

DpnII-poly(A) τμήματα καθαρίζονται αξιοποιώντας το άκρο βιοτίνης που υπάρχει

στο άκρο κάθε μορίου. Τα τμήματα στην συνέχεια κλωνοποιούνται σε

μικροσφαιρίδια διαμέτρου 5mm. Η διαδικασία αυτή παράγει μια βιβλιοθήκη

μικροσφαιριδίων όπου ένα μόριο εκκίνησης mRNA αντιπροσωπεύει ένα

μικροσφαιρίδιο, όπου το κάθε μικροσφαιρίδιο περιέχει περίπου 100000

πανομοιότυπα τμήματα cDNA από το αρχικό mRNA. Έτσι ξεκινάμε με ένα

εκατομμύριο μόρια mRNA από ένα κύτταρο ή ιστό. Η μέθοδος αυτή στη συνέχεια θα

παράγει ένα εκατομμύριο μικροσφαιρίδια πάνω στο κάθε ένα από αυτά υπάρχουν

100000 αντίγραφα cDNA από το κάθε μόριο mRNA. Όλα τα μόρια είναι

συνδεδεμένα με τον ίδιο πόλο στα μικροσφαιρίδια από την πολύ Α ουρά, έτσι το

DpnII άκρο τίθεται στις διαδικασίες της αλληλούχισης.[66]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η διαδικασία της αλληλούχισης ξεκινά με την συνένωση ενός μορίου συνδέσμου

και πέψη του με ένζυμα περιορισμού τύπου ΙΙ. Περίπου ένα εκατομμύριο

μικροσφαιρίδια διοχετεύονται σε μια ειδικά σχεδιασμένη κυψελίδα ροής η οποία θα

τα επιτρέπει να συνενωθούν μεταξύ τους κατά μήκος της διαδρομής δημιουργώντας

ένα σφιχτό πακέτο ενός λεπτού επιπέδου στην κυψελίδα.

Εικ 48 Τα μόρια Poly(A)mRNA μετατρέπονται σε δίκλωνο cDNA. Η βιβλιοθήκη των cDNA

ενισχύεται με PCR και τα γραμμικά μόρια που παράγονται επεξεργάζονται κατάλληλα για να

παραχθούν τμήματα με μήκος 32b. Τα τμήματα αυτά υβριδίζονται με άλλα όμοια. Το δίκλωνο

DNA που προκύπτει συνδέεται σε μικροσφαιρίδια.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 49 Κυψελίδες ροής σε διάφορες όψεις. Τα μικροσφαιρίδια εισέρχονται από την είσοδο

των κυψελίδων, κινούνται κατά μήκος αυτών και μαζεύονται σε ένα κάθετο εμπόδιο.

Εικ 50 Συνοπτικά η διαδικασία αλληλούχισης με MPSS. Κωδικοποιημένοι υποδοχείς

συνδέονται με τα άκρα των cDNA τα οποίο συνδέονται με τα μικροσφαιρίδια. Δεκαέξι

διαφορετικοί φθορίζοντες αποκωδικοποιητές υβριδίζονται στο άκρο των υποδοχέων με

σκοπό την αναγνώριση των τεσσάρων πρώτων νουκλεοτιδίων. Ο υποδοχέας στο τέλος του

πρώτου γύρου απομακρύνεται ελευθερώνοντας τέσσερα νέες βάσεις προς αλληλούχιση σε

μονό κλώνο. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μερικές φορές μέχρι την πλήρη αλληλούχιση

του τμήματος

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η κυψελίδα ροής συνδέεται με ένα δίκτυο μικρορροών μέσω υπολογιστή το οποίο

μεταφέρει διάφορα αντιδραστήρια για την αλληλούχιση. Μια CCD κάμερα η οποία

έχει τοποθετηθεί κάθετα στην επιφάνεια παίρνει φθορίζουσες φωτογραφίες σε

συγκεκριμένα στάδια της διαδικασίας. [64]

Η πραγματική αντίδραση της αλληλουχίας του DNA περιλαμβάνει μία

αυτοματοποιημένη σειρά από συνδέσεις προσαρμογέα και ενζυμικών σταδίων όπως

περιγράφεται στην εικόνα 49. Η διαδικασία αρχίζει με την πρόσδεση ενός μορίου

προσαρμογέα στην GATC (DpnI) προέκταση της ss (single-stranded), και στη

συνέχεια πέψη των δειγμάτων με BbvI, η οποία είναι ένας τύπος IIs ένζυμου

περιορισμού που κόβει το DNA σε μια θέση 9 έως 13 νουκλεοτίδια μακριά από την

αλληλουχία αναγνώρισης. Η διαδικασία αυτή παράγει μόρια με τέσσερις βάσεις να

προεξέχουν ακριβώς δίπλα στην αναγνωρισμένη περιοχή αλληλούχισης DpnII. Μια

άλλη ομάδα προσαρμογέων που ονομάζονται κωδικοποιημένοι προσαρμογείς

υβριδίζονται και συνδέονται με τέσσερις προεξέχουσες βάσεις του κάθε μορίου. Οι

κωδικοποιημένοι προσαρμογείς περιέχουν προεξοχές τεσσάρων βάσεων με όλους

τους πιθανούς συνδυασμούς νουκλεοτιδίων στο ένα άκρο και ένα μονόκλωνο (ss)

κωδικοποιημένη αλληλουχία στο άλλο άκρο. Το ένα μέλος των κωδικοποιημένων

υποδοχέων θα βρει ζεύγος στο μόριο του DNA του συνδέθηκε με τα σφαιρίδια στο

κύτταρο ροής. Η ακριβής αλληλουχία των τεσσάρων βάσεων στη μονόκλωνη

προεξοχή του κάθε κωδικοποιημένου προσαρμογέα ο οποίος υβριδοποιείται με το

DNA με ένα μικροσφαιρίδιο αποκωδικοποιείται μέσω μιας σειράς από 16

διαφορετικές αντιδράσεις υβριδισμού με ένα σύνολο αποκωδικοποιητών με

φθορίζοντες ιχνηθέτες. Η διαδικασία αυτή θα αποδώσει τα τέσσερα πρώτα

νουκλεοτίδια στο τέλος του κάθε μορίου. Για την συλλογή μεγαλύτερης αλληλουχίας

ο κωδικοποιημένος υποδοχέας από τον πρώτο γύρο απομακρύνεται με πέψη με το

Bbvl και η διαδικασία επαναλαμβάνεται αρκετές φορές. Στο τέλος μια υπογραφή 17-

βάσεων αλληλουχίας δημιουργείται από κάθε μικροσφαιρίδιο στο κύτταρο ροής. [64]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Στη μέθοδο αυτή αλληλουχούμε cDNA πάνω σε επιφάνεια που περιέχει

μικροσφαιρίδια όπου δεν απαιτείται ο φυσικός διαχωρισμός των θραυσμάτων για την

δημιουργία της αλληλουχίας. Σε μια πολύ μικρή εντοπισμένη περιοχή εκπέμπονται

σήματα από cDNA που υπάρχουν στα μικροσφαιρίδια τα οποία στη συνέχεια θα

πρέπει να υποστούν επεξεργασία. Περιοχές μοναδικής αναγνώρισης (ή υπογραφές) με

μήκος 16-20 βάσεων δημιουργούνται. Ένα από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι

ότι μπορεί να αναγνωρίσει ένα μεγάλο αριθμό μικρού μήκους αλληλουχίες. Ενώ οι

περισσότερες μεθόδοι επεξεργάζονται χιλιάδες πρότυπα για να αλληλουχίσουν

μερικές εκατοντάδες βάσεις η μέθοδος MPSS αναλύει δεδομένα εκατομμυρίων

βάσεων αλλά αναγνωρίζει μήκος μερικών δεκάδων. Η παράλληλη ανάλυση

επιτυγχάνεται σε μοριακό επίπεδο, όπου εκατομμύρια πρότυπα διαχειρίζονται

ταυτόχρονα με μικρό αριθμό αντιδράσεων χωρίς μεμονωμένο διαχωρισμό,

επεξεργασία των προτύπων ή πολύπλοκα συστήματα βιοπληροφορικής.[65]

Η μέθοδος έχει δύο αξιοσημείωτα πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων. Το

πρώτο από αυτά είναι ότι μπορεί να αλληλούχισει μήκος βάσεων το οποίο φθάνει στα

Εικ. 51 Η συσκευή αλληλούχισης MPSS.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


17 νουκλεοτίδια σε αντίθεση με την SAGE που αναγνωρίζει 14. Ο αριθμός των 17

νουκλεοτιδίων επιτυγχάνει μοναδικότητα στο ανθρώπινο γονιδίωμα σε ποσοστό 95%

ενώ τα 14 νουκλεοτίδια σε ποσοστό 80%. Το δεύτερο είναι ότι η αυτοματοποίηση

που μας παρέχει την καθιστά ικανή να παράγει αποτελεσματικά ένα πολύ μεγάλο

σύνολο μοναδικών αλληλουχιών (υπογραφές).

Συνολικά συγκρίνοντάς την με τις υπάρχουσες μεθόδους η MPSS παρέχει σε

βάθος ποσοτικοποίηση των περισσοτέρων γονιδίων που εκφράζονται στο δείγμα.

Δεδομένου ότι δεν απαιτείται προηγούμενη γνώση οποιουδήποτε γονιδίου ή

γονιδιώματος είναι δυνατό να δημιουργηθούν ποσοτικοποιημένες βάσεις δεδομένων

έκφρασης από κάθε οργανισμό. Επιπλέον έχει την ευαισθησία να ποσοτικοποιήσει με

ακρίβεια τα γονίδια που εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα στο κύτταρο

δεδομένου ότι μια βάση δεδομένων μπορεί να περιλαμβάνει μέχρι και ένα

εκατομμύριο ή και περισσότερες μοναδικές αλληλουχίες-υπογραφές. [66]

8.2 Αλληλούχιση Polony (Polymerase-colony) ή αποικίες

πολυμεράσης

Η παρούσα μέθοδος είναι φθηνή και μη ηλεκτροφορητική αλλά ταυτόχρονα και

μια εξαιρετικά ακριβής, πολλαπλής αλληλούχισης τεχνική που μπορεί να

χρησιμοποιηθεί για να “διαβάσει” εκατομμύρια ακινητοποιημένων αλληλουχιών

DNA ταυτόχρονα. Τα μέσα που χρειάζεται η παρούσα μέθοδος είναι ένα κοινό

μικροσκόπιο φθορισμού, ηλεκτρονικό υπολογιστή ο οποίος θα ελέγχει να δεδομένα

και κυψελίδες ροής. Πραγματοποιείται με τμήματα του DNA τα οποία έχουν

ελεύθερα τα δύο 5 τους άκρα 5’ και 3, όπου κάθε μόριο του DNA έχει μήκος 135bp

με δύο γονιδιακές ετικέτες που έχουν μήκος 17-18bp και πλαισιώνονται από κοινές

αλληλουχίες. Το μήκος ανάγνωσης αυτής της τεχνικής είναι 26 βάσεις ανά amplicon

(μόρια DNA τα οποία ενισχύθηκαν με PCR) και 13 βάσεις ανά ετικέτα αφήνοντας

ένα κενό 4-5 βάσεων σε κάθε ετικέτα.[67]

Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε σε στέλεχος του Escherichia coli το οποίο

επαναλληλουχίθηκε με λιγότερο από ένα σφάλμα ανά ένα εκατομμύριο bp. Τα μόρια

αφού πολλαπλασιαστούν με PCR τοποθετούνται σε μικροσφαιρίδια 1 μικρομέτρου

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


ακινητοποιούνται σε gel πολυακρυλαμιδίου και υποβάλλονται σε

επαναλαμβανόμενους κύκλους αλληλούχισης με απεικονίσεις τεσσάρων χρωμάτων.

Η διαδικασία περιλαμβάνει τρία βήματα:[68]

1ο βήμα: Παραγωγή βιβλιοθηκών γραμμικών μορίων DNA τα άκρα των

οποίων έχουν τυχαίους εκκινητές. (Εικ. 52 A)

Κάθε μόριο της βιβλιοθήκης μπορεί να περιέχει ποικιλία περιοχών την οποία

πλαισιώνουν δύο προσδιορισμένες περιοχές. Οι προσδιορισμένες περιοχές περιέχουν

συνεκτικά άκρα εκκινητών ώστε να επιτρέπεται η χωρίς περιορισμούς ενίσχυση με

PCR.

2ο βήμα: Πολλαπλασιασμός των αποικιών πολυμεράσης σε gel

πολυακρυλαμιδίου. (Εικ. 52 Α)

Σε γυάλινη επιφάνεια μικροσκοπίου τοποθετείται λεπτό φιλμ πολυακρυλαμιδίου.

Οι βιβλιοθήκες που έχουν παραχθεί από το προηγούμενο βήμα ενισχύονται –

πολλαπλασιάζονται με την χρήση της μεθόδου PCR. Στο τέλος της διαδικασίας κάθε

μεμονωμένο μόριο εκμαγείο παράγει μια αποικία πολυμεράσης.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Σε κάθε γυάλινο πλακίδιο μπορούν παραχθούν έως και 15 εκατομμύρια αποικιών.

Με τροποποίηση του 5΄ άκρου με acrydite των εκκινητών παρέχεται η

δυνατότητα του ενός κλάδου του πολλαπλασιασμένου DNA να συνδεθεί ομοιοπολικά

στο πλακίδιο πολυακριλαμιδίου. Αυτό επιτρέπει περαιτέρω ενζυματικούς χειρισμούς

και πλύσεις που πραγματοποιούνται στο προσδεμένο DNA.

3ο βήμα: Αλληλούχιση των polonies με φθορισμό in situ με

επαναλαμβανόμενη ποσοτικοποίηση (Εικ. 52 Β).

Το ακινητοποιημένο DNA μετουσιώνεται, οι μη συνδεδεμένοι κλώνοι

απομακρύνονται με πλύση του και ο καθολικός εκκινητής υβριδίζεται στο εκμαγείο.

Μια αντίδραση επέκτασης του εκκινητή λαμβάνει χώρα στη συνέχεια. Η επιφάνεια με

το gel στην συνέχεια σαρώνεται χρησημοποιώντας μικροσκόποιο φθορισμού. Αν μια

αποικία έχει ενσωματωθεί η προστιθέμενη βάση θα παράγει φθορισμό

ΕΙκ. 52 Α. Πολλαπλασιασμός κατά Polony. Β. In situ αλληλούχιση με φθορισμό.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αποκαλύπτοντας την βάση του εκμαγείου άμεσα του τμήματος προς αναγνώριση. Ο

παραγωγός του φθορισμού στη συνέχεια απομακρύνεται με διάσπαση του συνδέσμου

μεταξύ του παραγωγού φθορισμού και του νουκλεοτιδίου εκπλένοντάς το. Η

διαδικασία επαναλαμβάνεται προσθέτοντας μια διαφορετική βάση η οποια περιέχει

διαφορετικού χρώματος φθορίζουσα ουσία, απομακρύνοντας τις μη συνδεδεμένες

βάσεις και σαρώνοντας την επιφάνεια ξανά. Κατ’ αυτό τον τρόπο μπορούμε να

πάρουμε την αλληλούχιση από κάθε αποικία ταυτόχρονα. [67]

8.3 454 Πυροαλληλούχιση

Η μέθοδος της πυροαλληλούχισης εξελίχθηκε ώστε να γίνει περισσότερο

αποδοτική και λιγότερο δαπανηρή. Η νέα μέθοδος συνδυάζει τις ιδιότητες της χρήσης

του πυροφωσφορικού πάνω σε στερεό υπόστρωμα οπτικών ινών με 1600000

μεμονωμένα φρεάτια.[66] Έτσι είναι ικανή να προσφέρει αλληλούχιση 25

εκατομμυρίων βάσεων σε τέσσερις ώρες με ακρίβεια μεγαλύτερη του 99%. Για την

δημιουργία εκμαγείων αλληλούχισης κλωνικά ενισχύονται σε μικροσφαιρίδια μέσα

σε σταγονίδια γαλακτώματος. Τα σφαιρίδια στα οποία έχουν ενσωματωθεί τα

εκμαγεία τοποθετούνται στο εσωτερικό των φρεατίων, μετατρέποντάς τα σε

Εικ. 53 Σύστημα αλληλούχισης. Την αποτελούν a. Υγρά νουκλεοτιδίων, b. Κυψέλες ροής οι

οποίες σύστημα επιφανειών ινών, c. Ψηφιακή CCD κάμερα και τον Η/Υ για την επεξεργασία

των δεδομένων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αντιδραστήρες αλληλούχισης χρησιμοποιώντας την μέθοδο της πυραλληλούχισης. [70]

8.3.1 Διαδικασία

Αρχικά δημιουργούνται βιβλιοθήκες από θραύσματα του DNA. Το πλήρες

γονιδίωμα τεμαχίζεται τυχαία απομονώνοντας τα μόρια του DNA. Στα τμήματα αυτά

προστίθενται κατάλληλοι προσαρμογείς ώστε να προσδεθούν στα μικροσφαιρίδια και

με την παρουσία του γαλακτώματος τα τμήματα πολλαπλασιάζονται. (Εικ. 54 a, b) Σε

αντίθεση με τις άλλες μεθόδους στην παρούσα δεν απαιτείται υποκλωνοποίηση σε

βακτήρια ή την διαχείριση μεμονωμένων κλώνων, τα εκμαγεία διακινούνται

ελεύθερα στο γαλάκτωμα.[69]

Εικ. 54 Προετοιμασία του δείγματος. a. Το γονιδιακό DNA απομονώνεται, τεμαχίζεται,

συνδέεται σε προσαρμογείς και χωρίζεται σε μονές έλικες. (πάνω αριστερά) Στη συνέχεια

συνδέονται σε σφαιρίδια ένα κατά προτίμηση. Αυτά με PCR πολλαπλασιάζονται με αποτέλεσμα

το κάθε μικροσφαιρίδιο να μεταφέρει δέκα εκατομμύρια αντίγραφα του αρχικού. (πάνω δεξιά)

Τα μικροσφαιρίδια τοποθετούνται στο εσωτερικό φρεατίων πάνω σε επιφάνεια οπτικών ινών.

(κάτω αριστερά) Τα σφαιρίδια που θα αλληλουχιθούν με πυροφωσφορικό θα τοποθετηθούν στο

εσωτερικό φρεατίων που περιέχουν κατάλληλα ένζυμα. (κάτω δεξιά) b. Φωτογραφία στην οποία

φαίνονται σταγόνες που περιέχουν σφαιρίδια και κενές. c. Φωτογραφία από ηλεκτρονικό

μικροσκόπιο στην οποία φαίνονται τα φρεάτια πριν την τοποθέτηση των μικροσφαιριδίων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Χρησιμοποιώντας την μέθοδο της πυραλληλούχισης η αλληλούχιση

επιτυγχάνεται άμεσα από τα ανοιχτά φρεάτια μικρού μεγέθους των οπτικών ινών.

Κάθε πλακίδιο οπτικής ίνας περιέχει εξαγωνικά πηγάδια διαμέτρου 55μm που

περιβάλλεται από επένδυση 2-3μm. Το κάθε φρεάτιο έχει όγκο 75pL και σε κάθε

πλακίδιο περιέχονται 480 πηγάδια/mm2 (εικ. 54c). Το κάθε πλακίδιο περιέχει 1,6

εκατομμύρια πηγάδια τα οποία γεμίζουν με τα μικροσφαιρίδια τα οποία

τοποθετούνται σε θάλαμο ο οποίος έχει σχεδιαστεί να περιέχει κανάλια ύψους 300μm

πάνω από το ύψος των πηγαδιών μέσω των οποίων γίνεται η ροή των αντιδραστηρίων

αλληλουχίας. Η μη χαραγμένη βάση του πλακιδίου είναι σε οπτική επαφή με

αισθητήρα CCD κάμερας. Έτσι τα εκπεμπόμενα φωτόνια από κάθε πηγάδι

αποτυπώνονται. [71]

Στο θάλαμο ροής κυκλικά παραδίδονται αντιδραστήρια τα οποία επιτρέπουν την

επέκταση των προτύπων. Ο χρόνος διάχυσης προς και από τα πηγάδια είναι περίπου

10 sec αλλά μπορεί να διαφοροποιηθεί ανάλογα με τις διαστάσεις του πηγαδιού και

το ύψος του καναλιού ροής. Το βάθος του κάθε πηγαδιού εξαρτάται από διάφορους

Εικ. 55 Διάγραμμα ροής 113 βάσεων. Τα νουκλεοτίδια τοποθετούνται με την σειρά T, A, C, G.

Η αλληλουχία των βάσεων φαίνεται πάνω από το διάγραμμα. Το εύρος του σήματος φαίνεται

στην δεξιά στήλη. Οι πρώτες τέσσερις βάσεις που υπάρχουν στην αλληλουχία τοποθετούνται

για να ελεγχτεί αν το φρεάτιο περιέχει μικροσφαιρίδιο με κλάδο DNA.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


παράγοντες. Πρέπει να καλύπτει τα μικροσφαιρίδια κατά την μεταφορά των

αντιδραστηρίων. Να παρέχει απομόνωση ώστε να αποτραπεί η διάχυση των

υποπροϊόντων από το ένα πηγάδι στο άλλο και αρκετά ρηχό ώστε να επιτρέπει την

ταχεία διάδοση των νουκλεοτιδίων μέσα από τα πηγάδια και γρήγορη των

νουκλεοτιδίων που δεν έχουν συνδεθεί στο τέλος του κάθε κύκλου. [72]

Κάθε σύνδεση νουκλεοτιδίου γίνεται αντιληπτή από την απελευθέρωση του

πυροφωσφορικού με την ταυτόχρονη παραγωγή φωτονίου. Κάθε πηγάδι που περιέχει

μικροσφαιρίδιο προσδιορίζεται από την ανίχνευση μια σειράς τεσσάρων γνωστών

νουκλεοτιδίων που ορίζονται ως «κλειδί» αλληλούχισης στην αρχή της ανάγνωσης.

Ανάλογα με τον αριθμό των νουκλεοτιδίων που θα συνδεθούν θα εκπεμφθεί και το

αντίστοιχο ποσό πυροφωσφορικού και φωτονίων στη συνέχεια. [72]

8.4 Illumina (Solexa) sequencing

Η βασική ιδέα πάνω στην οποία στηρίχτηκε ο S Balasubramanian και ο D

Klenerman από το Cambridge University το 1990 δεν έχει αλλάξει ριζικά από τις

υπάρχουσες μεθόδους αλληλούχισης. Είναι παρόμοια μ’ αυτή της αλληλούχισης με

ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμίδης μέσα σε τριχοειδής διαδρομές.

Χρησιμοποιούν νουκλεοτίδια τα οποία έχουν σημανθεί με φθορίζουσα ουσία ώστε να

γίνεται εφικτή η παρακολούθηση της δράσης της πολυμεράσης σε μονόκλωνο DNA,

με διαδοχικές επαναλήψεις, το οποίο έχει ακινητοποιηθεί σε μια επιφάνεια. [71] Η

βασική διαφορά από τις παλαιότερες μεθόδους αλληλούχισης είναι ότι η προσθήκη

των νουκλεοτιδίων δεν γίνεται μεμονωμένα αλλά ταυτόχρονα – παράλληλα από

πολλούς κλώνους του DNA ταυτόχρονα. Την ονομάζουν και reversible διότι ο

τερματισμός της προσθήκης βάσεων δεν είναι μόνιμος όπως γίνεται στην μέθοδο του

Sanger αλλά μπορεί να αντιστραφεί και να συνεχιστεί μετά από μια διαδικασία

“επιδιόρθωσης” του τμήματος που σταμάτησε την προσθήκη. Η παρουσία του H στη

θέση επέκτασης της αλληλούχισης κατά Sanger θα σταματούσε την διαδικασία μη

αναστρέψιμα (μόνιμα). Η παρουσία όμως ομάδων που μπορούν να αντικατασταθούν

από με μια ομάδα υδροξυλίου μπορούν να συνεχίσουν την επέκταση της αλυσίδας

ελεγχόμενα (εικ. 54). [73]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


8.4.1 Μεθοδολογία

Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την δημιουργία συστάδων. Δηλαδή τον

πολλαπλασιασμό του δείγματος. Το δείγμα του DNA που έχει επιλεχθεί τεμαχίζεται

σε μικρότερα τμήματα μήκους περίπου 400 bp. Τμήματα με μικρό αριθμό βάσεων –

νουκλεοτιδίων (υποδοχείς) των οποίων την αλληλουχία την γνωρίζουμε,

προσδένονται στα άκρα τους. (εικόνα 57). Ο ρόλος αυτών των μικρών τμημάτων

είναι σαν τις λαβές που σκοπό τους έχουν την ακινητοποίηση τους, επιτρέποντας τις

επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις. Για παράδειγμα είναι το μέσο για να παγιδευτούν

Εικ. 56 Α. Τερματικός όρος στην μέθοδο Sanger, Β., C. Αναστρέψιμος τερματικός όρος

κλειδωμένος και ανοιχτός

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


τα τμήματα του DNA στην κυψελίδα ροής την οποία μπορεί να απελευθερώσει στη

συνέχεια. [74] Επίσης δημιουργεί περιοχές στις οποίες μπορούν να προσδεθούν

εκκινητές για τις αντιδράσεις αλληλούχισης

Στην συνέχεια το δείγμα εγχέεται στην κυψελίδα ροής η οποία περιέχει πυκνά σαν

το “χορτάρι” προσδεμένα πάνω σ’ αυτή τμήματα ολίγων νουκλεοτιδίων, στα οποία με

την σειρά τους θα προσδεθούν οι υποδοχείς που πριν ενσωματώθηκαν στα τμήματα

του DNA. Η πυκνότητα ελέγχεται με προσοχή ώστε να υπάρχει μόνο ένας κλώνος σε

μια συγκεκριμένη περιοχή του πλακιδίου ροής (εικ. 58).[75]

Εικ. 57 Προετοιμασία του δείγματος. Τυχαία τμήματα συνδέονται με υποδοχείς στο άκρο τους.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Τα τμήματα πολλαπλασιάζονται με την μέθοδο γεφύρωσης PCR. Με την διαδικασία

αυτή, το προς αλληλούχιση τμήμα πολλαπλασιάζεται δημιουργώντας μια πυκνή

συστοιχία μονών κλαδών του DNA της τάξης των χιλιάδων πανομοιότυπων

αντιγράφων, σε μια συγκεκριμένη περιοχή της κυψέλης ροής (εικ.60).

Εικ. 58 Τμήματα DNA τοποθετημένα σε κυψέλες ροής

Εικ. 59 Τρόπος πολλαπλασιασμού στην Illumina. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι τον

σχηματισμό πυκνών συστοιχιών. Τα κόκκινα και πράσινα τμήματα είναι οι εκκινητές που

συνδέθηκαν με το τμήμα αλληλούχισης. Οι πουά περιοχές είναι αυτές που έχουν συνδεθεί με

το πλακίδιο. Όταν ολοκληρωθεί η ενίσχυση τα τμήματα μπορούν να αλληλουχιθούν από κάθε

πλευρά.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Κατά την διαδικασία του πολλαπλασιασμού με την μέθοδο της γεφύρωσης με

PCR προκύπτουν δίκλωνα μόρια DNA τα οποία μετουσιώνονται και προκύπτουν

Εικ. 60 Συστοιχίες τμημάτων DNA

Εικ. 61 Δράση της DNA πολυμεράσης

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


στην συνέχεια τα μονόκλωνα που επιθυμούμε. Αυτές οι συστοιχίες στη συνέχεια θα

αλληλουχιθούν. Συνεχίζουν να είναι ακινητοποιημένες στην κυψελίδα ροής, η οποία

μπορεί να περιέχει εκατομμύρια συστοιχιών, δέκα μονόκλωνες συστοιχίες ανά

τετραγωνικό εκατοστό, οι οποίες είναι διαχωρισμένες μεταξύ τους ώστε να είμαστε

σε θέση να διακρίνουμε την διαφορετική ακτινοβολία που θα εκπέμπεται κάθε

φορά.[76]

Η αλληλούχιση πραγματοποιείται με την σύνθεση του μονού κλάδου του DNA σε

δίκλωνο, προσθέτοντας ένα νουκλεοτίδιο κάθε φορά. Συγκεκριμένα στην κυψελίδα

ροής προστίθενται εκκινητές που θα προσδεθούν στο μονόκλωνο DNA ώστε να είναι

δυνατή η προσθήκη νουκλεοτιδίων. Στη συνέχεια θα προστεθούν και τα τέσσερα είδη

νουκλεοτιδίων, με την χαρακτηριστική ομάδα 3΄-O-azidomethyl 2΄-deoxynucleoside

triphosphates (A, C, G και T) με διαφορετικό χρώμα ταυτόχρονα, με την ταυτόχρονη

παρουσία της DNA πολυμεράσης η οποία θα καταλύσει την προσθήκη τους. Οι

βάσεις που πρόκειται να προστεθούν και να συμπληρώσουν τον κλάδο εκμαγείο

Εικ. 62 Εκπομπή φωτός μετά την ενσωμάτωση

του νουκλεοτιδίου.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 63 Η διαδικασία επαναλαμβάνεται πολλές φορές μέχρι την πλήρη αλληλούχιση του

τμήματος

έχουν μια ιδιαιτερότητα. Δεν σταματούν την προσθήκη της επόμενης βάσης μόνιμα,

αλλά παροδικά. Η κάθε συστοιχία όπως περιεγράφηκε παραπάνω αποτελείται από

μονόκλωνο DNA του ίδιου είδους, η διπλανή αλλά και οι επόμενες είναι διαφορετικές

μεταξύ τους. Όταν προστεθεί ένα νουκλεοτίδιο το οποίο περιλαμβάνει την ουσία που

εκπέμπει το φωτεινό σήμα από τον ένα κλάδο και το επόμενο στον διπλανό αλλά και

σε όλους τους υπόλοιπους κλάδους θα εκπεμφθεί σήμα ισχυρό το οποίο είναι εύκολο

να παρατηρηθεί. Τα νουκλεοτίδια τα οποία δεν έχουν ενσωματωθεί να

απομακρυνθούν με έκπλυση τους. Το νουκλεοτίδιο το οποίο έχει τοποθετηθεί εξ

αιτίας της παρουσίας κατάλληλης ομάδας O-R, όπου R ο αντιστρέψιμος όρος ο

οποίος θα απομακρυνθεί, στην θέση 3΄ δεν επιτρέπει την προσθήκη της επόμενης

βάσης. [77]

Οι τερματικοί όροι απομακρύνονται από την tris (2-carboxyethyl) phosphine

(TCEP) μαζί με την φθορίζουσα ουσία, και την άμεση δημιουργία της 3΄ ύδροξυ

ομάδας ώστε να είναι δυνατή η προσθήκη της επόμενης βάσης η οποία με την σειρά

της θα εκπέμψει φωτεινό σήμα ίδιου χρώματος αν είναι ίδια με την προηγούμενη ή

διαφορετικού αν είναι διαφορετική. Το σήμα της κάθε προσθήκης αναγνωρίζεται

άμεσα και η πιθανότητα σφάλματος στην αναγνώριση ελαχιστοποιούνται. [78]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 64 Αλληλούχιση χρησιμοποιώντας 3’Ο

αντιστρέψιμους αναστολείς. Η κάθε 3’-ΟΗ μπλοκάρεται

και το φθορίζον άκρο αποκόπτεται. Το μπλε βέλος δείχνει

το κενό τμήμα.

Τα δεδομένα αυτά θα οδηγηθούν σε ηλεκτρονική επεξεργασία. Σκοπός αυτής της

επεξεργασίας είναι να ευθυγραμμιστούν τα δεδομένα που προέρχονται από διάφορα

Εικ. 65 Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης ευθυγραμμίζονται με χρήση Η/Υ. Η σύγκριση

των αποτελεσμάτων με το πρότυπο γονιδίωμα μπορεί να αναγνωρίσει διαφορές.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


σημεία του DNA τα οποία με τυχαίο τρόπο τεμαχίστηκαν.

8.5 Μέθοδος SOLiD

Η μέθοδος αυτή της οποίας η ονομασία προέρχεται από το αλληλούχιση με χρήση

ολιγονουκλεοτιδίων τα οποία συντίθενται με DNA λιγάση, τα οποία στη συνέχεια θα

αναγνωριστούν (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection). Την μέθοδο

αυτή δεν θα πρέπει να την συγχέουμε με τις άλλες μεθόδους αλληλούχισης, οι οποίες

στηρίζονται στην αλληλούχιση με την μέθοδο της σύνθεσης των νουκλεοτιδίων. Αντ’

αυτού χρησιμοποιεί την σύνδεση ολιγονουκλεοτιδίων με μήκους οκτώ ή εννέα

βάσεων κάθε φορά, οι οποίες έχουν σημανθεί με φθορίζουσα ουσία για τον

προσδιορισμό δύο βάσεων του εκμαγείου κάθε φορά. Με αυτή την μέθοδο μειώθηκε

το κόστος αλληλούχισης από 0,01$/νουκλεοτίδιο το 2004 στο 0,0001$/νουκλεοτίδιο

αυξάνοντας τον αριθμό των νουκλεοτιδίων που αλληλουχίθηκαν από το 1000000

νουκλεοτίδια την ημέρα στα 5000000000 νουκλεοτίδια την ημέρα το 2009. [79]

Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα που έχει η DNA λιγάση. Συγκεκριμένα δεν

μπορεί να συνδέσει δύο μόρια μονόκλωνου DNA ή να κυκλοποιήσει μονόκλωνο

DNA. Αντιθέτως έχει την ικανότητα να κλείνει ανοίγματα σε δίκλωνα μόρια DNA [80]

Το ένζυμο αυτό καταλύει τον σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ

της 3’-υδροξυλικής ομάδας στο άκρο της μιας αλυσίδας του DNA και της 5’-

φωσφορικής ομάδας στο άκρο της άλλης.

Εικ. 66 Η αντίδραση της DNA λιγάσης. Η DNA λιγάση καταλύει τη σύνδεση ενός κλώνου

DNA που έχει μια ελεύθερη 3’-υδροξυλική ομάδα με έναν άλλο που έχει μια ελεύθερη 5’-

φωσφορική ομάδα. Στα ευκαρυωτικά και τα αρχαία, η ΑΤΡ διασπάται προς AΜP και PPi

για να προωθήσει την αντίδραση αυτή. Στα βακτήρια, το NAD+ διασπάται προς ΑΜΡ και

νικοτιναμινομονονουκλεοτίδιο (ΝΜΜ).

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Αρχικά, και σ’ αυτή την μέθοδο είναι η παραγωγή του δείγματος το οποίο

πρόκειται να αλληλουχιθεί. Κατά την διαδικασία της αλληλούχισης η σκευή

επεξεργάζεται ταυτόχρονα δύο κυψελίδες ροής. Ο πολλαπλασιασμός του δείγματος

γίνεται εφαρμόζοντας την μέθοδο emPCR κάνοντας χρήση μαγνητικών

μικροσφαιριδίων επιφάνειας 1μm με σκοπό την παραγωγή ικανού σήματος κα την

διάρκεια της διαδικασία της αλληλούχισης. [70] Αυτό το πολύ μικρό μέγεθος των

σφαιριδίων προσφέρει στη SOLiD την απαιτούμενη χωρητικότητα ώστε να παράγει

μεγαλύτερο αριθμό αποτελεσμάτων αλληλούχισης. [81]

Αυτά τα μαγνητικά μικροσφαιρίδια στη συνέχεια θα τοποθετηθούν μέσα σε

κυψελίδες ροής. Σ’ αυτά τα μικροσφαιρίδια έχουν προσδεθεί τα προς αλληλούχιση

τμήματα του DNA το μήκος των οποίων είναι μεταξύ 25-35 bp. Στο στάδιο αυτό ο

εκκινητής P1 θα δημιουργήσει την απαιτούμενη σύνδεση μεταξύ των μαγνητικών

μικροσφαιριδίων και των τμημάτων του DNA. Σε κάθε κύκλο αλληλούχισης μπορεί

να αλληλουχιθεί DNA του οποίου το μήκος μπορεί να φθάσει το 2-4 Gb Η μέθοδος

Εικ. 67 Μαγνητικά μικροσφαιρίδια προσαρμοσμένα σε επιφάνεια γυάλινου πλακιδίου.

Εικ. 68 Η επιδιορθωτική δράση της DNA λιγάσης

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 69 Οκταμερές στο άκρο του οποίου υπάρχει

φθορίζουσα η ουσία.

Εικ. 70 Πίνακας αποκωδικοποίησης χρωμάτων η

οποία επιτρέπει την αναγνώριση της

αλληλουχίας των βάσεων. Ο σχεδιασμός τους

έχει γίνει με προσοχή το οποίο είναι αντιληπτό

από την αντίστροφη μετάβαση

περιλαμβάνει δύο βήματα.[82] Στο πρώτο χρησιμοποιούνται οκταμερή

ολιγονουκλεοτίδια με τα οποία πραγματοποιείται ο υβριδισμός τους στο σημείο

στόχο του μονόκλωνου υπό αλληλούχιση εκμαγείου. Όταν το οκταμερές

υβριδοποιηθεί θα αφήσει ένα κενό μεταξύ του 5’ του εκκινητή και του 3’ του

οκταμερούς. Εκεί θα αναλάβει δράση, κλείνοντας αυτό το κενό η DNA λιγάση, όπως

ακριβώς συμβαίνει και στην περίπτωση των κενών που υπάρχουν μεταξύ των

τμημάτων Okazaki κατά την διαδικασία της αντιγραφής.[83] Το τι ακριβώς συμβαίνει

φαίνεται στην παρακάτω εικόνα.

8.5.1 Η δομή των οκταμερών

Οι οκταμερείς εκκινητές αποτελούνται από οκτώ βάσεις συνδεδεμένες μεταξύ

τους με τυχαίο τρόπο. Σε κάθε οκταμερές μας ενδιαφέρουν τα πρώτα δύο του μέλη.

Αυτά είναι που θα καθορίσουν και την αλληλουχία στη συνέχεια. Οι βάσεις από την

τρίτη έως και την όγδοη δεν θα μας απασχολήσουν. Στο άκρο του οκταμερούς έχει

τοποθετηθεί δείκτης ο οποίος δηλώνει το είδος των δύο βάσεων που υπάρχουν στην

αρχή. Έτσι έχουμε δεκαέξι συνδυασμούς βάσεων με τέσσερα διαφορετικά χρώματα

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


δεικτών. Το κάθε χρώμα αντιστοιχεί σε τέσσερα διαφορετικά ζευγάρια δεικτών.

8.5.2 Η διαδικασία αλληλούχισης

Αρχικά το κατάλληλο οκταμερές, το οποίο θα είναι συμπληρωματικό με το τμήμα

του εκμαγείου, θα προσδεθεί στον αρχικό εκκινητή n. Μετά την πρόσδεσή του και

την απομάκρυνση των περιττών δεικτών το φωτεινό σήμα που εκπέμπεται θα

καταγραφεί.[79] Μετά την καταγραφή του σήματος οι τρείς τελευταίες βάσεις, στις

οποίες είναι προσδεμένη η φθορίζουσα ουσία, αποκόπτονται και τα εναπομένοντα

υλικά απομακρύνονται. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως “κύκλος της λιγάσης”. [84]

Εικ 71 Σύνδεση μεταξύ του οκταμερούς και του τέλους του εκκινητή. Εκπομπή φωτός από το

φθορίζον τμήμα και στη συνέχεια αποκοπή του.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Στη συνέχεια θα πραγματοποιηθεί εκ νέου τοποθέτηση οκταμερών με την

αποβολή του φθορίζοντος τμήματος αφού γίνει η καταγραφή του. Η διαδικασία θα

συνεχιστεί μέχρι την πλήρη κάλυψη του αρχικού κλώνου με τις βάσεις που

απέμειναν. Κατ’ αυτό τον τρόπο έχει αναδημιουργηθεί δίκλωνο DNA το οποίο θα

στη συνέχεια θα μετουσιωθεί. Τα απομεινάρια των ολιγοεκκινητών αποβάλλονται.

Όπως γίνεται αντιληπτό από τις παραπάνω φωτογραφίες υπάρχουν νουκλεοτίδια τα

οποία δεν έχουν αναγνωριστεί προς το παρόν. Για το λόγο αυτό η διαδικασία

επαναλαμβάνεται τέσσερις φορές με μια όμως ιδιαιτερότητα. Αυτό συμβαίνει για να

αναγνωριστούν όλα τα νουκλεοτίδια. Αυτό επιτυγχάνεται με τον εξής τρόπο. Οι

ολιγοεκκινητές την δεύτερη, τρίτη, τέταρτη και πέμπτη φορά θα είναι κατά μια βάση

λιγότερη. Δηλαδή ο εκκινητής την δεύτερη φορά θα έχει n-1 νουκλεοτίδια, n-2, n-3

και n-4 την τρίτη, τέταρτη και πέμπτη φορά αντίστοιχα. Συνολικά θα

πραγματοποιηθούν πέντε κύκλοι λιγάσης. [84]

Με αυτή την διαδικασία το κάθε νουκλεοτίδιο αναγνωρίζεται δύο φορές. Μια

φορά με την εξ αριστερών βάση και μια φορά με την εκ δεξιών της βάση.[76] Το

Εικ. 72 Ο εκκινητής στον επόμενο κύκλο μετακινείται κατά μια θέση προς τα αριστερά. Νέος

κύκλος πρόσδεσης οκταμερών ξεκινά.

Εικ. 73 Αρχή της διπλής αναγνώρισης. Κάθε χρώμα αντιστοιχεί σε τέσσερις πιθανούς

συνδυασμούς νουκλεοτιδίων. Το πρώτο μπλε αντιστοιχεί σε ΑΑ και το τέταρτο σε CC.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αποτέλεσμα της αλληλούχισης αποδίδονται με την μορφή χρωμάτων τα οποία είναι

δυνατόν να αναγνωριστούν-αντιστοιχιστούν με βάσεις άμεσα. Για να

πραγματοποιηθεί η αλληλούχιση με ακρίβεια θα πρέπει να υπάρχει μια βάση η οποία

να είναι εξ αρχής γνωστή πάνω στην οποία θα στηριχτεί η αναγνώριση των

επόμενων, ως σημείο αναφοράς. Η βάση αυτή προϋπάρχει στον πρώτο εκκινητή που

θα τοποθετηθεί στο μονόκλωνο DNA. Τα αποτελέσματα που λαμβάνουμε μετά την

ολοκλήρωση των κύκλων η εικόνα που λαμβάνουμε φαίνεται παρακάτω.[85]

Το εκπεμπόμενο φωτεινό σήμα εκπέμπεται μετά την ενσωμάτωση του

οκταμερούς αποκωδικοποιείται με μια διαδικασία που την ονομάζουν

αποκωδικοποίηση των δύο βάσεων. Όπως και προηγουμένως αναφέρθηκε θα δυνατά

χρώματα που μπορούν να παραχθούν είναι τέσσερα, κάθε ένα από τα οποία

ανταποκρίνεται σε τέσσερα διαφορετικά ζεύγη νουκλεοτιδίων. [75]

Η αποκωδικοποίηση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων δεν θα πρέπει να

ξεχνούμε ότι γίνεται δύο φορές. Μελετώντας την εικόνα 75 παρακάτω ας δούμε το

Εικ. 74 Αποκωδικοποίηση χρωμάτων με βάση τα ζεύγη

βάσεων.

Εικ. 75 Αποκωδικοποίηση των χρωμάτων

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


πώς μπορεί να γίνε αυτό. Όλα ξεκινούν από γνώση του τελευταίου νουκλεοτιδίου του

εκκινητή n. Το νουκλεοτίδιο αυτό το χαρακτηρίζουμε ως “βάση μηδέν”. Έτσι από τα

διαδοχικά χρώματα που λαμβάνουμε μπορούμε να δημιουργήσουμε την αλληλουχία

των νουκλεοτιδίων. [70]

Είναι απόλυτα κατανοητό ότι για να γίνει σωστά η αλληλούχιση πρέπει να

είμαστε απόλυτα βέβαιοι για το είδος του τελευταίου νουκλεοτιδίου “βάση μηδέν”

του εκκινητή.

Ένα από τα πλεονεκτήματα αυτής της σημαντικής διαφοροποίησης από τις πιο

συμβατικές τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας είναι ότι, είναι δυνατόν να

Εικ. 76 Κάθε νουκλεοτίδιο επαληθεύεται δύο φορές με βάση τις επαναλαμβανόμενες πλύσεις

και τοποθετήσεις εκκινητών. Να σημειωθεί ότι το τελευταίο νουκλεοτίδιο του εκκινητή

είναι γνωστό. Αυτό είναι απαραίτητο για την διαδικασία της αλληλούχισης.

Εικ. 77 Εάν ένας SNP παρουσιαστεί στη

αλληλούχιση υπάρχουν τρία πιθανά αποτελέσματα.

Αυτό σημαίνει ότι υπάρχου τρεις συνδυασμοί

διπλών βάσεων και κάθε άλλος απορρίπτεται.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αναγνωρίσουμε την διαφορά μεταξύ ενός πολυμορφισμού νουκλεοτιδίων και ενός

σφάλματος αλληλούχισης στην αλληλουχία των χρωμάτων. Αυτή η ικανότητα

προέρχεται εξαιτίας του ότι ένα και μόνο νουκλεοτίδιο επηρεάζει δύο από τα

χρώματα στη χρωματική ακολουθία (λόγω του ότι αναγνωρίζεται δύο φορές), ενώ

ένα σφάλμα αλληλούχισης αλλάζει μόνο ένα από τα χρώματα. Αυτό μπορεί να γίνει

άμεσα εφαρμόσιμο στους πολυμορφισμούς ενός νουκλεοτιδίου (SNPs).[86] Έτσι

άμεσα μπορεί να εξεταστεί η ύπαρξη μεταλλάξεων στο υπό μελέτη δείγμα του DNA.

Η μέθοδος είναι επίσης σε θέση να κάνει αλληλούχιση διπλού άκρου με μια

ιδιαιτερότητα, η δεύτερη ανάγνωση του κάθε ζεύγους περιλαμβάνει πολύ μικρότερο

αριθμό νουκλεοτιδίων από το πρώτη ανάγνωσης (35 bp αντί του 75 bp της πρώτης

ανάγνωσης). Αυτό το μικρότερο μήκος ανάγνωσης κάνει τη SOLiD να έχει

περιορισμούς στην αλληλούχιση de novo, για γονιδιώματα με μεγάλο αριθμό

βάσεων.[76]

8.6 Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) by Life

Technologies

Στις αρχές του 2012 η νεοϊδρυθείσα Ion Torrent Systems, την οποία αργότερα

εξαγοράζει η Life Technologies, ισχυρίζεται ότι μπορεί να αναγνωρίσει ολόκληρο το

γονιδίωμα σε μια ημέρα με κόστος μικρότερο των 1000 δολαρίων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η Ion Torrent είναι σχεδόν πανομοιότυπη με την μέθοδο της πυραλληλούχισης, η

σε αντιδιαστολή με τις υπάρχουσες τεχνικές που χρησιμοποιούσαν οπτικά σήματα

κατά την πρόσληψη των νουκλεοτιδίων, έχει την ικανότητα να ανιχνεύσει το ιόν

υδρογόνου “υδρογονοκατιόν Η+” που απελευθερώνεται κατά την πρόσληψη του

νουκλεοτιδίου υπό την δράση της DNA πολυμεράσης με κατάλληλα συστήματα

ημιαγωγών.[87] Και αυτή η μέθοδος βασίζεται στην λογική της “αλληλούχισης με

σύνθεση” του DNA, κατά την οποία ο μητρικός κλώνος του DNA μετατρέπεται σε

δίκλωνο.

Η αλληλούχιση με την χρήση ημιαγωγών έχει προτερήματα συγκριτικά με τις

άλλες μεθόδους αλληλούχισης που χρησιμοποιούν οπτικό σήμα το οποίο μερικές

φορές δεν είναι δυνατό να ανιχνευθεί. Κάνουν χρήση φυσικών και όχι κατάλληλα

τροποποιημένα dNTPs π.χ. με την τοποθέτηση ραδιενεργού πηγής ή φωτεινού δείκτη,

εκμεταλλευόμενη τις ιδιότητες και τις όλο και περισσότερες βελτιώσεις που

παρουσιάζουν οι ημιαγωγοί. Να αναφερθεί ενδεικτικά ότι μέσα σε μερικούς μήνες ο

αριθμός των αισθητήρων που ήταν τοποθετημένοι στην πρώτη γενιά του Ion Torrent

314 αυξήθηκε από το ένα εκατομμύριο αισθητήρες στα επτά περίπου εκατομμύρια

στην επόμενη γενιά του Ion Torrent 316. Αυτές οι ικανότητες και ιδιαιτερότητες

κάνουν την Ion Torrent ένα πολύ καλό παίκτη στο πεδίο της αλληλούχισης

Εικ. 78 Το chip ion 314. Το ελλειπτικό γκρι τμήμα στο

κέντρο περιέχει 1,4 εκατομμύρια αισθητήρες καταγραφής

αντιδράσεων.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Εικ. 79 Πηγάδι αλληλούχισης Ion

Torrent. Το κάθε πηγάδι περιέχει

τμήματα DNA. Όταν ένα νουκλεοτίδιο

συνδεθεί απελευθερώνει ένα πρωτόνιο

το οποίο αλλάζει το pH του πηγαδιού.

Ένας αισθητήρας αντιλαμβάνεται την

αλλαγή και την καταγράφει.

παρέχοντας αλληλουχίες αρκετών εκατοντάδων βάσεων με ιδιαίτερα χαμηλό κόστος

αλληλούχισης.[88]

8.6.1 Μεθοδολογία

Και εδώ όπως και στις υπόλοιπες μεθόδους αλληλούχισης το υπό εξέταση δείγμα

θα πρέπει να πολλαπλασιαστεί ώστε να δημιουργηθεί ο ικανός αριθμός μονόκλωνου

DNA. Η μέθοδος πολλαπλασιασμού και σ’ αυτή την περίπτωση είναι η PCR.[79] Τα

δείγματα του DNA τοποθετούνται πάνω σε μικροσφαιρίδια “Ion Sphere” τα οποία

είναι κατάλληλα διαμορφωμένα για την μέθοδο αυτή, τα οποία θα τοποθετηθούν στο

εσωτερικό μικροσκοπικών φρεατίων – πηγαδιών. Αυτή η διαδικασία μπορεί να

επιτευχθεί με την σύνδεση των προϊόντων της PCR με τους εκκινητές ή με την

παράλληλη προσθήκη των εκκινητών κατά την διάρκεια της PCR. Να σημειωθεί ότι

στο κάθε μικροσφαιρίδιο που τοποθετήθηκε στο εσωτερικό του πηγαδιού υπάρχει

μόνο ένα είδος DNA το οποίο στην συνέχεια θα πολλαπλασιαστεί με emPCR. Αφού

ολοκληρωθεί η διαδικασία τα μικροσφαιρίδια θα τοποθετηθούν στο εσωτερικό του

πηγαδιού, στην βάση του οποίου έχει τοποθετηθεί το chip.[89]

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Η όλη διαδικασία είναι απίστευτα απλή στη σύλληψη και την εφαρμογή της.

Όπως και αυτή των πεχαμέτρων που χρησιμοποιούνται στην χημεία μια και δεν θα

Εικ. 80 Προσθήκη ενός dNTP στον αυξανόμενο κλάδο του DNA προκαλεί την απελευθέρωση

κατιόντος υδρογόνου Η+ και πυροφωσφορικού.

Εικ. 81 Η απελευθέρωση υδρογονοκατιόντων ή μη δείχνει την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων ή

όχι στον κλώνο εκμαγείο του DNA.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


ήταν ιδιαίτερα άτοπο να χαρακτηρίσουμε την συσκευή και πεχάμετρο αλληλούχισης.

Κάθε φορά που μια βάση ενσωματώνεται στο τμήμα του μονόκλωνου DNA ένα ιόν

υδρογόνου απελευθερώνεται.[90] Αν κατά την συμπλήρωση ενσωματωθούν

περισσότερα από ένα νουκλεοτίδια τότε ο ίδιος αριθμός ιόντων υδρογόνου θα

απελευθερωθεί. Στην βάση του κάθε πηγαδιού υπάρχει ένα ιδιαίτερα ευαίσθητος

αισθητήρας ο οποίος θα αντιληφθεί την αύξηση του φορτίου τόσο όσο είναι και

αριθμός των ιόντων υδρογόνου που ελευθερώθηκαν στο διάλυμα. Στα πηγάδια

τοποθείται κάθε φορά μόνο ένα είδος βάσης το οποίο στην συνέχεια θα απομακρυνθεί

για να επαναληφθεί η διαδικασία αρκετές φορές. Στην περίπτωση που το

νουκλεοτίδιο που προστίθεται δεν είναι αυτό που μπορεί να τοποθετηθεί στην

αυξανόμενη αλυσίδα του DNA τότε δεν θα υπάρχει η παραγωγή ιόντων υδρογόνου το

οποίο να μεταβάλλει το Ph του διαλύματος. [91] Έτσι δεν θα υπάρχει ανίχνευση

ηλεκτρικού σήματος στον συγκεκριμένο κύκλο.

Όταν τα δεδομένα παραχθούν από τον Ion PGM μεταφέρονται για επεξεργασία

στον Torrent Server ο οποίος με κατάλληλα προγράμματα θα δώσει τα αποτελέσματα

της αλληλούχισης.

Εικ. 82 Τα ιόντα υδρογόνου που ελευθερώνονται γίνονται αντιληπτά από ένα αισθητήρα

ιόντων. Πολλαπλές συνδέσεις νουκλεοτιδίων προκαλούν ισάριθμη αποδέσμευση ιόντων

υδρογόνου με αντίστοιχη αύξηση στο λαμβανόμενο σήμα.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ένας από τους περιορισμούς που παρουσιάζει η μέθοδος είναι η παρουσία όμοιων

διαδοχικών βάσεων στον μητρικό κλώνο. Αν συμβεί αυτή η παρουσία πολλών ίδιων

βάσεων, θα προκαλέσει την αποδέσμευση μεγάλου αριθμού ιόντων υδρογόνου σε ένα

μόνο κύκλο. Όπως είναι φυσικό το pH του διαλύματος θα μεταβληθεί ανάλογα με τον

αριθμό των υδρογονοκατιόντων που θα απελευθερωθούν. Οι επαναλήψεις ίδιων

βάσεων προκαλεί πρόβλημα στην ανάλυση των δεδομένων. Υπάρχει περίπτωση το

λαμβανόμενο σήμα να είναι το ίδιο ακόμα και όταν ο αριθμός των ιόντων που θα

ελευθερωθούν είναι διαφορετικός.[92]

9. Σήμερα. Υπό εξέλιξη μέθοδοι

Όλες οι τεχνικές που μελετήσαμε ξεκινούν με τον πολλαπλασιασμό του δείγματος

πριν την έναρξη της αλληλούχισης. Έτσι χάνεται πολύτιμος χρόνος και χρήμα.

Σήμερα γίνονται προσπάθειες να δημιουργηθούν μέθοδοι αλληλούχισης στις οποίες

δεν θα προηγείται ο πολλαπλασιασμός του DNA στόχου. Μια από αυτές είναι PacBio

RS από το Pacific Bioscience. Η μέθοδος είναι σε θέση να πραγματοποιήσει

αλληλούχιση μονόκλωνο DNA μήκους 10 kb χρησιμοποιώντας ένα σύστημα που το

ονομάζουμε SMRT δηλαδή μεμονωμένα μόρια σε πραγματικό χρόνο. [93]

Σ’ αυτή την μέθοδο η DNA πολυμεράση προσδένεται στο υπό αλληλούχιση

μονόκλωνο DNA. Ο κλώνος αυτός μπορεί να αλληλουχιθεί εντοπίζοντας το σήμα που

παράγεται μετά από κάθε προσθήκη νουκλεοτιδίου στον κλώνο εκμαγείο. Το κάθε

νουκλεοτίδιο έχει σημανθεί με διαφορετικό χρώμα το οποίο ελευθερώνεται όταν αυτό

προστεθεί στο DNA. Μ’ αυτό τον τρόπο δεν χρειαζόμαστε διαδοχικές εκπλύσεις ή

απομάκρυνση των νουκλεοτιδίων. Η διαδικασία είναι απλή. Γίνεται η προσθήκη των

νουκλεοτιδίων στην επιφάνεια αλληλούχισης και στην συνέχεια ξεκινά η

αλληλούχιση. Ως εκ τούτου μ’ αυτή την διαδικασία επιτυγχάνουμε μεγάλο αριθμό

νουκλεοτιδίων κατά την αλληλούχιση αλλά με ένα μεγάλο ποσοστό σφάλματος της

τάξης του 15%.[94] Για να μειώσουν το μεγάλο ποσοστό του σφάλματος η Pac-Bio

αντικατέστησε το μεγάλου μήκους μονόκλωνο DNA με μικρότερου μήκους αλλά

δίκλωνο DNA. Στο ένα άκρο πρόσθεσαν μια φουρκέτα. Με την προσθήκη αυτή

κατάφεραν να μετατρέψουν το DNA σε κυκλικό. Αποτέλεσμα αυτή της μορφή ήταν

να καταφέρουν να μειώσουν αποτελεσματικά τα σφάλμα. Σύντομα στο ίδιο χώρο

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αλληλούχισης τμημάτων DNA με μήκος της τάξης των 10 kb μπήκαν οι GridION και

MinION της Oxford Nanopore Technologies.[95]

9.1 Αλληλούχιση Nanopore

Η μέθοδος βασίζεται στην αναγνώριση ηλεκτρικών σημάτων τα οποία

λαμβάνονται όταν νουκλεοτίδια διέρχονται από πόρους άλφα - αιμολυσίνης οι οποίοι

έχουν συνδεθεί με ομοιοπολικούς δεσμούς με κυκλοδεξτρίνη. Το DNA διέρχεται από

τους νανοπόρους τους οποίους αλλάζει το ηλεκτρικό φορτίο. Η αλλαγή αυτή

εξαρτάται από το σχήμα, το μέγεθος, και το μήκος του υπό αλληλούχιση τμήματος

DNA. [96]

Συγκεκριμένα όταν παρατηρηθεί μικρή τάση της τάξης των 100 mV κατά μήκος

ενός νανοπόρου μέσα σε μια μεμβράνη η οποία διαχωρίζει δύο θαλάμους οι

περιέχουν υδατικούς ηλεκτρολύτες, το παραγόμενο ρεύμα ιόντων μπορεί να μετρηθεί

με ηλεκτροφυσιολογικές τεχνικές. Γνωρίζουμε ότι το άνοιγμα και κλείσιμο

βιολογικών καναλιών εξαρτάται από πεπτιδικές ομάδες οι οποίες φυσιολογικά

κλείνουν την διαδρομή. Εάν ένα κλώνος DNA ή RNA μπορεί να οδηγηθεί

ηλεκτροφορητικά κατά μήκος ενός νανοπόρου κατάλληλης διαμέτρου οι

νουκλεοβάσεις μπορούν να διαμορφώσουν το ιοντικό ρεύμα που διέρχεται μέσα από

αυτό (εικόνα ). [97]

Ο πόρος στο εσωτερικό του περιέχει α-αιμολυσίνη η οποία χρησιμοποιείται ως

βιοαισθητήρας. Την εφαρμογή του αυτή κατάλαβαν ο Bayley με τους συνεργάτες

του. [98] H α-αιμολυσίνη είναι απίστευτα σταθερή και παραμένει λειτουργική σε

θερμοκρασίες που πλησιάζουν τους 100 oC. Η εσωτερική διάμετρος ενός πόρου α-

αιμολυσίνης έχει μέγεθος που μόλις φθάνει το μέγεθος ενός μονόκλωνου τμήματος

DNA ή RNA. Είναι δυνατό ο νανοπόρος να ξετυλίξει τοπικά το τυλιγμένο νουκλεϊκό

οξύ έτσι ώστε να νουκλεοτίδια να διαπερνούν τον πόρο με αυστηρή διαδοχική

σειρά.[99] Κατά την διέλευση ενός μορίου νουκλεοτιδίου από τον πόρο μπλοκάρει το

άνοιγμα και δημιουργεί μια εύκολα ανιχνεύσιμη μείωση του ιοντικού ρεύματος

συγκριτικά με τον ανοιχτό πόρο. Έτσι αν ένα νουκλεοτίδιο κατά την δράση της

πολυμεράσης δημιουργήσει ένα χαρακτηριστική διαμόρφωση του ιοντικού ρεύματος

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


κατά την διέλευσή του τότε μπορεί να καθοριστεί η βάση.

Ο πόρος έχει την ιδιότητα να αναγνωρίζει τις διαφορετικές βάσεις διότι η κάθε

βάση το αναγκάζει να παράγει διαφορετικά σήματα που το κάθε ένα από αυτά να

αντιστοιχεί σε μια βάση. Η μέθοδος επιτρέπει να αλληλουχιθούν μεγάλου αριθμού

νουκλεοτιδικές αλυσίδες με χαμηλό κόστος.

9.2 Προοπτική και εξέλιξη

Με τόσες καινοτομίες που έχουν δημιουργηθεί είναι απόλυτα φυσιολογικό να

δημιουργηθούν νέα προβλήματα που προέρχονται από αυτές τις καινοτομίες. Σήμερα

η επιστημονική κοινότητα προσπαθεί να αλληλουχίσει το ανθρώπινο γονιδίωμα από

ένα μεμονωμένο μόριο DNA.

Ο στόχος της αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος έχει και αυξημένο

κόστος και διαρκεί μεγάλο χρονικό διάστημα. Η ανάγκη για γρηγορότερους και

Εικ. 83 Αλληλούχιση κλώνου με αποκοπή του. Ο πόρος με α – αιμολυσίνη επιτρέπει ή

αποκόπτει το πέρασμα του κλάδου. Κατά την διέλευσή του παρατηρείται ρεύμα ενώ

στην αντίθετη όχι

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


μικρότερου κόστους μεθόδους είναι μια από τις ελπίδες που έχουμε για βελτίωση των

υπαρχόντων μεθοδολογιών.

Αν στο εγγύς μέλλον πραγματοποιηθεί το όνειρο την αλληλούχισης του

ανθρωπίνου γονιδιώματος με κόστος της τάξης των μερικών χιλιάδων δολαρίων, θα

είμαστε σε θέση να δημιουργήσουμε μια βάση δεδομένων με τα χαρακτηριστικά του

κάθε ατόμου. Κατ’ αυτό τον τρόπο θα βελτιωθεί η διάγνωση και η θεραπεία

ασθενειών αλλά μπορεί να είμαστε σε θέση να ελέγξουμε την προδιάθεση που μπορεί

να παρουσιάζουν κάποια άνθρωποι στο να ασθενήσουν μελλοντικά.

Η ανακάλυψη των μεταλλάξεων που καθορίζουν οι φαινότυποι αποτελεί μια

θεμελιώδη αρχή στη γενετική, η οποία θα βασιστεί τα μέγιστα από τις τεχνικές

αλληλούχισης της επόμενης γενιάς. Οι συνηθισμένες τεχνικές εστίαζαν στην

ανεύρεση των μεταλλάξεων χρησιμοποιώντας την PCR για τον πολλαπλασιασμό

συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος ανιχνεύοντας τις πιθανές αλλαγές.[45]

Στην διάθεσή μας υπάρχουν διαθέσιμα τα γονιδιώματα από βακτήρια που προκαλούν

ιούς ή ασθένειες. Τα τμήματα αυτά από την φύση τους είναι σε θέση να

μεταλλάσσονται έτσι θα θέλαμε την γρηγορότερη δυνατή ανίχνευση της αλλαγής

αυτής. Ένα από τα οφέλη της NGS είναι να μας δώσει γρήγορα και ακριβή

αποτελέσματα των αλλαγών αυτών.

Παρ’ όλα αυτά, όλες οι εμπορικά διαθέσιμες πλατφόρμες βασίζονται σε κάποια

κοινά χαρακτηριστικά.[100]

1. Σε όλες τις πλατφόρμες τα δείγματα προς αλληλούχιση ενισχύονται

(πολλαπλασιάζονται) με τη χρήση πολυμεράσης μετά από τη δέσμευση τους

σε μία στερεή επιφάνεια (γυάλινο πλακάκι ή μικροσφαιρίδιο). Η ενίσχυση

αυτή είναι απαραίτητη ώστε οι αντιδράσεις αλληλούχισης να παράγουν

αρκετό σήμα ούτως ώστε να είναι ανιχνεύσιμες από το οπτικό σύστημα της

πλατφόρμας.

2. Η αλληλούχιση στις πλατφόρμες αυτές πραγματοποιείται ως μία καλά

οργανωμένη σειρά επαναλαμβανόμενων βημάτων, τα οποία λαμβάνουν χώρα

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


και καταγράφονται αυτόματα. Ο τρόπος που αυτό επιτυγχάνεται, διαφέρει

από πλατφόρμα σε πλατφόρμα, τονίζοντας την εκπληκτική καινοτομία στην

χημεία, μοριακή βιολογία και μηχανική η οποία απαιτείται για να λάβουμε τις

πληροφορίες της αλληλουχίας από τις εκατοντάδες μορίων DNA παράλληλα.

Ασχέτως των λεπτομερειών της κάθε πλατφόρμας, η αλληλούχιση επόμενης

γενεάς διακρίνεται από αυτήν κατά Sanger από το γεγονός ότι οι πληροφορίες

παράγονται σταδιακά από βάση σε βάση και όχι από τον ηλεκτροφορητικό

διαχωρισμό και ανίχνευση των ήδη πραγματοποιημένων αντιδράσεων.

3. Σε κάθε περίπτωση, ο όγκος των πληροφοριών που παράγονται κατά την

αλληλούχιση είναι πάρα πολύ μεγάλος. Η έμφαση στην ανάλυση λοιπόν έχει

μετακινηθεί από την παραγωγή των πληροφοριών στην ανάλυση τους. Το

γεγονός αυτό έχει δημιουργήσει την ανάγκη για νέα εργαλεία

βιοπληροφορικής, τα οποία να συνδυάζουν τις ακόλουθες ιδιότητες:

a. Αρχική ανάλυση για καθορισμό των πληροφοριών που μπορούν να

χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω ανάλυση (απόρριψη αλληλουχιών

κακής ποιότητας, αλληλουχίες που υπάρχουν εις διπλούν κ.α.)

b. Στοίχιση των αλληλουχιών που προκύπτουν με το γονιδίωμα

αναφοράς

c. Σύγκριση και αξιολόγηση των αλληλουχιών με το γονιδίωμα

αναφοράς

d. Ταχύτητα

10. Συμπεράσματα

Η τεχνολογία της αλληλούχισης του γονιδιώματος όπως καταλαβαίνουμε

αποτελεί μια τεράστια πηγή δεδομένων που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε στην

ιατρική, την γεωπονία, την βιολογία, την κτηνιατρική κ.α.. Σκοπός των ερευνών

αυτών είναι βελτίωση της ζωής του ανθρώπου είτε άμεσα με την πρόληψη ή την

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


θεραπεία ασθενειών, είτε έμμεσα από την βελτίωση των τροφών και του

περιβάλλοντος μέσα στο οποίο ζει.

Τα τελευταία δέκα χρόνια, η ανάλυση του γενετικού υλικού έχει προχωρήσει με

τεράστια βήματα στην χρήση τεχνολογίας αλληλούχισης επόμενης γενεάς σε

ερευνητικό επίπεδο με σκοπό να απαντήσει πληθώρα ερωτημάτων που προέκυψαν

από τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου (και άλλων) γονιδιώματος. Η χρήση της

τεχνολογίας αυτής μεταφέρεται με ταχύτατους ρυθμούς και στην κλινική πρακτική,

όπου εφαρμόζεται όλο και περισσότερο τόσο για την ταχύτερη διάγνωση

κληρονομούμενων νοσημάτων με γνωστή αιτιολογία, για την ανάλυση πολλών

γονιδίων παράλληλα σε σύνδρομα με επικαλυπτόμενο φαινότυπο, όσο και στην

ογκολογική διάγνωση με σκοπό την στοχευμένη θεραπεία. [101]

Η εξέλιξη των μεθόδων έκανε δυνατό, ακόμα και για μια ερευνητική ομάδα, να

παράγει μεγάλο αριθμό δεδομένων αλληλούχισης σε σύντομο χρονικό διάστημα με

μικρό κόστος ξεπερνώντας τους φραγμούς και τα όρια που έβαζαν οι πρώτες μέθοδοι

αλληλούχισης. Δεν είναι όμως μόνο ο χρόνος και το κόστος το οποίο θα πρέπει να

βελτιωθεί με τις νέες μεθόδους. Θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην ακρίβεια

των αποτελεσμάτων και τους περιορισμούς που έχουν οι νέες μέθοδοι.

Οι μέθοδοι που ήδη γνωρίζουμε έχουν περιθώρια βελτίωσης και θα πρέπει να

πραγματοποιηθούν πρόσθετες επενδύσεις ώστε να ερευνηθούν επαρκώς παράγοντες

που δεν συμπεριλήφθηκαν σε προηγούμενες έρευνες.

Μπορεί το κόστος απόκτησης μια συσκευής αλληλούχισης να μειώνεται ωστόσο

παραμένει ιδιαιτέρα αυξημένο. Το κόστος αλληλούχισης ανά βάση παραμένει

υψηλότερο από τη συσκευή αλληλούχισης. Η επιλογή της κατάλληλης συσκευής ή ο

συνδυασμός συσκευών για ένα πρόγραμμα συχνά φέρνει καλύτερα αποτελέσματα.

Αυτό μπορεί να ανοίξει την αγορά περαιτέρω στις εταιρείες να προσφέρουν

υπηρεσίες αλληλούχισης κατά παραγγελία αλλά αυτό δεν μπορεί να καταργήσει τα

ερευνητικά εργαστήρια να παράγουν δεδομένα και να τα αναλύουν για ίδια χρήση.

Η αλληλούχιση του DNA έχει στραφεί προς νέες μεθόδους που χρησιμοποιούν

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


μονόκλωνα μόρια DNA χωρίς την δημιουργία βιβλιοθηκών ή πολλαπλασιασμού

τους, για την αναγνώριση συγκεκριμένων τροποποιήσεων των νουκλεοτιδίων και την

ικανότητα να παράγουν μεγαλύτερου μήκους αλληλουχίες. Η εξέλιξη αυτή θα

βοηθήσει να επεκταθεί η έρευνα σε περισσότερες περιοχές, να γίνει η επεξεργασία

των δεδομένων ευκολότερη και να μειωθεί το κόστος περαιτέρω ώστε να πετύχουμε

τον στόχο των $1000 για το ανθρώπινο γονιδίωμα. Όταν αυτό συμβεί θα

προχωρήσουμε στην εξατομικευμένη ιατρική. Σ΄ αυτή την περίπτωση θα είμαστε σε

θέση να προσφέρουμε εξατομικευμένα γονιδιακά τεστ που σκοπό τους θα έχουν να

διαγνώσουν παθήσεις, στις οποίες να μπορούμε να προσφέρουμε την καλύτερη

δυνατή θεραπεία.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


11. Πρόταση διδασκαλίας της αλληλούχισης του DNA σε

μαθητές Λυκείου.

Το μάθημα της αλληλούχισης του DNA δεν περιέχεται στην διδακτέα ύλη της

βιολογίας για μαθητές Γυμνασίου ή Λυκείου την παρούσα στιγμή.

Τι περιλαμβάνει το μάθημα;

Υπάρχουν τρεις συνιστώσες σ’ αυτό το μάθημα

1. Εξήγηση της αλληλούχισης του DNA χρησιμοποιώντας σημασμένα

νουκλεοτίδια με φθορίζουσα ουσία.

2. Ανάλυση των δεδομένων για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας

3. Ηθικές επιπτώσεις: οι μαθητές θα εξετάσουν αν είναι σκόπιμο και θεμιτό

να έχουμε πρόσβαση στη γενετική πληροφορία του κάθε ανθρώπου.

Μαθησιακά αποτελέσματα

Γνώσεις των μαθητών σε αντικείμενα υψηλότερου επιπέδου από αυτό του

σχολείου. Στόχοι της επιστήμης για την αλληλούχιση του ανθρωπίνου γονιδιώματος

και οφέλη από την έρευνα στον άνθρωπο.

Σκοπός

Οι μαθητές θα είναι σε θέση:

α. να γνωρίζουν και να περιγράφουν το πώς μπορούνε να αλληλουχίσουμε την

αλυσίδα του DNA.

β. να διαβάσει τα αποτελέσματα της αλληλούχισης

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


γ. να λάβει μέρος σε συζητήσεις που άπτονται σε θέματα αλληλούχισης,

ελέγχου μεταλλάξεων και τα ηθικά διλήμματα που πρέπει να απαντηθούν.

Προηγούμενες γνώσεις που πρέπει να έχουν οι μαθητές

Λόγω της απουσίας του μαθήματος της Βιολογίας από τα βασικά μαθήματα στην

ύλη της πρώτης και δεύτερης τάξης του Λυκείου το μάθημα μπορεί να παρουσιαστεί

ή σε μαθητές της Γ’ τάξης του Λυκείου ή σε και όλους τους μαθητές των υπολοίπων

τάξεων αφού προηγηθεί μια σύντομη ενημέρωσή τους, περί του DNA. Η ενημέρωση

αυτή θα περιλαμβάνει την ύλη του μαθήματος του 1ου Κεφ της Βιολογίας Γ’ Λυκείου

Θετικής Κατεύθυνσης που αφορά το DNA.

Διδασκαλία

1η ώρα Διδασκαλίας (θεωρία του

αντικειμένου)

Ο εκπαιδευτικός ξεκινά το μάθημα

αναφέροντας ότι η πιο διαδεδομένη μέθοδος

αλληλούχισης του DNA για μήκος 500-800

bases (βάσεων) είναι η μέθοδος την οποία

εξέλιξε ο. Frederick Sanger για την οποία το

1980 έλαβε το βραβείο Nobel. Το μήκος αυτό

είναι πολύ μικρό αν το συγκρίνουμε με το

μήκος του ανθρώπινου γονιδιώματος.

Με την αλληλούχιση είμαστε σε θέση να

γνωρίζουμε την ακριβή σειρά των νουκλεοτιδίων σε ένα δείγμα DNA. Η αλυσίδα του

DNA αποτελείται από

δεοξυνουκλεοτίδια των οποίων

η μορφή είναι αυτή του

παρακάτω σχήματος.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Στην θέση του 3’ άνθρακα υπάρχει μια υδροξυλομάδα η οποία κατά την επέκταση

την αλυσίδας του DNA το υδρογόνο αποκόπτεται και συνδέεται με τον φώσφορο του

5’ άνθρακα του ερχόμενου δεοξυνουκλεοτιδίου δημιουργώντας ένα φωσφοδιεστερικό

δεσμό.

Η δομή του μονού κλώνου έχει την μορφή που φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Στο

εσωτερικό του κλάδου υπάρχουν οι βάσεις των οποίων την σειρά αναζητούμε.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Πριν ξεκινήσουμε θα πρέπει να έχουμε επαρκή αριθμό μονόκλωνου DNA το

οποίο θα παραχθεί με PCR. Συγκεκριμένα το δίκλωνο DNA θα διαχωριστεί σε

μονόκλωνο σε θερμοκρασία 95οC περίπου. Στους κλώνους που θα παραχθούν θα

προσδεθούν εκκινητές και υπό την παρουσία της DNA πολυμεράσης θα επεκταθούν

δημιουργώντας νέο δίκλωνο DNA. Έτσι θα δημιουργηθούν δύο νέοι κλώνοι. Η

διαδικασία αυτή θα επαναληφθεί μέχρι να παραχθεί επαρκής αριθμός κλώνων.

Primer 2 Primer 1 5’

5’

3’

3’

New DNA strand

New DNA strand

+

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Στην διδεοξυ αλληλούχιση (αλληλούχιση κατά Sanger) χρησιμοποιούμε μια

παρόμοια διαδικασία μόνο που δεν χρησιμοποιούνται δύο εκκινητές αλλά ένας, μόνο

για τον ένα κλάδο.

Έτσι θα επεκταθεί ο ένας μόνο κλάδος.

Τι θα συμβεί όμως αν κατά την προσθήκη των νουκλεοτιδίων δεν προστεθεί ένα

δεοξυ νουκλεοτίδιο αλλά ένα διδεοξυ νουκλεοτίδιο; Η διαφορά μεταξύ τους είναι ότι

ο 3’ άνθρακας τους διαφέρει στο ότι το μεν πρώτο έχει μια ομάδα υδροξείδιο το μεν

δεύτερο ένα μόνο υδρογόνο. Για να επεκταθεί η ραχοκοκαλιά του DNA όπως

ειπώθηκε και πριν για την δημιουργία ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού απαιτούνται ο

3’ άνθρακα να έχει μια ομάδα υδροξειδίου για να συνδεθεί με την φωσφορική ομάδα

του ερχόμενου νουκλεοτιδίου με απελευθέρωση ενός Η+ και του PPi

πυροφωσφορικού. Εάν το υδροξείδιο απουσιάζει τότε το ερχόμενο νέο νουκλεοτίδιο

δεν μπορεί να ενσωματωθεί στην αυξανόμενη αλυσίδα. Έτσι η διαδικασία θα

τερματιστεί.

Primer 1

5’

5’

3’

3’

New DNA strand

+

5’ 3’

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Προβολή του βίντεο του παρακάτω συνδέσμου μετά το 20’’.

https://www.youtube.com/watch?v=bEFLBf5WEtc

Ξεκινάμε με οπτική περιγραφή των dNTPs, και την διαφορά τους με τα ddNTPs

Συνεχίζει με την περιγραφή όλων των πιθανών dNTPsκαι παρουσιάζει την διακοπή

της σύνθεση όταν συνδεθεί ένα ddNTP με παράδειγμα με διαφορετικό ddNTP κάθε

φορά. Τα αποτελέσματα ηλεκτροφορούνται σε gel για να διαχωριστούν, στο τέλος

της διαδικασίας παίρνουμε την αλληλούχιση.

Ένα εξίσου καλό βίντεο της όλη διαδικασίας μικρότερης διάρκειας (αν δεν

προλαβαίνουμε) είναι το https://www.youtube.com/watch?v=nudG0r9zL2M

Παράδειγμα της διαδικασίας

Ας υποθέσουμε ότι έχουμε ένα τμήμα DNA όπως αυτό που φαίνεται παρακάτω

και επιθυμούμε να βρούμε την αλληλουχία του. Αυτό θα το αποκαλούμε εκμαγείο

DNA.

5′-ATGCGCCATTGCCATACAAGCT-3′

3′-TACGCGGTAACGGTATGTTCGA-5′

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Θα χρειαστούμε:

Εκμαγείο DNA

Taq DNA πολυμεράση

Εκκινητή

Κανονικά dNTP όπως δηλαδή dATP δεοξυ τριφωσφορική αδενίνη, dGTP

δεοξυ τριφωσφορική γουανίνη, dCTP δεοξυ τριφωσφορική κυτοσίνη, dTTP

δεοξυ τριφωσφορική θυμίνη

Μικρό αριθμό διδεοξυνουκλεοτιδίων ddNTPs (ddTTP, ddCTP, ddGTP,

ddATP), σημασμένα με φθορίζουσα ουσία διαφορετικού χρώματος

Αρχικά το δείγμα του DNA μετουσιώνεται σε θερμοκρασία 950C για να διαχωριστεί

το DNA σε μονούς κλώνους. Στη συνέχεια η θερμοκρασία μειώνεται και συνδέεται

ένα εκκινητής στο κλάδο ο οποίος είναι συμπληρωματικός του 3’ τμήματος του

εκμαγείου DNA

5′-ATGCGCCA-3′

3′-TACGCGGTAACGGTATGTTCGA-5′

Η θερμοκρασία αυξάνεται ξανά και υπό την επίδραση της Taq DNA

πολυμεράσης ξεκινά την επέκταση του εκκινητή συμπληρώνοντας κάθε φορά με την

κατάλληλη βάση κατά την φορά που δείχνει το βέλος.

Κάθε φορά που η DNA πολυμεράση προσθέτει ένα “κανονικό” νουκλεοτίδιο η

προσθήκη συνεχίζεται κανονικά χωρίς διακοπή. Αν κάποιο από τα προστιθέμενα

νουκλεοτίδια δεν έχουν την 3’ ΟΗ ομάδα η προσθήκη σταματά και η πολυμεράση

απομακρύνεται από τον κλάδο.

Η ίδια διαδικασία πραγματοποιείται για κάθε εκμαγείο με την μόνη διαφορά ότι η

διακοπή προσθήκης νουκλεοτιδίων δεν επιτυγχάνεται κάθε φορά στο ίδιο σημείο,

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


αλλά σε διαφορετικό. Έτσι παράγονται τμήματα που έχουν διαφορετικό μήκος.

5′-ATGCGCCATTGCCATACAAGCT-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATACAAGC-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATACAAG-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATACAA-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATACA-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATAC-3′

5′-ATGCGCCATTGCCATA-3′

5′-ATGCGCCATTGCCAT-3′

5′-ATGCGCCATTGCCA-3′

5′-ATGCGCCATTGCC-3′

5′-ATGCGCCATTGC-3′

5′-ATGCGCCATTG-3′

5′-ATGCGCCATT-3′

5′-ATGCGCCAT-3′

5′-ATGCGCCA-3′

Τα τμήματα μπορούν να διαχωριστούν με μια διαδικασία που ονομάζεται

ηλεκτροφόρηση η οποία τα διαχωρίζει με βάση το μέγεθός τους και πραγματοποιείται

με την βοήθεια τους gel πολυακρυλαμίδης. Όταν εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο στο

πλακίδιο τα αρνητικά φορτισμένα τμήματα του DNA κινούνται κατά μήκος αυτής με

διάφορους ρυθμούς εξαιτίας του βάρους τους (του μεγέθους τους που εξαρτάται από

τον αριθμό νουκλεοτιδίων). Τα μικρότερα σε μέγεθος τμήματα κινούνται

γρηγορότερα και διατρέχουν μεγαλύτερη απόσταση στον ίδιο χρόνο.

Εξ αιτίας του διαφορετικού χρώματος που έχουν οι τερματικοί όροι, με τον

διαχωρισμό τους είναι άμεσα αντιληπτή η αλληλουχία των βάσεων. Η λήψη των

φωτεινών σημάτων δημιουργεί ένα χρωματογράφημα. Γνωρίζοντας ποιο χρώμα

αντιστοιχεί σε κάθε βάση η αλληλούχιση δεν είναι κάποια δύσκολή εργασία. Η όλη

διαδικασία μπορεί να αυτοματοποιηθεί με την χρήση H/Y.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


2η ώρα Διδασκαλίας

Ερωτήσεις για προβληματισμό

Μετά από 13 χρόνια έρευνας το ανθρώπινο γονιδίωμα αλληλουχίθηκε. Το

απαρτίζουν 3,5 δισεκατομμύρια βάσεις. Αν θέλαμε να καταλάβουμε το μέγεθος ας

σκεφτούμε ένα τηλεφωνικό κατάλογο με 500000 σελίδες. Μόνο το 0,01 του

ανθρώπινου γονιδιώματος διαφέρει μεταξύ του. Μέσα σ’ αυτό υπάρχουν

διασκορπισμένα τα γονίδια τα οποία παρασκευάζουν τις απαραίτητες πρωτεΐνες,

δημιούργησαν τα άκρα μας, τις ορμόνες που εκκρίνουν τα διάφορα όργανα του

σώματός μας, το πότε τα κύτταρα θα διαιρεθούν ή θα νεκρωθούν. Οι λειτουργίες που

πραγματοποιούν τα γονίδια τεράστια και περίπλοκη.

Εργασία προς τους μαθητές

Να λύσουν την αλληλουχία του χρωματογραφήματος.

Απάντηση: ATGGACTCGCTATCTGTCAACCA

Ερώτησή μας προς τους μαθητές.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Γιατί να θέλουμε να αλληλουχίσουμε το DNA;

Πιθανές απαντήσεις

Για επιβεβαίωση ότι χρησιμοποιούμε το σωστό τμήμα του DNA για μελέτη

στο εργαστήριο π.χ. για κλωνοποίηση

Για να αναγνωρίσουμε αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε γονίδια τα οποία

μπορεί να βοηθήσουν στην διάγνωση ασθενειών π.χ. αν ένας άνθρωπος φέρει

μια γενετική ασθένεια.

Για να συγκρίνουμε αλληλουχίες του DNA ώστε να βρεθούν διαφορές και

ομοιότητες μεταξύ των ειδών για να κατανοήσουμε την εξέλιξή τους.

Για την κατανόηση της σχέσης μεταξύ γονότυπου και φαινότυπου

Για την εξιχνίαση εγκλημάτων

Το ηθικό δίλημμα της αλληλούχισης

Οι μαθητές πρέπει να ερευνήσουν ποιες ασθένειες μπορούν να ανιχνευθούν μέσω

του γενετικού ελέγχου.

Ο έλεγχος του γενετικού μας κώδικα μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία μας για

πολλές ασθένειες. Αν και η κατάσταση είναι περίπλοκη, εταιρείες μας προσφέρουν

την δυνατότητα να γνωρίσουμε τον γενετικό μας χάρτη, πόσο κινδυνεύουμε να

ασθενήσουμε από κάποιες ασθένειες ή ποια τάση διαθέτουμε να πάθουμε κάτι. Στην

παρούσα κατάσταση υπάρχει το εξής δίλημμα του κατά πόσο είμαστε σε θέση να

διαχειριστούμε τα κακά μαντάτα μια τέτοιας έρευνας.

Μελλοντικά μπορεί να είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε περισσότερα

χαρακτηριστικά όπως για παράδειγμα μυϊκή δύναμη, αφυΐα, εθισμό κ.α.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ερώτηση προς τους μαθητές

Εργαστείτε σε ομάδες και σκεφτείτε τις πληροφορίες που θα θέλατε να γνωρίζετε

εάν είχατε αλληλουχίσει το γονιδίωμά σας.

Ενίσχυση σκέψης

Όσο θα συζητούν την ερώτηση θα πρέπει να χρησιμοποιήσουν τις γνώσεις τους

για το τι είναι δυνατό να μάθουμε σήμερα από την αλληλούχιση και για το τι

ελπίζουμε να γίνει στο μέλλον. π.χ.

μπορεί να έχετε προδιάθεση να ασθενήσετε στον διαβήτη οπότε να αλλάξετε τις

διατροφικές σας συνήθειες

μπορεί να έχετε μια μη ιάσιμη ασθένεια έτσι να αποφασίσετε να ζήσετε την ζωή

σας στο έπακρο

μπορεί να έχετε ένα ταλέντο και θα πρέπει να το καλλιεργήσετε

Ερώτηση. Για ποιο λόγο να θέλουν οι άνθρωποι πρόσβαση στο γενετικό τους

προφίλ; (παρότρυνση της συζήτησης)

Οι γενετιστές θα το έβρισκαν ιδιαιτέρα χρήσιμο για την έρευνά τους διότι θα

μπορούσαν να καθορίσουν ποια αλληλόμορφα γονίδια είναι υπεύθυνα για

μεταλλάξεις και την πρόκληση ασθενειών. Οι πληροφορίες αυτές θα οδηγούσαν σε

ένα αγώνα από μέρους των επιστημόνων να επιλύσουν το πρόβλημα της ασθένειας.

Θα μπορούσε στο μέλλον να χρησιμοποιηθεί η πληροφορία για ένα παιδί το οποίο

έχει ιδιαίτερες ικανότητες π.χ. στο αθλητισμό και να τις καλλιεργήσει περισσότερο.

Σήμερα ακολουθούμε την σειρά: ασθενώ και στη συνέχεια λαμβάνω φάρμακα για

την θεραπεία ή την ανακούφιση των συμπτωμάτων της ασθένειας. Τι θα συνέβαινε αν

δίναμε φάρμακα στοχευμένα για να μην παρουσιαστούν οι ασθένειες; Οι

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


φαρμακοβιομηχανίες πως θα αντιδρούσαν στην μείωση των κερδών τους;

Οι γονείς θα ήθελαν να γνωρίζουν για το γενετικό κώδικα του παιδιού τους ώστε

να βοηθηθούν στην ανατροφή και την διαπαιδαγώγησή τους. Σ’ αυτή την ερώτηση

οι μαθητές θα πρέπει να έρθουν στη θέση των γονέων τους.

Να γίνει συζήτηση και να βάλουν σε μια σειρά τις παραπάνω ομάδες

(επιστήμονες, φαρμακοβιομηχανίες, σχολείο, γονείς) με βάση για το ποιος πιστεύεται

ότι θα πρέπει να έχει πρόσβαση στον γενετικό κώδικα. Κάθε ομάδα θα πρέπει να

αιτιολογήσει την άποψή της.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Δραστηριότητα μαθητών - Χρωματογράφημα

Στην παρακάτω εικόνα παρατηρούμε ένα χρωματογράφημα. Κάθε κορυφή

αντιστοιχεί σε ένα νουκλεοτίδιο της αλυσίδας του DNA. Τα χρώματα που

αντιστοιχούν στις βάσεις είναι

κόκκινο = T, μαύρο = G, μπλε = C, πράσινο = A

Χρησιμοποιώντας την παραπάνω αντιστοιχία να βρείτε την αλληλούχιση της 5ης

και 6ης γραμμής του γραφήματος. Υπάρχουν κενά στην υπάρχουσα αλληλούχιση την

οποία θα πρέπει να συμπληρώσετε.

Περαιτέρω συζήτηση

Για ποιο άλλο λόγο θα πρέπει να αλληλουχιθεί το DNA;

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Περίληψη

Με την ανακάλυψη του DNA κανείς δεν θα περίμενε την εξέλιξη που θα είχε η

επιστήμη της βιολογίας. Άμεσα οι επιστήμονες κατάλαβαν ότι η σειρά με την οποία

τοποθετούνται οι βάσεις στην αλυσίδα του DNA μόνο τυχαία δεν μπορεί να είναι.

Έτσι ξεκινά μια προσπάθεια, από λίγους ερευνητές αρχικά, στο να κατασκευάσουν -

εφεύρουν τεχνικές με τις οποίες θα είναι σε θέση να προσδιορίζουν την αλληλουχία

με την οποία είναι τοποθετημένες οι βάσεις στο DNA. Η πρώτη επιτυχία έρχεται σε

τμήμα tRNA το μήκος του οποίου περιλαμβάνει μικρό αριθμό βάσεων. Στα τέλη της

δεκαετίας του 1960 ο Sanger καταφέρνει να αναπτύξει την μέθοδο αλληλούχισης με

την ονομασία συν – πλην. Σχεδόν ταυτόχρονα οι Maxam και Gilbert παρουσιάζουν

την εργασία τους με την οποία καταφέρνουν να αλληλουχίσουν το DNA

αποικοδομώντας το με χημικές μεθόδους.

Δύο χρόνια μετά την επιτυχία του ο Sanger εξελίσσει την μέθοδό του

χρησιμοποιώντας διδεοξυ – νουκλεοτίδια ddNTPs τα οποία μπορούν να σταματήσουν

την επέκταση της αλυσίδας του DNA εξ’ αιτίας της παρουσίας του H στο 3΄ άνθρακα.

Διαχωρίζοντας τα τμήματα του DNA με ηλεκτροφόρηση καταφέρνει να τα

αλληλουχίσει. Λόγω του ότι οι παραπάνω μέθοδοι χρησιμοποιούν ραδιενεργά υλικά η

τελευταία μέθοδος του Sanger βελτιώνεται χρησιμοποιώντας φθορίζοντα υλικά στη

θέση των ραδιενεργών. Η μέθοδος του Sanger παραμένει η πιο επιτυχημένη μέθοδος

εξ αιτίας της απλότητας που παρουσιάζει με βασικό μειονέκτημά της όμως τον μικρό

αριθμό βάσεων που μπορεί να αναγνωρίσει.

Όλο και περισσότεροι ερευνητές εισέρχονται στο πεδίο της αλληλούχισης με

αποτέλεσμα να δημιουργούνται περισσότερες τεχνικές άλλες με επιτυχία και άλλες με

λιγότερη. Μια από αυτές που είναι ευκολότερη, οικονομικότερη και γρηγορότερη από

του Sanger είναι η μέθοδος της πυραλληλούχισης την οποία ανέπτυξε ο Pål Nyrén. Η

μέθοδος βασίζεται στην απελευθέρωση του πυροφωσφορικού που πραγματοποιείται

μετά την συμπλήρωση με μια βάση του κλάδου του DNA. Το παραγόμενο PPi μετά

από μια σειρά αντιδράσεων δημιουργεί φωτεινό σήμα.

Η επιθυμία των ερευνητών για ταχύτερες, οικονομικότερες και με μεγαλύτερη

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


ακρίβεια μεθόδους δημιουργεί νέες μεθόδους τις οποίες ονομάζουμε αλληλούχιση

επόμενης γενιάς. Η μεγάλη τους προσδοκία είναι η αλληλούχιση του ανθρώπινου

γονιδιώματος με τον οποία θα μπορούμε να ανιχνεύσουμε μεταλλάξεις, και όχι μόνο,

για την μετέπειτα θεραπεία των ανθρώπων. Πλέον τα υλικά είναι λιγότερο επικίνδυνα

αλλά τα δεδομένα είναι πολύ περισσότερα τα οποία δεν είναι σε θέση να τα

επεξεργαστούν με τις κλασικές μεθόδους. Έτσι δημιουργείται ένα νέος τομέας με

μεγάλη προοπτική, αυτός της βιοπληροφορικής. Οι NGS όπως τις ονομάζουν

βελτιώνουν τα αποτελέσματα σε όλους του τομείς. Η πιο πετυχημένη μέθοδος είναι η

Ion Torrent η οποία ανιχνεύει το κατιόν υδρογόνου (H+) που ελευθερώνεται κατά την

πρόσληψη νουκλεοτιδίου.

Πολλές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια τα αποτελέσματα των

οποίων αφήνουν ενθαρρυντικά μηνύματα. Εμφανίζουν όμως αδυναμίες τις οποίες οι

ερευνητικές ομάδες προσπαθούν να βελτιώσουν με στόχο την ολοκλήρωση της

αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος με κόστος κάτω από 1000$.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Abstract

With the discovery of DNA no one would foresee the evolution coming for the

science of biology. Immediately scientists understood that the order in which the

bases in the chain of DNA were anything but random. Thus an effort by a few

scientists starts initially by creating and inventing techniques with which they will be

able to identify the order in which the DNA bases are placed. The first success comes

in a tRNA part the length of which includes a small number of bases. In the late 1960s

Sanger manages to develop the method plus - minus. Almost at the same time Maxam

and Gilbert present their work with which they manage to sequencing DNA with

chemical treatment.

Two years after Sanger’s success Sanger develops his method using

dideoxynucleotides ddNTPs which can stop the extension of the DNA chain due to

the presence of H in 3’ carbon. Splitting the DNA parts using gel electrophoresis, he

manages to sequence them. Because the above mentioned methods use radioactive

materials the later Sanger method is optimized using fluorescent materials in place of

the radioactive materials. The Sanger method remains the most successful method due

to its simplicity, with the small number of bases it can recognize having been its basic

disadvantage.

More and more researchers enter themselves in the field of sequencing resulting to

the creation of more techniques, others having been successful and others not. One of

them which is easier, more economical and faster than Sanger’s is pyrosequencing

developed by Pål Nyrén. This method is based in the release of pyrophosphate which

takes place after the completion with a DNA’s branch base. The PPi produced after a

series of reactions produces a bright signal.

The desire for faster, more economical and more precise methods creates new

methods which are called New Generation Sequencing. Their big perspective is the

sequencing of the human genome with which mutations for the future cure of humans

could be detected.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Nowadays materials are less dangerous and a new prosperous field is created, the field

of bioinformatics. The data is so much that humans are unable to process. The so

called NGS improve the results. The most successful method is Ion Torrent which

detects the hydrogen ion which is released during the intake of the nucleotide.

Many techniques have been developed in recent years the results of which leave

encouraging messages. They have also weaknesses which the research groups try to

improve having as a goal the completion of the sequencing of the human genome with

a cost under 1000$.

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Βιβλιογραφία

1. R. Dahm, "Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic

acid research". Human Genetics 122 (6): 565–81, 2008

2. J., Watson, R., Myers, A., Caudy, J., Witkowski, Ανασυνδυασμένο DNA –

Γονίδια και Γονιδιώματα – Μια Συνοπτική Παρουσίαση, Ακαδημαϊκές Εκδόσεις,

σελ. 4-5, 2007.



σελ. 8-10, 2007.

4. G. Beadle, Ε. L.Tatum, Genetic control of biochemical reactions in Neurospora,

Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 27. pp. 499-506, 1941

5. T. A. Brown, Γονιδιώματα Σύγχρονες Ερευνητικές Προσεγγίσεις, Εκδόσεις

Πασχαλίδη, σελ. 5-7, 2010

6. J. D. Watson, F. Crick, "A structure for deoxyribose nucleic acid", Nature 171

(4356): 737–738, 1953.

7. E. Chargaff, R. Lipshitz, C. Green, Composition of the desoxypentose nucleic

acids of four genera of sea Urchin, J. Biol. Chem., 195, pp 155–160, 1952

8. F. Crick, What Mad Pursuit: A Personal View of Scientific Discovery, Book

review, J. Genet. Vol. 68, No 3, pp. 197-200, 1989

9. R., Dahm, Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic

acid research. Human Genetics 122, 565–581 (2008)

10. G., Wolf, Friedrich Miescher: The man who discovered DNA. Chemical Heritage

21, 10-11, 37–41 (2003)

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


11. P. S. Harper, William Bateson, human genetics and medicine, Human Genetics,

118, (1), pp. 141–151, 2005

12. Chargaff, E. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their

enzymatic degradation. Experientia 6, 201–209 (1950)

13. L. A. Pray, Discovery of DNA Structure and Function: Watson and Crick, Nature

Education 1(1):100, 2008



σελ. 24, 2007.

15. R. E. Dickerson, The DNA helix and how it is read, Sci. Amer. 249:94–111, 1983.

16. Β. Αλεπόρου-Μαρίνου, Α. Αργυροκαστρίτης, Α. Κομητοπούλου, Π. Πιαλόγλου,

Β Σγουρίτσα, Βιολογία Θ. Κ. Γ΄ Γ. Λ., Εκδ. «Διόφαντος» 1999

17. J. Barciszewski, "Pioneers in molecular biology: Emil Fischer, Erwin Schrodinger

and Oswald T. Avery". Postepy biochemii, Vol. 41, Nr 1, pp. 4–6, 1995.

18. Reinert, K., Huson, D., Bioinformatics Support for Genome-Sequencing Projects,

in Bioinformatics, Genomes to Therapies (ed T. Lengauer), Wiley-VCH, 2007.

19. J. Berg et al., Βιοχημεία, Τόμος Ι, ΠΕΚ, σελ. 127-153, 2006

20. C. A. Hutchison III, DNA sequencing: bench to bedside and beyond, Nucleic

Acids Research, Vol. 35, No. 18 6227–6237, 2007.

21. R. L. Sinsheimer, A single-stranded DNA from bacteriophage phi X174, J. Mol.

Biol., Vol. 1, (43), 1959

22. E Mayr, The Growth of Biological Thought, Diversity, Evolution, and Inheritance,

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Library of congress cataloging in publication data, 12η Έκδοση, σελ. 149-155, 2003

23. Bhagwan, Bhagwan; Sharma, R.K. Charaka Samhita. Chowkhamba Sanskrit

Series. pp. sharirasthanam II.26–27, 2009

24. International Human Genome Sequencing Consortium, Initial sequencing and

analysis of the human genome, Nature, Vol. 409, p. 860, 2001

25. WHITFELD PR, WITZEL H., On the mechanism of action of Takadiastase

ribonuclease T1., Biochim Biophys Acta., Vol. 72, pp. 338-341, 1963

26. R. W. Holley at al, Structure of a Ribonucleic Acid, Science, Vol. 147, p.p. 1462-

1465, 1965

27. R. Wu, Nucleotide Sequence Analysis of DNA, I. Partial Sequence of the

cohesive Ends of Bacteriophage λ and 186 DNA, J Mol Biol.; Vol. 51(3), pp. 501-

521, 1970

28 C. Richardson et al., Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid. The repair of

partially single-stranded DNA templates by DNA polymerase, J. Mol. Bio., Vol. 9,

pp. 46-69, 1964.

29. R. Wu, A.D. Kaiser, Structure and Base Sequence in the Cohesive Ends of

Bacteriophage Lambda DNA, J. Mol. Biol., Vol 35, pp. 523-537, 1968



σελ. 122-123, 2007.

31. F. Sanger et al., Use of DNA Polymerase I Primed by a Synthetic Oligonucleotide

to Determine a Nucleotide Sequence in Phage fl DNA, Proc. Nat. Acad. Si. USA Vol.

70, No. 4, pp. 1209-1213, April 1973

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


32. F. Sanger, A. R. Coulson, A Rapid Method for Determining Sequences in DNA

by Primed Synthesis with DNA Polymerase, J. Mol. Biol., 94, 441-448, 1975

33. L. T. C. Franca, E. Carriiho, T. B. L. Kist, A review of DNA sequencing

techniques, Quarterly Reviews of Biophysics, Vol. 35, 2, pp. 169–200, 2002.

34. A. M. Maxam, W Gilbert, A new method for sequencing DNA, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, Vol. 74 (2), pp. 560-56, 1977

35. W. Gilbert, A. Maxam, "The Nucleotide Sequence of the lac Operator". Proc.

Nati. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 70 (12), pp. 3581–4, 1973

36. F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 74 (12), pp. 5463-5467, 1977

37. M.R. Atkinson et al., Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XXXIV.

Termination of chain growth by a 2', 3'-dideoxyribonucleotide, Biochemistry, 8(12),

pp. 4897–4904, 1969

38. R. D. Mitra et al, Fluorecent in situ sequencing on polymerase colonies,

Analytical Biochemistry, 320, pp. 55-65, 2003

39. S.G. Fischer, L.S. Lerman, DNA fragments differing by single base-pair

substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting

theory, Proc. Natl Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 1579-1583, 1983

40. G. W. Slater, G Drouin, Why can we not sequence thousands of DNA bases on a

polyacrylamide gel?, Electrophoresis, Vol. 13, pp. 574-582, 1992

41. S. Anderson, Shotgun DNA sequencing using cloned DNase I-generated

fragments, Nucleic Acids Research 9 (13), pp. 3015–27, 1981

42. R. Staden, A strategy of DNA sequencing employing computer programs, Nucleic

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


Acids Res., Vol. 6 (7), pp. 2601–2610, 1979

43 A., Edwards, T., Caskey, Closure strategies for random DNA sequencing Methods:

A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 3, No 1, pp. 41–47,1991

44. A. Edwards et al., Automated DNA Sequencing of the Human HPRT Locus,

Genomics, Vol. 6, No4, pp. 593–608, 1990

45. J., Roach et al, Pairwise end sequencing: a unified approach to genomic mapping

and sequencing, Genomics, Vol. 26 (2), pp. 345–353, 1995

46. A., Chowdhury, Pyrosequencing-An Alternative to Traditional Sanger

Sequencing, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, Vol. 8 (1), pp. 14-

20, 2012

47. P Nyren, Methods in Molecular Biology, vol. 373: Pyrosequencing Protocols, S.

Marsh, Humana Press Inc, pp. 1-15, 2007.

48. P., Nyrén, A., Lundin, Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic

pyrophosphate synthesis, Anal Biochem, Vol. 151(2), pp. 504-509, 1985

49. E.D., Hyman, A new method of sequencing DNA, Anal. Biochem., Vol. 174, pp.

423-436, 1988

50. M. Ronaghi, Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing, Genome Res.,

Vol. 11, pp. 3-11, 2001

51. M. Ronaghi et al., A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate,

Science, Vol. 281, No. 5375, pp. 363-365, 1998

52. T., Nordström et al, Method enabling pyrosequencing on double-stranded DNA,

Anal Biochem.,Vol. 282, pp. 186-93, 2000

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


53. B. Charizadeh, Method Development and Applications of Pyrosequencing

Technology, RIT, DOB, pp. 12-15, 2003

54 B. Charizadeh, Method Development and Applications of Pyrosequencing

Technology, RIT, DOB pp.15-19, 2003

55. M., Ronaghi, Improved performance of pyrosequencing using single-stranded

DNA-binding protein. Analyt. Biochem., Vol. 286, pp. 282–288, 2000.

56. T., Nordström et al, Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-

stranded DNA by pyrosequencing, Biotechnol Appl Biochem, Vol. 31, pp. 107-112,

2000.



58. A. Ahmadiam et al., Analysis of the p53 tumor suppressor gene by

pyrosequencing, BioTechniques. Vol. 28, No. 1, pp.140-147, 2000



60. C. Garcia et al., Mutation detection by Pyrosequencing: Sequencing of exons 5 to

8 of the p53 tumor suppressor gene. Gene, Vol. 253, pp. 249–257, 2000

61. A. Grada, K. Weinbrecht, Next-Generation Sequencing: Methodology and

Application, Journal of Investigative Dermatology, Vol. 133, e11, 2013

62. A., Gogol-Döring W, Chen, An overview of the analysis of next generation

sequencing data. Methods Mol Biol, Vol. 802, pp. 249–57, 2012

63. S., Brenner et al., Gene expression analysis by massively parallel signature

sequencing (MPSS) on microbead arrays, Nat Biotechnol, Vol 18 (10):1021, 2000

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


64. J., Reinartz et al., Massively parallel signature sequencing (MPSS) as a tool for in-

depth quantitative gene expression profiling in all organisms, Brief Funct Genomic

Proteomic. Vol. 1(1) pp. :95-104, 2002

65. S., Brenner et al., In vitro cloning of complex mixtures of DNA on microbeads:

Physical separation of differentially expressed cDNAs, Proc Natl Acad Sci, Vol. 97,

No. 4, pp. 1665–1670, 2000

66. T., Torres et al., Gene expression profiling by massively parallel sequencing,

Genome Res., Vol. 18, No. 1, pp. 172-177, 2008

67. J. Shendure et al., Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial

Genome, Science 309, 1728, 2005

68. R. D. Mitra et al., Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies,

Analytical Biochemistry, Vol 320, pp. 55–65, 2003

69. M. Margulies et al., Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre

reactors, Nature, Vol. 437, pp. 376-380, 2005.

70. E. R. Mardis, Next-Generation DNA Sequencing Methods, Rev. Genomics Hum.

Genet., Vol. 9, pp. 387–402, 2008

71. D., Tawfik, A., Griffiths, Man-made cell-like compartments for molecular

evolution. Nature Biotechnol., Vol. 16, pp. 652–-656, 1998

72. M.,Ronaghi et al., Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate

release, Anal. Biochem., Vol. 242, pp. 84–-89, 1996.

73. M. Kircher, U. Stenzel, J. Kelso, Improved base calling for the Illumina Genome

Analyzer using machine learning strategies, Genome Biology, Vol. 10, No. 8, R83,

2009

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


74. M. Ronaghi, J. Fisher, The Current Status and Future Outlook for Genomic

Technologies, Frontiers of Engineering: Reports on Leading-Edge Engineering from

the 2010 Symposium, pp. 129-138, National Academy of Sciences, 2010

75. F. Chen et al., The History and Advances of Reversible Terminators Used in New

Generations of Sequencing Technology, Genomics Proteomics Bioinformatics, Vol.

11, No. 1, pp. 34–40, 2013

76. S. Schlebusch, N. Illing, Next generation shotgun sequencing and the challenges

of de novo genome assembly, Pharmacogenomics, Vol. 13, No. 8, pp. 901–915, 2012

77. M., Fedurco et al., BTA, a novel reagent for DNA attachment on glass and

efficient generation of solidphase amplified DNA colonies. Nucleic Acids Res., Vol.

34, No. 3, e22., 2006

78. E. Mardis, The impact of next-generation sequencing technology on genetics,

Trends in Genetics, Vol. 24, Issue 3, Pages 142-149, 2008

79. S. Moorthie et al., Review of massively parallel DNA sequencing technologies,

Hugo J.; Vol. 5 (1-4), pp. 1–12, 2011

80. M. J. Berg, L. J. TYMOCZKO, L. STRYER, ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ ΙΙ, ΠΕΚ.

ΣΕΛ. 857, 2010

81. Korkut Ulucan, Applications of Molecular genetics in Personalized Medicine,

OMICS Group eBooks, 2013

82. Yu-Feng Huang et al, Palindromic sequence impedes sequencing-by-ligation

mechanism, 23rd International Conference on Genome Informatics (GIW 2012), 2012

83. R. Okazaki, K, Sakabe, A unique property of the replicating region of

chromosomal DNA, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 129, No. 3, pp. 651–654,

1966

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


84. S. Moorthie et al., Review of massively parallel DNA sequencing technologies,

The HUGO Journal, Volume 5, Issue 1, pp 1-12, 2011

85. J, Shendure, Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial

genome. Science Vol. 309, pp. 1728–1732, 2005

86. H. E. Peckham et al, SOLiD Sequencing and 2-Base Encoding, Applied

Biosystems P.N. 2624.

87. J., Rothberg et al., An integrated semiconductor device enabling non-optical

genome sequencing, Nature, Vol. 475, pp. 348-352, 2011

88. Eisenstein M., The battle for sequencing supremacy, Nat Biotechnol, 30(11):1023-

6, 2012

89. T., Mikolajick et al., The pH-sensing properties of tantalum pentoxide films

fabricated by metal organic low pressure chemical vapor deposition. Sens. Actuators

B Chem., Vol. 44, pp. 262–267, 1997

90. Merriman B. Et al., Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing,

Electrophoresis, Vol. 34, No. 4, pp. 619, 2012

91. J, Rothberg et al., An integrated semiconductor device enabling non-optical

genome sequencing, Nature, 475,348–352, 2011

92. L., Bragg et al., Shining a Light on Dark Sequencing: Characterising Errors in Ion

Torrent PGM Data, Comput Biol, 9(4), 2013

93. M. Metzker, Sequencing technologies – the next generation, Nature Reviews

Genetics, Vol. 11, pp. 31-46, 2010

94. T., Glenn, Field guide to next-generation DNA sequencers, Molecular Ecology

Resources, Vol. 11, No. 5, pp. 759-769, 2011

http://www.nature.com/nature/journal/v475/n7356/full/nature10242.html#auth-1

Ακαδ. Έτος 2014-2015 Κ.Φ.Ε. - Δ.Ε.


95. K., Lieberman et al., Processive Replication of Single DNA Molecules in a

Nanopore Catalyzed by phi29 DNA Polymerase, J. Am. Chem. Soc., Vol. 132, pp.

17961-72, 2010

96. D. Stoddart et al., Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA

oligonucleotides with a biological nanopore, Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, Vol. 106 (19), pp. 7702–7, 2009

97. D., Branton et al., The potential and challenges of nanopore sequencing, Nature

Biotechnology, Vol. 26, pp. 1146 – 1153, 2008

98. Braha, O. et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chem.

Biol., Vol. 4, pp. 497–505, 1997

99. J., Kasianowicz et al., Characterization of individual polynucleotide molecules

using a membrane channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 93, pp. 13770–13773,

1996

100. E. R. Mardis, A decade’s perspective on DNA sequencing technology, Nature

470, pp. 198–203, 2011

101. Α., Απέσσου et al., ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΕΑΣ (NEXT

GENERATION SEQUENCING), 12ο Παν Συνέδρ Κλινικής Χημεία, Αθήνα, 2014

Αλληλούχιση DNA

Documents

Transcript of Αλληλούχιση DNA