ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΜ89 ΚΑΙ ΒΜ88

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ

ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΝΕΥΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Γαϊτάνου Μαρία

Επιβλέποντες: Τμήμα Βιολογίας Καθηγητής Λουκάς Χ. Μαργαρίτης Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ειρήνη Λεκανίδου

Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ Ερευνήτρια Α’ Ρεβέκκα Μάτσα Ερευνήτρια Α’ Αυγή Μαμαλάκη

Κύτταρα του νευρικού συστήματος

•Νευρώνες

•Κύτταρα γλοίας

Αστροκύτταρα

Ολιγοδενδροκύτταρα

Κύτταρα Schwann

KNΣ

ΠNΣ

Νευρώνες Αστροκύτταρα Ολιγοδενδροκύτταρα

Sauvageot and Stiles 2002

Νευρογένεση και γλοιογένεση στον εγκέφαλο αρουραίου

ΜΟΡΙΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗ ΝΕΥΡΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ

ΜΟΡΙΑ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ

ΜΟΡΙΑ ΣΥΝΑΦΕΙΑΣ

π.χ NCAMs της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών

καντερίνες, ιντεγκρίνες

ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ π.χ DCC

EΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΜΟΡΙΑ

ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ

GAP 43

Συναπτοταγμίνη

MAP-2

Bcl 2

BM88

Οι πρωτεΐνες ΒΜ88 και ΒΜ89 προσδιορίστηκαν, με τη βοήθεια μονοκλωνικών αντισωμάτων σε μεμβρανικά παρασκευάσματα εγκεφάλου χοίρου.

Είναι νευροειδικά μόρια, που εμφανίζουν ευρεία κατανομή στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα των θηλαστικών.

ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ88

Νευροειδική διαμεμβρανική μη γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη.

Αποτελείται από δύο ίδιες πολυπεπτιδικές αλυσίδες Μ.Β 22-23 kD, που συνδέονται μεταξύ τους με S-S δεσμούς.

Η έκφραση της BM88 ξεκινά κατά την έναρξη της νευρογένεσης και αυξάνεται με την ηλικία.

Εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενους νευροβλάστες και, ισχυρότερα, από μετα-μιτωτικούς νευρώνες.

Εντοπίζεται στη μεμβράνη ενδοκυτταρικών οργανιδίων (ενδοπλασματικό δίκτυο, εξωτερική μεμβράνη μιτοχονδρίων).

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ88

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 προάγει τη διαφοροποίηση και επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των νευρικών κυττάρων.

• in vitro: Σταθερά μετασχηματισμένα με το ΒΜ88 κύτταρα του νευροβλαστώματος του ποντικού (Neuro2A), παρουσιάζουν μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίηση προς φαινότυπο νευρώνων, τόσο σε μορφολογικό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο. (Mamalaki A. et al., J. Biol. Chem., 1995)

BM88πολλαπλασιασμός

διαφοροποίηση

7

Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα Neuro2 κύτταραεπάγει τη νευρική διαφοροποίησή τους in vitro καθώςκαι την έκφραση της νευροειδικής πρωτεΐνης ΒΜ89.

Νeuro2A Νeurο2A-BM88

4 ημέρες

7 ημέρες

7 ημέρες ΒΜ88

BM88 BM89 BM88 / BM89

N2A-BM88

N2A

25 μm

ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ

1. Διαλεύκανση της πρωτεΐνικής ταυτότητας της πρωτεΐνης ΒΜ89προκειμένου να διερευνηθεί το σηματοδοτικό μονοπάτι νευρικής διαφοροποίησης που ενεργοποιείται από την πρωτεΐνη ΒΜ88 in vitroστα Neuro2A κύτταρα.

2. Μελέτη της δράσης της πρωτεΐνης ΒΜ88 του χοίρου στους μηχανισμούς της νευρικής διαφοροποίησης in vivo, με τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικιών.

3. Tαυτοποίηση και μελέτη των ομόλογων ΒΜ88 πρωτεϊνών του ποντικού και του ανθρώπου, απομόνωση και μελέτη των αντίστοιχων cDNA τους καθώς και απομόνωση και χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδίου ΒΜ88.

ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89

Νευροειδικό μόριο με ευρεία κατανομή στο Κ.Ν.Σ και το Π.Ν.Σ των θηλαστικών.

Βιοχημεία: Διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα ΜΒ 41- 43 kD, ανάλογα με το εξεταζόμενο είδος.

Αναπτυξιακές μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ89 συμπίπτει με την περίοδο της διαφοροποίησης των νευρώνων και της ανάπτυξης των αξόνων τους.

Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ89 στην κυτταρική σειρά N2A σχετίζεται με τις λειτουργικές ιδιότητες της πρωτεΐνης ΒΜ88.

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89 ΑΠΟ ΤΟΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΤΟΥ ΧΟΙΡΟΥ

Affi-gel 10

Anti-mouse IgM μchain-

specific polyclonal antibody

Mab BM89, IgM

Aπομόνωση του αντιγόνου ΒΜ89 από εγκέφαλοχοίρου με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας

1 2

kD

BM89

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΟΛΥΚΛΩΝΙΚΟΥΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ

1 2

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89 ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89 ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΔΥΟ

ΕΣΩΤΕΡΙΚΩΝ ΟΛΙΓΟΠΕΠΤΙΔΙΩΝ

Η ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ cDNA ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89 ΤΟΥΠΟΝΤΙΚΟΥ ΕΔΕΙΞΕ ΟΤΙ ΤΑΥΤΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗ

ΤΩΝ ΣΥΝΑΠΤΙΚΩΝ ΚΥΣΤΙΔΙΩΝ ΣΥΝΑΠΤΟΦΥΣΙΝΗ.

5’

3’(Β)

2.3 kb

1.9 kb

544 bp

cDNA συναπτοφυσίνηςαρουραίου

#1 cDNA συναπτοφυσίνηςποντικού

Προΐόν RT-PCR

#2 cDNA συναπτοφυσίνηςποντικού

3’(Α)

750 bp

13531078872

603

310281234194

118

72

544 bp

1 2 3

bp

Νουκλεοτιδική και αμινοξική αλληλουχία της συναπτοφυσίνης του ποντικού.ATG GACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTT 90

M D V V N Q L V A G G Q F R V V K E P L G F V K V L Q W V F

GCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGCGGCAGCTACACCGGAGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAAC 180 A I F A F A T C G S Y T G E L R L S V E C A N K T E S A L N

ATCGAAGTCGAATTTGAGTACCCATTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTTAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTC 270 I E V E F E Y P F R L H Q V Y F D A P S C V K G G T T K I F

CTAGTTGGTGACTACTCCTCCTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTAC 360 L V G D Y S S S A E F F V T V A V F A F L Y S M G A L A T Y

ATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCAATGATGGACTTCCTGGCCACAGCAGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTT 450 I F L Q N K Y R E N N K G P M M D F L A T A V F A F M W L V

AGCTCATCCGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACTGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCTATGTGCCGCCAG 540 S S S A W A K G L S D V K M A T D P E N I I K E M P M C R Q

ACAGGAAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCGGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGG 630 T G N T C K E L R D P V T S G L N T S V V F G F L N L V L W

GTTGGCAACCTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCCGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCAGAAAAGCAACCAGCT 720 V G N L W F V F K E T G W A A P F M R A P P G A P E K Q P A

CCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTATGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAGGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAA 810 P G D A Y G D A G Y G Q G P G G Y G P Q D S Y G P Q G G Y Q

CCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTACGGCCAACAGGGTGCG 900 P D Y G Q P A S G G G G G Y G P Q G D Y G Q Q G Y G Q Q G A

CCCACCTCCTTCTCCAATCAGATG TAA TCTGGTCAGTGAAGCCCACGAAGACCCCACGGGTGGGCAAGAGCTCAAGAGAAGGCCTGCCCC 990 P T S F S N Q M *

CCTTCCCATCCCCATATCCTAGGTCTCCACCCCTCAACCCAGGAGACCCTGTCTTTGCTGTTTATATATATATATATTATATATAAATAT 1080

CTATTTATCTGTCTGAGCCCTACCTTCACCCACTCCTCCATGCACTAGGGGCCCAGTCCTGAATGGGCTCCTCCCTACCCCTGACCTTGC 1170

ACTCCTCAGCCCCTATCGGTTCCCCAGCCCTGTCCCGTGATGTAAGGGGGCTCTAGAAAGGGGACAGGAAGGGGGCCAGACCTTGGCTGC 1260

ATGGAGTGGGCGATGTGACTTTTTCCCCCTTCCTTCTCTCCCTCTGCCCCTCCTAACTCTAGCCTTGGTTCCTCCAGCATCGCCTGAACT 1350

TAAGAAGCTCTCAAATGGAAATTCAACCCCAAGAGTAGAGGGGTGGAGGTGGCTTGGATGAAATGGGTGGAGAGGAGATGGCCTCTGTAG 1440

AGAGAGGACCAGTCAGCCAAAAGTTGAATTCCACACATACTGGATGTGGAGCCTAAAAGGGAAGTGGTGTCCTACACCATTCTGGAATGG 1530

GGCTAAAAGGGACTGGGGAGAGGGGTACTAGGAGGGGTGTGGCTTAAACACATGGTGGGTTCCGGAGTGGGCAGGTTTGGGTTGGATCCA 1620

GCATCTCTAGAAGGGGTGTGTCTTGGAACATTCAGGAGTTTGAGCTTGATTCCAAAGAGCTTGAGCAAGGCTAGAAGTGGGATTCGGGAA 1710

TGATCTAAGCTTGAGAGAAGGTTCTGGTCAGGATTGCAGACAGGCAGGTGAAGAGGACGAGGGATGTGTGGTGCTCTCAGAAGAGGAAGC 1800

CCATTCTGTAATGGGGCAGAAAAGAAAATACGGTTTCAGTTGAGTGGAGTTTGAGCAGTGGGTGTAGGAGGCCATGGTTGGGAGCTGTGA 1890

GGTGAGTTTTGCTAAAAGTAGGAAGGAGTACTCCTGATTCCACCCCACGCCCCAGAACGGACATAACCTGGGAAGAGCCAAGTATTGTGG 1980

TTTGGAGGGTGAGCGAAATGTCCCTTACTGACTCCCTCAGAAGAGGGCTAGATAATCAGAAGACAGAATCTACAGGTCTGTGGGGCTGGC 2070

CTACCTTCTCCACCCTTTCTCTGCCCTCTCCCTCCACACTCCCGTCTGTCCCGGAGCACTGGGAGGCTGGCTCTGGAGCCCCAATCCTGG 2160

ACCCTCTGCTGTGTCTGTGACGTTGGTAGTGCCTGTGATCGTGTGTTGCCATTTTGTCTGACTGTGGCCCCTCCCTTTTCCCTCCAGACC 2250

CCCTACTTTCCTGTGCCTTCGGTATTGTTTGAAGACCCCCCTCCCCAAGGAAGAGCAAATATGAGAACCCCCCCC AATAAACTCCTCAAC 2340

TATCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

-17 ATTCGGCACGAGCAGAC -1

Σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας του μορίου της συναπτοφυσίνης ανάμεσα στα είδη

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

ΑρουραίοςΒόδιΑνθρωπος

Ποντικός ΨάριTorpedo

Ποσοστά ομολογίας: 92.5% ποντικός-βόδι 94.8% ποντικός-άνθρωπος 100% ποντικός-αρουραίος

ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ SOUTHERN TOYΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΣΥΝΑΠΤΟΦΥΣΙΝΗΣ

ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΤΑ ΕΙΔΗ

εΕπίμυς ε ε εΜύς Χοίρος Ανθρωπος

2020

23130

9410

6550

4310

2320

560

bp

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ89/ ΣΥΝΑΠΤΟΦΥΣΙΝΗΣ ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

ε

εγκε

φ.η

μισ

φα

ίρια

παρε

γκεφ

αλί

δα

νωτι

αίο

ς. μ

υελό

ς

πνεύ

μον

ες

έντε

ρο

νεφ

ρά

σπλή

νας

πάγκ

ρεα

ς

ήπα

ρ

ε

νωτι

αίο

ς . μ

υελό

ς

παρε

γκεφ

αλί

δα

εγκε

φ.η

μισ

φα

ίρια

πνεύ

μον

ες

έντε

ρο

νεφ

ρά

σπλή

νας

πάγκ

ρεα

ς

ήπα

ρ

poly 89

SVP-38

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

›Η κλωνοποίηση του cDNA της πρωτεΐνης ΒΜ89 του ποντικού έδειξε ότι το μόριο αυτό

ταυτίζεται με τη συναπτοφυσίνη. Το cDNA της συναπτοφυσίνης του ποντικού κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά στα πλαίσια αυτής της εργασίας.

›Tο μόριο της συναπτοφυσίνης είναι πολύ καλά συντηρημένο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης,

γεγονός που υποδηλώνει τη μεγάλη σημασία του βιολογικού του ρόλου.

› Το ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα που παρασκευάστηκε μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν

διαγνωστικό εργαλείο σε διαφόρων ειδών ανθρώπινες νεοπλασίες. Συγκεκριμένα έχει ήδη χρησιμοποιηθεί στη μελέτη ανθρώπινων αστροκυτωμάτων (Katsetos et al., Arch. Pathol. Lab. Med., 2001).

›Το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα Neuro2Α κύτταρα επάγει άμεσα ή

έμμεσα την έκφραση της συναπτοφυσίνης, μορίου- δείκτη της τελικής διαφοροποίησης των νευρώνων ενισχύει το νευρογενετικό ρόλο της πρωτεΐνης ΒΜ88.

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ88 ΤΟΥ ΧΟΙΡΟΥΣΤΗ ΝΕΥΡΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΣΕ IN VIVO ΜΟΝΤΕΛΟ

ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΠΟΝΤΙΚΙΩΝ. 76

176

4

767

755

756

775

776

774

782

786

792

796 wt

1.5 kb

HindIII EcoRI EcoRI EcoRI SnabI

Hoxa7500 bp

Tk150 bp

cDNA BM88 1500 bp

SV40 poly A+ 500 bp

A.

B.

(Knittel et al., 1995)

(Hoxa7)

Προϊόν RT-PCR (660 bp )

ΜΎ

ποντ

ικός

Χοίρ

ος

B.

A.

ΒΜ88 -/-

ΒΜ88 +/-

ΒΜ88 +/+ ?

AΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΟΜΟΖΥΓΩΝ ΖΩΩΝ ΩΣ ΠΡΟΣ ΤΟ ΒΜ88 -ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟ ΜΕ SLOT-BLOT ΑΝΑΛΥΣΗ

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΒΜ88 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΧΟΙΡΟΥ ΜΕ RT- PCR ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΕ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΕΤΕΡΟΖΥΓΑ ΕΜΒΡΥΑ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΗΛΙΚΙΑΣ Ε12.5

TΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΟΜΟΛΟΓΩΝ ΒΜ88 ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ.

Εγκ

έφα

λος

αρ

ου

ρα

ίου

Εγκ

έφα

λος

ανθ

ρώ

πο

υ

Εγκ

έφα

λος

πο

ντικ

ού

P0

Εγκ

έφα

λος

πο

ντικ

ού

Εγκ

έφα

λος

χοίρ

ου

BM88

Εγκ

έφα

λος

χο

ίρο

υΕ

γκέφ

αλο

ς α

νθρ

ώπ

ου

Εγκ

έφα

λος

πο

ντικ

ού

67

43

30

14

kD94

20

Μονοκλωνικό αντίσωμα

Πολυκλωνικό αντίσωμα

1. 2. 3.

-DTT

A) B) Γ)

Εγκ

έφαλ

ος χ

οίρο

υ

Εγκ

έφαλ

ος α

νθρώ

που

Εγκ

έφαλ

ος π

οντι

κού

Πολυκλωνικό αντίσωμα

ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ88 ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ

300 μm

75 μm

75 μm

ΒΜ88

NF

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ cDNA ΤΟΥ ΒΜ88 ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

ACGAGGCGCCCATAGAATGCCCAGGGGCGACAAACTGTCCTGAGCCCCTCTGGTGCAGCC 60ACCTGCCTGTCCCATACGCCCCGCCCACCATGGAGTCCAGAGGGAAGTCAGCCAGCAGCC 120 M E S R G K S A S S 10 o

CCAAGCCCGACACCAAGGTGCCCCAGGTCACCACCGAGGCCAAGGTACCCCCGGCAGCCG 180P K P D T K V P Q V T T E A K V P P A A 30

ATGGGAAAGCCCCCTTGACCAAGCCCTCGAAGAAGGAGGCCCCGGCCGAGAAGCAGCAGC 240D G K A P L T K P S K K E A P A E K Q Q 50 o

CGCCAGCAGCCCCCACCACGGCACCTGCCAAGAAGACCTCGGCCAAGGCCGACCCTGCCC 300P P A A P T T A P A K K T S A K A D P A 70 o

TTCTCAACAACCACAGCAACCTGAAGCCAGCCCCCACGGTCCCCAGCAGTCCCGATGCAA 360L L N N H S N L K P A P T V P S S P D A 90

CCCCGGAGCCCAAGGGTCCTGGGGACGGGGCGGAGGAAGATGAGGCTGCCAGTGGGGGGC 420T P E P K G P G D G A E E D E A A S G G 110

CTGGGGGCCGAGGTTCCTGGTCCTGTGAGAACTTCAACCCCCTGCTGGTGGCTGGGGGTG 480P G G R G S W S C E N F N P L L V A G G 130

TGGCCGTGGCAGCCATAGCCCTGATTCTCGGTGTGGCCTTCCTGGTCCGGAAAAAATAAT 540V A V A A I A L I L G V A F L V R K K 149

ACCTGGGGGCCAGGCGGGGGGCACGGAGCCACTTCCTGTACAGACCCGAGGAAGCCAGTG 600CATGCAGAGTTCACCCTTACCTATTCGTACACACGCACATTCATTACACACCTACATACG 660CCCCCAACACACGCGCACGGTGAAGAGGACGCCCGAGCCCACCCCTGCTGACCCAGGACT 720TCCCCAACCTCCAGGGCAGAAAGAGCCCAGGCTCCGGGGTCCACAGCACAGGATGTGGGG 780CGAGGGACAGCTGGGGAACGGCAAGAAAGGAATGGACCCTGTGTGTGGCCCCCCCCACCC 840TGGCGGCTGGGTGATCCTGGGCCCCCAGGGCTGGTCTGAGTGCAGGTGGGGGTGCCGGGA 900TGGGTTGGGCCTGGGCCCGGCCCTCGTGGGGACATTAAAGGGCCCGGTGGCTCCACTCGC 960CCCATTTCTGCTCTTTGCGTACCCCCCGGGGGTCTGCCTGGGCGAATGCAGTGGGACGGA 1020CCTGGGGTGGGCACTCACCTCAGCAGAGCCTCAATGCCACCTCCCCACACCACCCAAGCC 1080TAGCTGGGTGGGAAGACGGAGCCCTGAAGCCTGCGTGTGGAGGGGGTGCTGCAAGGGTCG 1140CCTTCCCCAGCTTGTGCTCCAGGGGAGCCCCGACGCCGGCGGGGAGGCAGGGATGTCGAG 1200GGCCCCTCACAGCTGTGCCCGCCCTGCCCCGCTAGACTGCCCCTCCAGCTTGCACCCAGC 1260ACCACCTGAGTCTAACCAGCGTATAATGCAATAACAGGTAGAGTAGAACTGCTTTTGGCG 1320GCGACCGTCACACACTGTCCTCAGCCCACTGCACCTGGGGAAGCCCCTCGTGCAGCCCCT 1380CCTTAGCACATCCAGTCCCAGCGTGGCCCTTGGGCGGCAGCAGCAGGCGAACTCCCAGAA 1440GGTGGTGGTGGGCACTGTGAGAACGTGGCCTGCCCTCACTGCCAGTGGCCACAGGAACCC 1500CGGGCCTGAGTGGAGGCTGAGTCTGAAATAAACTCTGTCGTCTGAAAAAAAAAAAAAAAA 1560AAAAAAAAAA 1570

GGCACGAGGCGCAGCGAGAAGCTGGAGGGCCCAAAGAAGACACCCATATAATGCCCAGAG 60 GTGAGCTGTCCTGAGCCACTGTGGTCTAGCCACCTGCCAGTCACACAAGCCCCAAACCAG 120 CTGCCAGCAAAAAAACCATCATGGAATCCCGAGGAAAGTCAGCCAGCAGCCCCAAGCCAG 180 M E S R G K S A S S P K P 13 o

ATACCAAGGTGCCTCAGGCCACAGCTGAGGCCAAGGCCACTCCAGCTGCGGATGGGAAAG 240 D T K V P Q A T A E A K A T P A A D G K 33

CTCCCTTGACCAAGCCTGTGAAGAAGGACACCCAAGCAGAGAAGCAGGAGCAAGCAGCAG 300 A P L T K P V K K D T Q A E K Q E Q A A 53

CCCCTGGGCCAGCCGCTACGAAGAAGACACCAGCCAAGGCAGATCCTGTACTTCTCAACA 360 A P G P A A T K K T P A K A D P V L L N 73 o

ACCACAGCAACCTGAAGCCAGCTCCCACAGTGCCGGCAGCCCCCAGCAGTCCTGATGCAA 420 N H S N L K P A P T V P A A P S S P D A 93

CCTCAGAGCCCAAGGGTCCTGGGGATGGGGCAGAGGAGGACGAGTCCAACACTGGAGGCC 480 T S E P K G P G D G A E E D E S N T G G 113

GAGGTCCCTGGCCTTGTGAGAACTTGACCCCTTTGCTGGTAGCTGGGGGTGTGGCCGTGG 540 R G P W P C E N L T P L L V A G G V A V 133

CCACCATAGCTCTAATTCTTGGTGTGGCCTTTCTAGCCCGGAAAAAATGATACCTGGTGT 600 A T I A L I L G V A F L A R K K 149

CCAGGTCGGGGCACAGAGCCACTTTCTGTACAGACCTGAATATATAGTGCATGCAAGGTC 660 CTAGATATTTATCTATACATATACACCTAACAACACACACACAACACACACACACACTCA 720 CACGTATATGTATGCTACATACATCCGTGCAGCAGGAAAGAAATAGACAGTGAGCCCACC 780 TCCACTCACCCCAGCACACCCTCTCCCAAGTTCTGGGGCAGGAGCCCAGCTCTGCAGTTT 840 GCAGGAAGCACTAGCGTGGGGCAAAGGGGAGAGATGCTGGGTGTGGTCTCTGAAAGATAA 900 GTGATGGAGTGCGCTAGCCCTGTGGGGACATTAAAGGGCATGGCTGTCTTACTCCTCTCA 960 CTTGTCTTTTGAGCAGCCAGGAGCAGTCTGTCTGGGCCTGATGCCGGGGGACTGACCTAA 1020 GGGTGGGTGGGAAGACCTGCTGTGCAGCCCCTCTTTAGTGCATCTGGCCCCAGCTTGCCC 1080 CTTGGTGTGGTGACAGTGAGCAGCTTTCCGGAAAACTGCAGTGGGCTCTAAGGAAACATT 1140 GCCCTCACCTGGCCAGTGGCGGCGGGGACCTTGGGCCGGAGTGGAGACTGAGTTTGAAAT 1200 AAACCGTTACAATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1241

GGCACGAGGCGCAGCGAGAAGCTGGAGGGCCCAAAGAAGACACCCATATAATGCCCAGAG 60

ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΒΜ88

ΟΜΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΒΜ88 ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΤΑ ΕΙΔΗ

MESRGRSANSPKADAK---ATTEARAPPAVDGKVPSAK--KQEAQKAEKQ 45 MESRGKSASSPKPDTKVPQVTTEAKVPPAADGKAPLTKPSKKEAP-AEKQ 49 MESRGKSASSPKPDTKVPQATAEAKATPAADGKAPLTKPVKKDTQ-AEKQ 49 *****.**.***.*.* .*.**...**.***.* .* *.... ****

EPPAAPTLPPAKKTSA-----LLDNHSNLKPAP---AAPSSPDAAPEPKG 87 QPPAAPTTAPAKKTSAKADPALLNNHSNLKPAPTVP---SSPDATPEPKG 96 EQAAAPGPAATKKTPAKADPVLLNNHSNLKPAPTVPAAPSSPDATSEPKG 99 ...***. ...***.* **.********* *****..****

PGDGAEEAEAPSGGPGGRGPCPFENLNPLLVAGGIAMAAAALILGVVFLA 137 PGDGAEEDEAASGGPGGRGSWSCENFNPLLVAGGVAVAAIALILGVAFLV 146 PGDGAEEDESNT---GGRGPWPCENLTPLLVAGGVAVATIALILGVAFLA 146 *******.*. . ****. . **..*******.*.*. ******.**.

RKK 140 RKK 149 RKK 149 ***

ΧΟΙΡΟΣΑΝΘΡΩΠΟΣ

ΠΟΝΤΙΚΟΣ

ΧΟΙΡΟΣΑΝΘΡΩΠΟΣ

ΠΟΝΤΙΚΟΣ

ΧΟΙΡΟΣΑΝΘΡΩΠΟΣ

ΠΟΝΤΙΚΟΣ

ΧΟΙΡΟΣΑΝΘΡΩΠΟΣ

ΠΟΝΤΙΚΟΣ

76.4% άνθρωπος-χοίρος79.9% άνθρωπος-ποντικός70.7% ποντικός-χοίρος

ΕΠΑΝΑΛΗΨΕΙΣ ΠΡΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΜΟΤΙΒΑ ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ: PXXP

EPP AA PTL PP AKKTSALLDNHSNLK PAPAA PSSPDAA PEPKG P GDGAEEAEA PSGG P GGRG PC P

QPP AA PTTA PAKKTSAKAD PALLNNHSNLK PAPTV PSS PDAT P EPKG PGDGAEEDEAASGG PGGRGSWS

EQAAA PGP AATKKT P AKAD PVLLNNHSNLK PAPTV PAA PSS PDATSE PKGP GDGAEEDESNTGGRG

=

(47-109)

(50-118)

(50-118)

ΧΟΙΡΟΣ

ΑΝΘΡΩΠΟΣ

ΠΟΝΤΙΚΟΣ

MEΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΒΜ88 ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

. ανθ

ρώ

πο

υ

RN

A ε

γκεφ

φλο

ιός

πα

ρεγ

κεφ

αλί

δα

πρ

ομ

ήκη

ςνω

τια

ίος

μυ

ελό

ς

μετ

ωπ

ιαίο

ς λο

βό

ςκρ

οτα

φια

ίος

λοβ

ός

κέλυ

φο

ς φ

ακο

ειδ

ού

ς π

υρ

ήνα

ινια

κός

πό

λος

BM88

2. 40 kb

1. 35 kb

A)

B)

BM88

RN

A ε

γκεφ

. πο

ντικ

ού

1.8 kb

RN

A H

ela

κυττ

άρ

ων

Μ.Β

β- ακτίνη

D11S 922

IGF2

DRD4

RP_P2BM 88HRAS

H19TH

HNAP2

IPL/ TSSC3

D11S 932

14,50

33,60

22,52

cR 3000

CTSD

BM8811q23

BM88

11q23

B.A.

ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΒΜ88 ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΣΤΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ 11p15.5

( LOC51286, Radiation Hybrid Mapping Consortium, NCBI)

Χαρακτηριστικά της περιοχής 11p15.5 του ανθρώπινου χρωμοσώματος 11.

Εμπεριέχει γενωμικά «εντυπωμένα» γονίδια (IGF2, H19, TSSC3 ) και συνδέεται με πολλές ανθρώπινες ασθένειες, όπως αναπτυξιακές ανωμαλίες (σύνδρομο Beckwith-Wiedemann) και την καρκινογένεση.

› Απομονώθηκαν τα cDNA του ΒΜ88 του ανθρώπου και του ποντικού και

ταυτοποιήθηκαν οι ομόλογες πρωτεΐνες ΒΜ88.

› Η ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης ΒΜ88 έδειξε την ύπαρξη

επαναλήψεων προλίνης του τύπου PXXP, οι οποίες και καθιστούν την πρωτεΐνη

ΒΜ88 ως υποψήφιο μόριο για αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες που περιέχουν SH3

περιοχές (Src- homology domain) στην αμινοξική τους αλληλουχία.

› Ο χρωμοσωμικός εντοπισμός του ανθρώπινου γονιδίου ΒΜ88 στο χρωμόσωμα

11p15.5 σε συνδυασμό με τις ιδιότητές του υποδηλώνουν πιθανή εμπλοκή του ΒΜ88

σε αναπτυξιακές ανωμαλίες ή την καρκινογένεση.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ:

Να εξεταστεί εάν το ΒΜ88 γονίδιο είναι γενωμικάεντυπωμένο.

Να εξεταστεί εάν το ανθρώπινο ΒΜ88 γονίδιο εμπλέκεταισε ανθρώπινες ασθένειες.

Να μελετηθεί το σηματοδοτικό μονοπάτι στο οποίο συμμετέχουνοι πρωτεΐνες ΒΜ88 και ΒΜ89/συναπτοφυσίνη στους μηχανισμούςτης νευρικής διαφοροποίησης.

Η πρωτεΐνη BM88 έχει διπλό ρόλο:συντονίζει την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο

και τη διαφοροποίηση των προδρόμων νευρικών κυττάρων

BM88/Synaptophysin BM88/TuJ-1

Neuro2a Neuro2a-BM88

Neuro2a Neuro2a-BM88

p21p53

E2F

Growtharreststimuli

BM88 cell-cycle signaling pathway+R

b+2μ

g cD

NA

BM

88

+Rb+

4μg

cDN

A B

M88

+Rb

+Rb+

PC

3+R

b+ad

eno-

88

+Rb+

cycl

inD

1

Cyclin D1/BM88

N2A

N2A-BM88

NIH-3T3 cells

Cyclin D1

Cyclin B1

N2A C

ontrol

N2A B

M88-C

3C1

N2A B

M88-C

7G5

Cyclin E α-tubulin

p53

BM88

Georgopoulou et al., J Biol Chem. , 2006

Ευχαριστώ…

Τριμελής επιτροπήΜαργαρίτης Λ.Λεκανίδου Ρ.Μάτσα Ρ.

ΕπιβλέποντεςΜάτσα Ρ.Μαμαλάκη Α.

Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας

Θωμαΐδου Δ.Πολίτης Π.Λάβδας Α.Hurel C.Παπαστεφανάκη Φ.Σεργάκη Μ.Μακρή Γ.Κατσιμπάρδη Λ.Τσιώρας Κ.Κουρούπη Γ.

Πρώην μέλη της ομάδας Μπούτου Φ. Παπαδόδημα Ο. Κουτμάνη Γ.

Ν2Α-ΒΜ88 εκφράζουν NF, βIII -tubulin, SMI311

BM89/synaptophysin

Μεγαλύτερη απόκκρισησε b-FGF FGF-R , NCAM

Η διπλή χρώση ανοσοτυπωμάτων δύο διαστάσεων σε πρωτεϊνικά παρασκευάσματα εγκεφάλου χοίρου έδειξε ότι τόσο το μονοκλωνικό όσο και το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ89 αναγνωρίζουν τη συναπτοφυσίνη όπως και το ειδικό αντίσωμα SVP-38 του εμπορίου.

A

B

Γ

Δ

Ανοσοαποτύπωμα 1ης και 2ης διάστασης

Ανοσοαποτύπωμα 2ης διάστασης

ΒΜ89/ συναπτοφυσίνη

mab89 και poly 89

SVP-38 και poly 89

Κύτταρα του νευρικού συστήματος

Προγονικό κύτταρο νευρώνων

Νευρώνας

Πολυδύναμοπρογονικό κύτταρο

Πολυδύναμοπρογονικό κύτταρο

Μεταγραφικοί παράγοντες

Ομοιοτικοί (Emx, Pax) bHLH (ngn, mash, neuroD)

Ενεργοποίηση νευροειδικών γονιδίων