Υποκυτταρική τοπολογία του μεταφορέα μονοσακχαριτών INT1 στο φυτό Medicago

truncatula

ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗΑΘΗΝΑ ΑΓΓΕΛΙΚΗ ΣΤΕΦΑΝΙΔΗ

ΑΘΗΝΑ 2016

Επιβλέπων, κ. Φλεμετάκης Εμμανουήλ, Επ. Καθηγητής

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝΣΧΟΛΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΣΑΚΧΑΡΑ μονοσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες και

πολυσακχαρίτες 65-85% της φυτικής οργανικής ύλης αποθησαύριση άνθρακα και ενέργειας δομικά συστατικά κυττάρων

ΠΟΛΥΟΛΕΣ παράγωγα γλυκόζης και μαννόζης ωσμοπροστατευτικός ρόλος άμεσα προϊόντα φωτοσύνθεσης

επι- νεο- μυο- μουκο- σκυλλο- 1D-χειρο-

ΙΝΟΣΙΤΟΛΕΣ κυκλιτόλες ισομερή της 6-υδροξυ-κυκλοεξάνης εξαφωσφορική ινοσιτόλη, φυτικό οξύ και άλατα φυτικού οξέος

γλυκόζη σακχαρόζη

μαννιτόλη σορβιτόλη

Ο ρόλος της ινοσιτόλης

μονοπάτι μεταγωγής

σήματος της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης

αποθήκευση και

μεταφορά αυξίνης

βιοσύνθεση φυτικού

οξέος

βιοσύνθεση ασκορβικού

οξέος

βιοσύνθεση κυτταρικού τοιχώματος

απόκριση της καταπόνησης

ρύθμιση κυτταρικού

θανάτου

αντικαρκινικές ιδιότητες

ωσμωρρύθμιση οργάνων θηλαστικών

μείωση φωσφορικών υπολειμμάτων

φωσφόρου

μείωση της μόλυνσης

από λιπάσματα

επίλυση προβλημάτω

ν λόγω αυξημένης αλατότητας

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΑΚΧΑΡΩΝ

Μέσω του φλοιώματος (σακχαρόζη)

Συμπλασμικά(πλασμοδέσματα)

Αποπλασμικά (κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης)

Διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (μεταφορείς μονοσακχαριτών, δισακχαριτών)

MFS (Major Facilitator Superfamily)• Μεταφορείς πλασματικής μεμβράνης• Ενεργειακά εξαρτώμενοι συν-

μεταφορείς πρωτονίων

ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΜΟΝΟΣΑΚΧΑΡΙΤΩΝ

MST (Monosaccharide Sugar Transporter)

Πολυγονιδιακές οικογένειες

Διατροφικός ρόλος

Ωσμωτικά συστατικά

ΦΥΤΑ ΜΟΝΤΕΛΑMedicago truncatula Arabidopsis thaliana

μικρό γονιδίωμαεύκολος ανασυνδυασμός

διπλοειδίαμικρός βιολογικός κύκλος

αυτογονιμοποίησηπροσαρμοστικότητα

μικρό μέγεθος

μικρή κατανομή γονιδιώματοςμεγάλος αριθμός σπερμάτων

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΡΟΗ

SalI SpeI

PciI

PciI

SalI SpeI

AC137838_21.4AC145222_6.4; 12.4 AC146705_38.5 AC146792_8.5 AC149576_11.4AC155101_10.5AC155882_29.4AC195563_6.4AC203546_20.3AC147178_32.4 AC158504_37.4AC187278_19.5AC137838_17.4AC142222_4.5AC187278_19.5

ΜΕΤΑΣΧ/

ΣΜΟΣΛΙΓΟΠΟ

ΙΗΣΗΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA

ΑΛΛΗ ΛΟΥΧΙΣ

ΗPCR

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ

ΒΟΜΒΑΡΔΙΣΜΟΥ

ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ

ΣΑΡΩΣΗΣ

NOBLE

TMHMM

BLAST (NCBI)

ExPASy

mRNA cDNA

EΚΚΙΝΗΤΕΣ

MtINT1 pAVA554

pBSKS+

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

• In silico ανάλυση

• Πλασμιδιακές κατασκευές

• Μετασχηματισμός

ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ MtINT1

Αμινοξική αλληλουχία

TMHMM

Αμινοξική αλληλουχία

IN

SILICO

Διαμεμβρανική περιοχή Φωσφολιπίδια

TOPOLOGY PREDICTION

Αντιστοίχιση με χαρακτηριστικά της MFS Major facilitator superfamily (MFS):

USERSEQ1

(496 aa)

Αντιστοίχιση με χαρακτηριστικά της MFS Major facilitator superfamily (MFS):

Κλίμακα::

Αντιστοίχιση με χαρακτηριστικά της MFS Major facilitator superfamily (MFS):

USERSEQ1

(496 aa)

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ MtINT1I

N

SILICO

Μ.Β.= 53.797,41 Da θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο= 5,23.

ΠΟΛΛΑΠΛΗ ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ MtINT1I

N

SILICO

ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΤΗΣ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ MtINT1

IN

SILICO

1. λ/EcoRI + HindIII

2. MtINT1 control 3. MtINT1

1. λ/EcoRI + HindIII

2. pAVA

3. MtINT1

1. λ/EcoRI + HindIII

2-9. pAVAMtINT1+ HindIII

1. λ/EcoRI + HindIII

2. pBSINT1 + HindIII

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΕΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΣΤΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ pBSKS+ ΚΑΙ pΑVA554

ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΤΟΠΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ

ΓΟΝΙΔΙΟΥ MtINT1

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ IN SILICO ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ MtINT1 :

Ο μεταφορέας MtINT1 εχει 10-12 πιθανές διαμεμβρανικές περιοχές.

Ο γενετικός τόπος του MtINT1 πιθανά κωδικοποιεί για διαμεμβρανικό μεταφορέα σακχάρων που φαίνεται να ανήκει στην υπεροικογένεια MFS.

Ο μεταφορέας MtINT1 παρουσιάζει μεγάλη ομολογία με τους μεταφορείς ινοσιτόλης AtINT1, VvINT1 και AcINT1 και σημαντική ομολογία με τις αμινοξικές αλληλουχίες των μεταφορέων AtINT2 και AtINT3.

Σημαντική συντήρηση της αμινοξικής αλληλουχίας με τους μεταφορείς ινοσιτόλης AtINT1, VvINT1, AcINT1, OsITR1 και με τον πιθανό μεταφορέα ινοσιτόλης MITR3.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟΝ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ:

Η πρωτεΐνη του μεταφορέα MtINT1 φαίνεται πως πιθανά συσσωρεύεται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη.

Αντιστοίχιση με χαρακτηριστικά της MFS Major facilitator superfamily (MFS):

USERSEQ1

(496 aa)

31 - 464: score = 54.998

Αντιστοίχιση με χαρακτηριστικά της MFS Major facilitator superfamily (MFS):

USERSEQ1

(496 aa)

ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ

Μελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν για τον μεταφορέα MtINT1 σε φυσιολογικές συνθήκες και σε συνθήκες αβιοτικής καταπόνησης

Yποκυτταρική έκφραση του γονιδίου MtINT1 σε άλλους φυτικούς ιστούς.

Υποκυτταρική τοπολογία άλλων μεταφορέων μονοσακχαριτών (PLT1, STP1, STP13.1, STP13.2).

Xαρακτηριστικά του φυσιολογικού ρόλου πιθανών μεταφορέων ινοσιτόλης σε άλλα φυτά (Oryza sativa, Selaginella sp., Vitis vinifera, Lycopersicon esculentum).

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ !!!

Ιδιαίτερες ευχαριστίες Ε. Φλεμετάκη, Επ.Καθηγητή

Ε.Δ. Κουρή, Μεταδιδ. ΕρευνήτριαC. Stedel, Μεταδιδ. Ερευνήτρια

Μ. Πατέλου, PhDAequorea victoria