Μοριακή διάγνωση μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR

με RT-PCR και ARMS-PCR

Καρακιουλάκη ΜερόπηΕπόπτρια Καθηγήτρια: Δροσοπούλου Ελένη

Μονάδα Εκτέλεσης: LabNET Εκπαιδευτής Μονάδας: Χατζηδημητρίου Δημήτριος

Θεσσαλονίκη, Ιούλιος 2016

• Τρόπος λειτουργίας

• Τρόπος οργάνωσης

• Υποστήριξη πολλών βιοπαθολογικών εργαστηρίων

• Αναλύσεις σε πάνω από 1000 δείγματα την ημέρα

• σύστημα “slis”

• Προετοιμασία δειγμάτων για αυτόματους αναλυτές

• μοριακές αναλύσεις

Μεταλλάξεις θρομβοφιλίας

Αντιγόνο ιστοσυμβατότητας HLA-B27

Μεταλλάξεις κυστικής ίνωσης

Ιός ηπατίτιδας Β

• Εlisa (17 υδροξυ-προγεστερόνη, κυτταρομεγαλοϊός)

• Ανοσοφθορισμός (αυτοάνοσα)

• γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη, ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης

• πήξη αίματος, γενικές εξετάσεις αίματος

• ταυτοποίηση μικροβίων

• αιματολογικοί έλεγχοι

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Κυστική Ίνωση

• Αυτοσωμική υπολειπόμενη γενετική ασθένεια

• Η πιο συχνή στον Καυκάσιο πληθυσμό

• Ασθενείς 1:2500

• Φορείς 1:25

• Μεταλλάξεις στο γονίδιο CFΤR

Γονίδιο CFTRCystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

Ρυθμιστής Διαμεμβρανικής Διακίνησης Ιόντων

• Μακρύς βραχίονας χρωμοσώματος 7 (περιοχή 7q31-32)

• 230kb

• Κωδικοποιεί CFTR πρωτεΐνη

Πρωτεΐνη CFTR• κανάλι ιόντων χλωρίου

• 2 επαναλαμβανόμενα τμήματα, καθένα:

διαμεμβρανική περιοχή (MSD1, MSD2) 6 διαμεμβρανικά τμήματα

περιοχή δεύσμευσης ATP (NBD1, NBD2) ενέργεια

• Ενώνονται μέσω ρυθμιστικής περιοχής (R) θέσεις φωσφορυλίωσης

ρύθμιση καναλιού

• Kανάλια CFTR έξοδος ιόντων

χλωρίου από επιθηλιακά κύτταρα

προς αεραγωγό

• Μόρια νερού εισέρχονται στον

αεραγωγό λόγω ώσμωσης

• Βλέννη ενυδατωμένη

• Δυσλειτουργία αναστέλλεται έξοδος

ιόντων χλωρίου από επιθηλιακά

κύτταρα προς αεραγωγό

• Μόρια νερού δεν εισέρχονται στον

αεραγωγό

• Βλέννη πηκτή, κολλώδης, δυσκίνητη

• βακτήρια που δεν απομακρύνονται

από το κροσσωτό επιθήλιο

• κύκλοι λοιμώξεων, φλεγμονής και

ιστικής καταστροφής

• Μείωση ποσοστού λειτουργικού

πνευμονικού ιστού

• αναπνευστική ανεπάρκεια

Θεραπεία?

• Δεν υπάρχει αποτελεσματική

θεραπεία σήμερα

• Πρωτόκολλα αντιμετώπισης

συμπτωμάτων αύξηση

μέσου όρου ζωής στα 30-40

χρόνια

2000 διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο CFTR

• Συχνότητα διαφέρει πληθυσμιακά και γεωγραφικά

• Φορείς νόσου φυσιολογικοί

• Ομοζυγώτες ετερογένεια μεγάλος αριθμός μεταλλάξεων

διαφορετικές επιπτώσεις στη λειτουργία της πρωτεΐνης

ΔF508• έλλειμα 3 βάσεων (CTT) απώλεια φαινυλαλανίνης στο κωδικόνιο 508

(περιοχή σύνδεσης με το ATP)

• 70% των περιστατικών κυστικής ίνωσης σε Καυκάσιους

• Παραγωγή CFTR πρωτεΐνης που δεν ωριμάζει φυσιολογικά

• Επικράτηση της μετάλλαξης απόδοση πλεονεκτήματος επιβίωσης:

αντίσταση στο Salmonella typhi

κανάλι CFTR για να εισέλθει στα επιθηλιακά κύτταρα

μετάλλαξη ΔF508 η είσοδός παρεμποδίζεται

2 μέλη ζευγαριού φορείς

• Προγεννητική Διάγνωση λήψη τροφοβλάστης

χοριακών λαχνών

αμνιακού υγρού

•Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση μεταφορά στη μήτρα μόνο υγιών εμβρύων

λήψη και εξέταση ενός κυττάρου από το έμβρυο στο στάδιο των 6-8 κυττάρων

ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

MULTIPLEX PCR

• εξέταση πολλών αλληλουχιών στόχων σε ένα δείγμα

• χρήση πολλών διαφορετικών ζευγαριών εκκινητών σε μία μόνο

αντίδραση

• χρήση πολλαπλών ιχνηλατών με διαφορετικές φθορίζουσες

χρωστικές για τη διάκριση κάθε προϊόντος που θα παραχθεί από

τους διάφορους εκκινητές

PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ

•φθορίζουσες ουσίες

• εκπέμπουν φθορισμό μετράται σε κάθε κύκλο

•ποσοτικοποίηση προϊόντος

• Ένταση φθορισμού αυξάνεται σε

συνάρτηση με την αύξηση των

αντιγράφων

• Threshold σήμα ξεχωρίζει έντονα

από το φόντο

• Threshold cycle (Ct) κύκλος που το

σήμα φτάνει στο σημείο Threshold

• Μεγαλύτερη ποσότητα αρχικού DNA

τόσο νωρίτερα φτάνει την τιμή

Threshold μικρότερη τιμή Ct

Ολιγονουκλεοτίδια-ιχνηλάτες (probes)

• φθορίζουσα χρωστική (fluorophore)

• μόριο-αποσβέστης φθορισμού (quencher)

• Δεν υβριδίζονται φθορίζουσα χρωστική και αποσβέστης παραμένουν

ενωμένοι αποσβέστης απορροφά φθορισμό της χρωστικής

• Υβριδίζονται με αλληλουχία στόχο αποχωρισμός φθορίζουσας

χρωστικής από αποσβέστη φθορισμός

ΓΡΑΜΜΙΚΟΙ ΙΧΝΗΛΑΤΕΣ - TAQMAN PROBES

ΙΧΝΗΛΑΤΕΣ ΜΕ ΔΕΥΤΕΡΟΤΑΓΗ ΔΟΜΗ -MOLECULAR BEACONS

IΧΝΗΛΑΤΕΣ ΤΥΠΟΥ ΣΚΟΡΠΙΟΥ - SCORPION PROBES

IΧΝΗΛΑΤΕΣ ΤΥΠΟΥ FRET - FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ

• Πρωτεϊνάση Κ, διάλυμα λύσης-απορρυπαντικό (λύση κυττάρων)

• Απόλυτη αιθανόλη στήλη φυγοκέντρηση (DNA συδνέεται στο

φίλτρο)

• Πλύσεις DNA στο φίλτρο

• Έκλουση DNA

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ ΔF508 ME TH ΒΟΗΘΕΙΑ ΤΗΣ RT-PCR

• 2 ιχνηλάτες:

Σύνδεση σε αγρίου τύπου γονίδιο CFTR ROX

Σύνδεση σε γονίδιο CFTR με μετάλλαξη ΔF508 VIC

Δείγμα ομόζυγο για το αγρίου τύπου αλληλόμορφο ισχυρό σήμα

φθορισμού από τη χρωστική ROX

Δείγμα ομόζυγο για τη μετάλλαξη ΔF508 ισχυρό σήμα φθορισμού από τη

χρωστική VIC

Δείγμα ετερόζυγο δύο μέσης έντασης σήματα φθορισμού (VIC, ROX)

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ 29 ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΜΕ ΤΗ ΒΟΗΘΕΙΑ ΤΗΣ PCR

Στρατηγική ενίσχυσης ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

• Εκκινητές διάκριση μεταξύ δειγμάτων DNA που μπορεί να

διαφέρουν μεταξύ τους εώς και 1 νουκλεοτίδιο

• Ενισχύουν διαφορετικά αλληλόμορφα που διαφέρουν το ένα από το

άλλο εώς και μία βάση

• Eντοπισμός σημειακών μεταλλάξεων και απωλειών μικρού αριθμού

βάσεων στην αλληλουχία κάποιου γονιδίου

• 4 multiplex PCR αντιδράσεις με διαφορετικά μίγματα εκκινητών• ηλεκτροφορούνται σε πηκτή αγαρόζης • UV

Αποτελεσματικός έλεγχος για όλες τις μεταλλάξεις που έχουν εντοπιστεί

στο γονίδιο CFTR

ανάλυση αλληλουχίας γονιδίου (sequencing)

Μοριακή διάγνωση μεταλλάξεων κυστικής ίνωσης

• μοριακή ανίχνευση των φορέων και ομοζυγωτών απογόνων μείωση της συχνότητας εμφάνισης της νόσου

γένεση υγιών απογόνων από ζευγάρια φορέων (Προεμφυτευτική Γενετική

Διάγνωση)

• πιο ακριβείς και γρήγορες μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλάξεων στους

διάφορους πληθυσμούς

πιο ακριβής και έγκαιρη διάγνωση

αποτελεσματική θεραπεία

σχέση μεταξύ φαινοτύπου και γενοτύπου

Συσχέτιση μεταλλάξεων με συμπτώματαεγκυρότερη διάγνωση της νόσου

έγκαιρη θεραπεία των συμπτωμάτων

Αύξηση προσδοκώμενου ορίου ηλικίας ασθενών

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ!

Σε άλλους ιστούς…

• παχύρρευστες και δυσκίνητες παγκρεατικές εκκρίσεις φράσσουν

παγκρεατικούς αγωγούς

κατακράτηση ενζύμων (λιπάσες, θρυψίνη, χυμοθρυψίνη)

Καταστροφή παρεγχύματος (παγκρεατίτιδα)

ατελή πέψη

παγκρεατική ανεπάρκεια (85% ασθενών)

• Ήπαρ παχύρρευστη βλέννη εμποδίζει έκκριση της χολής

• στειρότητα σε άνδρες (96%) έλλειψη σπερματικού πόρου

• Τεράστιος αριθμός μεταλλάξεων

• Διαφορετική συχνότητα στους διάφορους πληθυσμούς

• συγκεκριμένη ομάδα μεταλλάξεων που θα ελέγχεται παγκοσμίως δεν

υπάρχει

• ευρωπαϊκές κατευθυντήριες οδηγίες έλεγχος για το 75-85% των

μεταλλάξεων του πληθυσμού

• Ελλάδα μεγάλη μοριακή ετερογένεια μοριακός έλεγχος ιδιαίτερα

ακριβός και δύσκολος

Ομάδες υψηλού κινδύνου

1. μέλη οικογενειών με κυστική ίνωση

2. μέλος ζευγαριού, στο οποίο 1 άτομο είναι φορέας

3. άντρες με στειρότητα λόγω έλλειψης του σπερματικού πόρου

4. άτομα με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και χρόνια παγκρεατίτιδα

(παθογένεια δεν έχει διευκρινιστεί)

5. εγκυμοσύνες με υπερηχογένεια εντέρου στο έμβρυο (υπερηχογραφικός

έλεγχος)