1

2

3

4

Πως εξάγουμε Πως εξάγουμε DNADNA από από οτιδήποτε έχει ζωή.οτιδήποτε έχει ζωή.

5

Πρώτα χρειαζόμαστε ζωντανά αντικείμενα (πηγές DNA), που μπορεί να είναι:•Σπανάκι•Συκώτι από κοτόπουλο•Κρεμμύδια•Μπρόκολο

Επίσης χρειαζόμαστε:Μπλέντερ.ΑλάτιEDTA(αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό δινάτριο – υπάρχει στο εργαστήριο)Απορρυπαντικό.Δισανθρακική σόδα.Αλκοόλη ( αιθυλική ή ισοπροπυλική).

Γιαννάκης Παναγιώτης

6

Διαδικασία

Βάλε στο μπλέντερ:

Την πηγή του DNA (π.χ 100ml ή 1/2 του φλιτζανιού ψιλοκομμένο κρεμμύδι, αντιστοιχεί σε ένα μέτριο κρεμμύδι).

Λιγώτερο από 1 ml αλάτι ή 1/8 του κουταλιού.

1/3 της προηγούμενης ποσότητας του αλατιού EDTA.

Νερό δύο φορές απ’ ότι η πηγή του DNA (περίπου 200ml ή 1 φλιτζάνι).Βάζουμε να δουλέψει το μπλέντερ για 15sec. Έτσι τα κύτταρα μ’ αυτή την διαδικασία διαχωρίζονται.

Γιαννάκης Παναγιώτης

7

Ακολουθούν τα παρακάτω τρία στάδια.

1. φιλτράρουμε το ομογενοποιημένο υγρό περνώντας το από χωνί με φίλτρο καφετιέρας σε ογκομετρικό κύλινδρο ή ογκομετρικό ποτήρι ζέσεως. Προσθέτουμε απορρυπαντικό κατά το 1/6 (30ml ή 2 κουταλιές της σούπας) του μίγματος που προέκυψε κατά προτίμηση Woolite και το αναμιγνύουμε. Αφήνουμε το μίγμα για 5-10 λεπτά.

Γιαννάκης Παναγιώτης

8

Τοποθετούμε το μίγμα σε δοκιμαστικούς σωλήνες κατά το 1/3 τους.

2. προσθέτουμε στον καθένα δοκιμαστικό σωλήνα μια πρέζα δισανθρακικής σόδας και αναδεύουμε ήπια.

Γιαννάκης Παναγιώτης

9

3. προσθέτουμε προσεκτικά και αργά την αλκοόλη, έτσι ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα αλκοόλης ίσης ποσότητας με το μίγμα.

Γιαννάκης Παναγιώτης

10

Παρατηρούμε ότι το DNA μαζεύεται στο στρώμα της αλκοόλης.

Γιαννάκης Παναγιώτης

11

Εναλλακτική διαδικασία:

Αν δεν έχουμε EDTA, τοποθετούμε σε υδατόλουτρο 60 ΟC το φιλτραρισμένο ομογενοποιημένο μίγμα κρεμμυδιού – νερού ή αντ’ αυτού αναμειγνύουμε με κάποιο σαμπουάν αντί για απορρυπαντικό το οποίο στις ενδείξεις του αναφέρει ότι περιέχει EDTA.

Αντί για δισανθρακική σόδα μπορούμε να ρίξουμε 2 -3 σταγόνες διαλύματος πεψίνης (1γρ/100ml). Πεψίνη υπάρχει στο εργαστήριο. Επίσης μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε διάλυμα καθαριστικού φακών επαφής ή χυμό από ανανά.

Η αλκοόλη μπορεί να είναι και παγωμένη.

Γιαννάκης Παναγιώτης

12

Γιατί πιθανόν δεν βλέπω DNA;

Έλεγξε προσεκτικά στο στρώμα της αλκοόλης αν υπάρχουν φυσαλίδες στις οποίες είναι προσαρτημένα ινίδια DNA.

Εάν η πηγή του DNA έχει πολύ νερό θα πρέπει στην αρχή να ρίξουμε λιγότερο νερό για να έχουμε επαρκή ποσότητα DNA.

Μια άλλη πιθανή αιτία είναι εάν ανακατώσαμε το ομογενοποιημένο μίγμα με το απορρυπαντικό και δεν το αφήσαμε τουλάχιστον για 5 λεπτά.

Γιαννάκης Παναγιώτης

13

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ

A. Γιατί χρησιμοποιούμε αλάτι;B. Γιατί χρησιμοποιούμε EDTA;C. Γιατί χρησιμοποιούμε το μπλέντερ για 15sec και όχι παραπάνω;D. Γιατί χρησιμοποιούμε απορρυπαντικό;E. Γιατί χρησιμοποιούμε σόδα;F. Ποια η χρήση της αλκοόλης;

1. γιατί αντί για EDTA θερμαίνουμε σε υδατόλουτρο 60οC;2. γιατί αντί για σόδα μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε πεψίνη;3. Γιατί κατά προτίμηση χρησιμοποιούμε παγωμένη αλκοόλη;

Γιαννάκης Παναγιώτης

14

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ.

A. Το αλάτι (NaCl) διατηρεί την διπλή έλικα του DNA προφυλάγοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

Β.To EDTA συνδέεται με το Mg++ που είναι συμπαράγοντας της DNAσης (οι δεοξυριβονουκλεάσες καταλύουν τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς).

C.Χρησιμοποιούμε το μπλέντερ όχι πάνω από 15sec διότι το DNA θα διασπαστεί σε μικρότερα κομμάτια.

Γιαννάκης Παναγιώτης

15

D. Το απορρυπαντικό ανοίγει τα μυκήλια τα οποία περιέχουν DNA.

Γιαννάκης Παναγιώτης

16Γιαννάκης Παναγιώτης

17

Γιαννάκης Παναγιώτης

18Γιαννάκης Παναγιώτης

19

E. . Η σόδα ανεβάζει το pH διότι το DNA είναι σταθερό σε Ph 8. Το Ph του νερού είναι 6 λόγω του διαλυμένου CO2, και λόγω της οξύτητας του σπάει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Επίσης επιδρά στα φορτία των ιστονών κ’ έτσι αποδεσμεύεται το DNA απ’ τις ιστόνες χωρίς βέβαια να μετουσιώνονται.

Γιαννάκης Παναγιώτης

20

G. Στην υδατική φάση λόγω του ότι το νερό είναι διπολική ένωση τα μόρια του DNA είναι διαλυμένα, δεδομένου ότι οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί είναι υδρόφιλοι. Η αλκοόλη αφυδατώνει τα μόρια του DNA. Έτσι συσσωματώνονται και μπορούμε να τα δούμε σαν λεπτά μπερδεμένα ινίδια.

Γιαννάκης Παναγιώτης

21

1. Αντί ΕDTA, θερμαίνουμε σε υδατόλουτρο 60oC διότι απενεργοποιούμε τις δεοξυριβονουκλεάσες που καταλύουν τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

2. H πεψίνη μετουσιώνει τις ιστόνες.

3. η παγωμένη μεθυλική αλκοόλη απλώς επιταχύνει την διαδικασία καθίζησης. Αντ’ αυτής μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε ισοπροπυλική αλκοόλη η οποία επιταχύνει την διαδικασία ακόμα και σε θερμοκρασία δωματίου.

Γιαννάκης Παναγιώτης

22

Βιβλιογραφία:

•εργαστηριακός οδηγός Γ΄ Λυκείου θετικ. Κατευθ.

•utah.edu/units/activities/extraction/enzyme.cfm

•http://www.science-projects.com/onionDNA.htm

•w.woodrow.org/teachers/bi/1993/isolation2.html

•http://www.quarks.de/dyn/8877.phtml

Γιαννάκης Παναγιώτης

23

(ασβεστόνερο με φαινολοφλαλεΐνη)

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

CO2 + Ca(OH)2 CaCO3

(Αποχρωματισμός φαινολοφθαλεΐνης)

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

24

25

26

27Γιαννάκης Παναγιώτης