Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΤΟΥ ΜΥΟΚΑΡΔΙΟΥ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΝΕΚΡΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ (ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ

ΕΠΙΜΥΕΣ)

Μαδέσης Α., Μάνθου Μ., Κουτσογιαννίδης Χ., Ανανιάδου Ο., Εμμανουήλ-Νικολούση Ε., Παπακωσταντίνου Χ.

Καρδιοθωρακοχειρουργική Κλινική Γ.Ν.Θ. «Γ. Παπανικολάου», ΘεσσαλονίκηΕργαστήριο Ιστολογίας – Εμβρυολογίας ΑΧΕΠΑ, ΘεσσαλονίκηΚαρδιοθωρακοχειρουργική Κλινική ΑΧΕΠΑ, Θεσσαλονίκη

ΕΙΣΑΓΩΓΗΗ προστασία του μυοκαρδίου από τις

βλάβες της ισχαιμίας και της οξείας επαναιμάτωσης αποτελεί την απαραίτητη προϋπόθεση για την διενέργεια ασφαλών καρδιοχειρουργικών επεμβάσεων καθώς και άλλων ιατρικών επεμβάσεων, όπως η διαδερμική αγγειοπλαστική στεφανιαίων αγγείων (PTCA).

ΕΙΣΑΓΩΓΗΧρησιμοποιήθηκαν και μελετήθηκαν

διάφορες μέθοδοι και ιδέες για την προστασία του μυοκαρδίου από τις βλάβες της ισχαιμίας και της οξείας επαναιμάτωσης.

Μια από αυτές, η ισχαιμική προετοιμασία του μυοκαρδίου, πριν το ισχαιμικό επεισόδιο (preconditioning) ή μετά το ισχαιμικό επεισόδιο (pοstconditioning), έχει δείξει ότι μπορεί να προστατεύσει το μυοκάρδιο μειώνοντας την νέκρωση και την απόπτωση.

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

Διερεύνηση του ρόλου της ισχαιμικής προετοιμασίας

(preconditioning και postconditioning) του μυοκαρδίου

στην κυτταρική νέκρωση και απόπτωση μετά από ισχαιμία-

επαναιμάτωση

ΙΣΧΑΙΜΙΑ ΤΟΥ ΜΥΟΚΑΡΔΙΟΥ Διαταραχή αιματικής ροής προς

την καρδιά

Στεφανιαία νόσος

Χειρουργική παθήσεων καρδιάς

ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ - ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ

Το μειωμένο ΑΤΡ κατά την ισχαιμία οδηγεί σε αύξηση των ενδοκυτταρικών ιόντων

Η+ και Ca+ κατά την επαναιμάτωση ο σχηματισμός ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS), το μεταβαλλόμενο pH και η αύξηση του ασβεστίου οδηγούν στο σχηματισμό του μιτοχονδριακού πόρου διαπερατότητας (MPP), καταλήγοντας στον κυτταρικό θάνατο.

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ

Νέκρωση – διόγκωση κυτταροπλασματικών οργανιδίων, ρήξη κυτταρικής μεμβράνης, φλεγμονώδης αντίδραση

Απόπτωση (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) συμπύκνωση κυτταροπλάσματος, ενεργοποίηση κασπασών, κατακερματισμός του DNA, φαγοκυττάρωση

ΒCL-2 και p53 Η Bcl-2 αναστέλλει την απόπτωση που επάγεται από την p53 στα

καρδιακά μυοκύτταρα αυξάνει το κατώτατο όριο ασβεστίου για την

διαπερατότητα του μιτοχονδριακού πόρου στα μιτοχόνδρια της καρδιάς

Η p53ενεργοποιεί γονίδια που επάγουν την απόπτωσημπορεί επίσης να επάγει γονίδια τα οποία μπλοκάρουν τα

αντι-αποπτωτικά μονοπάτια

ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΣ (preconditioning - postconditioning)

Σύντομα επεισόδια ισχαιμίας-επαναιμάτωσης πριν (preconditioning) ή μετά (postconditioning) ενός παρατεταμένου ισχαιμικού συμβάματος έχουν δείξει ότι ενεργοποιούν ενδογενή καρδιοπροστατευτικά φαινόμεναpre post

Φυσιολογικές επιδράσεις

Μειώνει το μέγεθος του εμφράγματος του μυοκαρδίου + +

Μειώνει το stunning  + −

Μειώνει την απόπτωση  + +

Μειώνει το οίδημα των ιστών  + +

Μειώνει την αγγειακή βλάβη + +

Eνδοθηλιακή δυσλειτουργία + +

Δυσλειτουργίες αιματικής ροής + +

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΚΑΡΔΙΩΝ

Δυο βασικές μέθοδοι εμποτισμού της καρδιάς

• Πειραματικό μοντέλο Langendorff

• Πειραματικό μοντέλο της « λειτουργικής καρδιάς »

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Πειραματόζωα (♂wistar 250-300gr)

Συσκευή άρδευσης (Langendoff)

Διάλυμα άρδευσης (Krebs-Heinseleit) Αναισθησία και χειρουργική τεχνικήΠρωτόκολλα άρδευσης - Πειραματικές ΟμάδεςΙστολογική εκτίμηση – Σύστημα ταξινόμησηςΣτατιστική επεξεργασία (SPSS12.0)

Συσκευή άρδευσης

Πειραματικές Ομάδες

1. Ομάδα Α (Ν=5) : Καρδιές ελέγχου χωρίς καμία παρέμβαση (φυσιολογικό μυοκάρδιο).

2 .Ομάδα Β (Ν=10): Καρδιές που υποβλήθηκαν σε 20 λεπτά καθολικής ισχαιμίας και 2 ώρες επαναιμάτωσης χωρίς ισχαιμική προετοιμασία.

3. Ομάδα Γ (Ν=10): Καρδιές που υποβλήθηκαν σε 20 λεπτά καθολικής ισχαιμίας και 2 ώρες επαναιμάτωσης με προ-ισχαιμική προετοιμασία (τρείς κύκλους των 5 λεπτών ισχαιμίας και 10 λεπτών επαναιμάτωσης) πριν την 20λεπτη ισχαιμία (preconditioning).

4. Ομάδα Δ (Ν=10): Καρδιές που υποβλήθηκαν σε 20 λεπτά καθολικής ισχαιμίας και 2 ώρες επαναιμάτωσης με μετα-ισχαιμική προετοιμασία (τρείς κύκλους των 2 λεπτών επαναιμάτωσης και 2 λεπτών ισχαιμίας) μετά την 20λεπτη ισχαιμία (postconditioning).

Ιστολογική εκτίμηση

Χρώση Αιματοξυλίνης- Ηωσίνης (νέκρωση) (0-5)

Μέθοδος TUNEL (απόπτωση) (0-4)

Ανοσοϊστοχημική χρώση Bcl2 και P53 (0-4)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παρατίθενται οι ομάδες ιστών που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και

η εκτίμηση, για κάθε ομάδα, της νέκρωσης, της απόπτωσης, της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl 2 και της επαγωγικής πρωτεΐνης p53.

Ομάδα Νο Νέκρωση Απόπτωση Bcl2 P53

Α 5 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ

Β 10 ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ

Γ 10 ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ

Δ 10 ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ

Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης

Ομάδα Α ΧρώσηΑιματοξυλίνης-Ηωσίνης Χ400 Φυσιολογικός μυοκαρδιακός ιστός όπου διακρίνεται

σαφώς η φυσιολογική δομή του ιστού (κύτταρα με τους πυρήνες τους ,αγγεία).

Ομάδα Β Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία-επαναιμάτωση χωρίς

καμία άλλη παρέμβαση. Παρατηρούνται εκτεταμένες βλάβες (νέκρωσης - οιδήματος, απόπτωσης - συμπύκνωση του κυτταροπλάσματος).

Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης Χ710

Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης

Ομάδα Γ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμική προετοιμασία

(preconditioning) και ισχαιμία-επαναιμάτωση. Παρατηρούνται μικρότερης έκτασης βλάβες (λύση της κυτταρικής μεμβράνης, απώλεια του πυρήνα, οίδημα)

Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης Χ400

Ομάδα Δ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία – postconditioning

– επαναιμάτωση. Παρατηρούνται βλάβες μικρής έκτασης (αραιοκυτταρικές περιοχές πυκνωτικοί πυρήνες).

Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης Χ400

Τομές μεθόδου TUNEL

Ομάδα Α Φυσιολογικός μυοκαρδιακός ιστός TUNEL (-). Χρώση Tunel x1600

Ομάδα Β Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία-επαναιμάτωση

χωρίς καμία άλλη παρέμβαση. Παρατηρούνται αραιά έως αρκετά TUNEL(+) κύτταρα.

Χρώση Tunel x710

Ομάδα Γ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμική προετοιμασία

(preconditioning) και ισχαιμία-επαναιμάτωση όπου παρατηρούνται σπάνια έως αραιά TUNEL(+) κύτταρα.

Χρώση Tunel x910

Ομάδα Δ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία- postconditioning-

επαναιμάτωση όπου παρατηρούνται σπάνια έως αραιά TUNEL(+) κύτταρα.

Χρώση Tunel x1600

Τομές μεθόδου TUNEL

Τομές ανοσοϊστοχημικής χρώσης Bcl2

Ομάδα Α Φυσιολογικός μυοκαρδιακός ιστός Bcl 2 (-). Χρώση Bcl 2 x1100

Ομάδα Β Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία-επαναιμάτωση

χώρις καμμία άλλη παρέμβαση. Παρατηρούνται σπάνια Bcl 2 (+) κύτταρα.

Χρώση Tunel x560

Τομές ανοσοϊστοχημικής χρώσης Bcl 2

Ομάδα Γ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμική προετοιμασία

(preconditioning) και ισχαιμία-επαναιμάτωση όπου παρατηρούνται αραιά έως αρκετά Bcl2 (+) κύτταρα.

Χρώση Bcl 2 x560

Ομάδα Δ Ιστός που υποβλήθηκε σε ισχαιμία-

postconditioning- επαναιμάτωση όπου παρατηρούνται αραιά έως αρκετά Bcl 2 (+) κύτταρα.

Χρώση Bcl 2 X560

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ι

p< 0.001p<0.001

p<0.001

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3

Necrosis Apoptosis bcl-2

ΟΜΑΔΑ B

ΟΜΑΔΑ C

Ο μέσος όρος των νεκρωτικών και αποπτωτικών κυττάρων ήταν διπλάσιος στην ομάδα Β (ισχαιμία-επαναιμάτωση) σε σχέση με την ομάδα Γ (preconditioning)

Τα επίπεδα της Bcl 2 πρωτεΐνης είναι πολύ αυξημένα στην ομάδα Γ, ενώ σπάνια στην ομάδα Β

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΙΙ

p<0.001

p<0.001

p<0.001

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3

Necrosis Aposptosis bcl-2

ΟΜΑΔΑ Β

ΟΜΑΔΑ D

Ο μέσος όρος των νεκρωτικών και αποπτωτικών κυττάρων ήταν διπλάσιος στην ομάδα Β (ισχαιμία-επαναιμάτωση) σε σχέση με την ομάδα Δ (postconditioning)

Τα επίπεδα της Bcl2 πρωτεΐνης είναι πολύ αυξημένα στην ομάδα Δ, ενώ σπάνια στην ομάδα Β

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΙΙΙ

p< 0.02

NS

NS

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3

Necrosis Apoptosis bcl-2

ΟΜΑΔΑ C

ΟΜΑΔΑ D

Ο μέσος όρος των νεκρωτικών κυττάρων είναι σχετικά μεγαλύτερος στην ομάδα Δ (postconditioning) συγκριτικά με την ομάδα Γ (preconditioning) (p=0.02) Ο μέσος όρος των αποπτωτικών κυττάρων παρέμεινε σταθερός συγκριτικά μεταξύ των δύο ομάδων.

Μικρή αύξηση των επιπέδων της Bcl-2 πρωτεΐνης ομάδα Γ συγκριτικά με την ομάδα Δ

Συμπεράσματα ΙΗ προ- ή μετα- ισχαιμική προετοιμασία του μυοκαρδίου

preconditioning και postconditioning προστατεύουν το μυοκάρδιο από τη νέκρωση και τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση).

Παράλληλα, αυξάνονται τα επίπεδα έκφρασης της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl2. H αύξηση αυτής της πρωτεΐνης οδηγεί σε αναστολή της απόπτωσης που εκδηλώνεται κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης.

Συμπεράσματα ΙΙΤο preconditioning έχει τον περιορισμό ότι

εφαρμόζεται πριν το ισχαιμικό επεισόδιο και συνεπώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο όταν το γεγονός είναι προβλέψιμο.

Το postconditioning μπορεί να εφαρμοσθεί σε πλήθος ασθενών που υποβάλλονται σε επεμβάσεις καρδιάς με εξωσωματική κυκλοφορία πριν την έναρξη της επαναιμάτωσης, όπως επίσης και στους ασθενείς που υποβάλλονται σε πρωτογενή αγγειοπλαστική.

Ωστόσο η διάρκεια της ισχαιμίας η οποία λειτουργεί προστατευτικά και στις 2 περιπτώσεις δεν είναι πλήρως καθορισμένη γεγονός που καθιστά αναγκαία την περαιτέρω διερεύνηση.

Ευχαριστώ πολύ