Πρωτεΐνες: Δομή & Λειτουργία

Α. Ηλιόπουλος Καθηγητής Βιολογίας

Εργαστήριο Βιολογίας, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ

Πρωτεΐνες: Δομή & Λειτουργία

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Αμινοξέα: Δομικές μονάδες των πρωτεϊνών.

2. Πρωτεϊνοσύνθεση:

• Μετάφραση των mRNA στα ριβοσώματα

• Ρύθμιση της μετάφρασης

3. Πτύχωση και επεξεργασία των πρωτεϊνών:

• Μοριακοί συνοδοί

• Μερική πρωτεόλυση

• Προσθήκες άλλων μορίων (π.χ. σάκχαρα, λιπίδια)

4. Ρύθμιση της λειτουργίας των πρωτεϊνών:

• Φωσφορυλίωση

• Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες

5. Αποδόμηση των πρωτεϊνών:

• Το μονοπάτι ουβικουιτίνης – πρωτεοσώματος

• Αυτοφαγία - λυσοσώματα

4α. Φωσφορυλίωση

Φωσφορυλίωση είναι η ομοιοπολική σύνδεση φωσφορικής ομάδας σε μια πρωτεΐνη.

Για να πραγματοποιηθεί η φωσφορυλίωση χρειάζονται τουλάχιστον 3 στοιχεία: 1) Υπόστρωμα (πρωτεΐνη – όλες οι πρωτεΐνες? Ειδικές θέσεις?) 2) Ένζυμο 3) ΑΤΡ (ενέργεια και φωσφορική ομάδα)

-CH2-C-COO-

H

NH3+

HO-CH2-C-COO-

H

NH3+

NH3+

HO-

ΗΟ-C-C-COO-

H Η3C

H

Tyrosine

(Tyr)

Serine

(Ser)

Threonine

(Thr)

H φωσφορυλίωση πρωτεϊνών λαμβάνει χώρα σε 3 αμινοξέα που φέρουν ελεύθερη –ΟΗ στην πλευρική τους αλυσίδα.

ΑΤΡ (τριφωσφορική αδενοσίνη)

adenine

Δεσμοί υψηλής ενέργειας

Πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες. Οι πρωτεϊνικές κινάσες καταλύουν τη

μεταφορά φωσφορικών ομάδων από το ATP στις πλευρικές αλυσίδες σερίνης και

θρεονίνης (πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/ θρεονίνης) ή τυροσίνης (πρωτεϊνικές κινάσες

τυροσίνης). Οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες καταλύουν την απομάκρυνση των

φωσφορικών ομάδων από τα αμινοξέα αυτά μέσω υδρόλυσης.

Κινάση (σερίνης-θρεονίνης)

Πρωτεΐνη -στόχος

φωσφορυλίωσης

Οι κινάσες αναγνωρίζουν πρωτεϊνικές περιοχές που φέρουν Ser, Thr, Tyr

Οι κινάσες αναγνωρίζουν πρωτεϊνικές περιοχές που φέρουν Ser, Thr, Tyr

Το παράδειγμα της κινάσης ΕRΚ2

Mεταβολές στην λειτουργία πρωτεϊνών με φωσφορυλίωση / απo-φωσφορυλίωση

Διαταραχές στην φωσφορυλίωση

πρωτεϊνών σχετίζονται

νοσήματα στον άνθρωπο

Παράδειγμα 1: χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ).

Mια χρωμοσωμική μετάθεση οδηγεί στην ιδιοσυστατή ενεργοποίηση της κινάσης ABL στη χρόνια μυελογενή Λευχαιμία (ΧΜΛ). Υβριδική πρωτεΐνη BCR-ABL

Ιδιοσυστατή κινάση τυροσίνης

Καθοδική ενεργοποίηση μιτογόνων σημάτων

ΧΜΛ

Mια χρωμοσωμική μετάθεση οδηγεί στην ιδιοσυστατή ενεργοποίηση της κινάσης ABL στη χρόνια μυελογενή Λευχαιμία (ΧΜΛ).

Γνωρίζοντας τη τριτοταγή δομής της πρωτεΐνης BCR-ABL, συντέθηκε η

ένωση ιματινίμπη (με την εμπορική ονομασία Glivec) ως ανταγωνιστής του

ΑΤΡ που εισέρχεται στην αντίστοιχη κοιλότητα της κινάσης. Καθώς το Glivec

δεν έχει φωσφορικές ομάδες, η κινάση δεν μπορεί να φωσφορυλιώσει τα

υποστρώματα της και δεν σηματοδοτείται περαιτέρω ο κυτταρικός

πολλαπλασιασμός.

Διαταραχές στην φωσφορυλίωση πρωτεϊνών προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο: Παράδειγμα 2

Αχονδροπλασία

Οσφυική λόρδωση,

βραχυδακτυλία,

μακροκεφαλία,

προβολή μετώπου

και υποπλασία του

μέσου μετώπου,

καρδιαγγειακά.

Αχονδροπλασία: Μετάλλαξη GlyArg στην θέση 380 (G380R) στην διαμεμβρανική

περιοχή του υποδοχέα FGFR3 οδηγεί στην ιδιοσυστατή δράση του ως κινάση Τυροσίνης.

GlyArg

Περιοχή κινάση

της τυροσίνης

(tyrosine kinase

domain)

Dwarfism at 5 weeks Growth Curve

Wt Dwarf PNAS 96,4455,1999

Η έκφραση του μεταλλαγμένου (G380R) FGFR3 υποδοχέα σε

ποντίκια οδηγεί σε φαινότυπο ανάλογο της αχονδροπλασίας.

Πρωτεΐνες: Δομή & Λειτουργία

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Αμινοξέα: Δομικές μονάδες των πρωτεϊνών.

2. Πρωτεϊνοσύνθεση:

• Μετάφραση των mRNA στα ριβοσώματα

• Ρύθμιση της μετάφρασης

3. Πτύχωση και επεξεργασία των πρωτεϊνών:

• Μοριακοί συνοδοί

• Μερική πρωτεόλυση

• Προσθήκες άλλων μορίων (π.χ. σάκχαρα, λιπίδια)

4. Ρύθμιση της λειτουργίας των πρωτεϊνών:

• Φωσφορυλίωση

• Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες

5. Αποδόμηση των πρωτεϊνών:

• Το μονοπάτι ουβικουιτίνης – πρωτεοσώματος

• Αυτοφαγία - λυσοσώματα

4β. Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες

Η αλληλεπίδραση μιας πρωτεΐνης με άλλο μόριο (ανόργανη ή οργανική ένωση) είναι εκλεκτική. Το μόριο (συνδέτης) πρέπει να ταιριάζει επακριβώς στη θέση σύνδεσης της πρωτεΐνης ώστε να μπορεί να αλληλεπιδράσει με μη-ομοιοπολικούς δεσμούς.

4β. Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες

Παράδειγμα αλληλεπίδρασης περιοχής μιας πρωτεΐνης με ένα μόριο που ονομάζεται κυκλικό ΑΜΡ (ροζ χρώμα).

4β. Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες: το παράδειγμα των G πρωτεϊνών

G πρωτεϊνες: Η δομή και η λειτουργία τους καθορίζεται από την αλληλεπίδρασή τους με ένα μόριο GTP ή GDP

ΑΤΡ vs GTP

guanine adenine

ATP GTP

Mεταβολές στην λειτουργία πρωτεϊνών με ανταλλαγή GDP/GTP

GTP-binding proteins (G-proteins)

Μοντέλο κορδέλας

α-έλικα

παράλληλο β-πτυχωτό φύλλο

αντι-παράλληλο β-πτυχωτό φύλλο

GTP

O παράγοντας επιμήκυνσης της μετάφρασης EF-Tu είναι μια G πρωτεΐνη

Mεταβολές στην λειτουργία πρωτεϊνών μέσω αλληλεπίδρασης με άλλα μόρια

Ο παράγοντας επιμήκυνσης EF-Tu είναι GTP-binding protein (G-protein)

Πρωτεΐνες: Δομή & Λειτουργία

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Αμινοξέα: Δομικές μονάδες των πρωτεϊνών.

2. Πρωτεϊνοσύνθεση:

• Μετάφραση των mRNA στα ριβοσώματα

• Ρύθμιση της μετάφρασης

3. Πτύχωση και επεξεργασία των πρωτεϊνών:

• Μοριακοί συνοδοί

• Μερική πρωτεόλυση

• Προσθήκες άλλων μορίων (π.χ. σάκχαρα, λιπίδια)

4. Ρύθμιση της λειτουργίας των πρωτεϊνών:

• Φωσφορυλίωση

• Αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια και πρωτεΐνες

5. Αποδόμηση των πρωτεϊνών:

• Το μονοπάτι ουβικουιτίνης – πρωτεοσώματος

• Αυτοφαγία - λυσοσώματα

Πρωτεΐνες: Αποδόμηση

Δύο βασικοί μηχανισμοί πρωτεόλυσης (αποδόμησης πρωτεϊνών): • Ουβικουιτίνη-Πρωτεόσωμα • Αυτοφαγία

Ουβικουτίνη (Ubiquitin, Ub)

•76 amino acids (αα)

•Διατηρημένο ανάμεσα σε είδη •Διαφορά 3 αα μεταξύ ζυμομήκυτα και ανθρώπου

Αλληλουχία της ουβικουιτίνης (Ub)

Λυσίνη 48

Γλυκίνη 75/76

Η γλυκίνη (Gly, G) της Ub προσδένεται ομοιοπολικά με Λυσίνη (Lys, K) της πρωτεΐνης-στόχου

Πρωτεΐνη-στόχος

Ub

Αποδόμηση πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικουιτίνης-

πρωτεασώματος

H Ub 2 χρησιμοποιεί τη Gly76 για να συνδεθεί ομοιοπολικά με τη Lys48 της Ub 1.

Κατ’ αντίστοιχο τρόπο συνδέονται και άλλα μόρια Ub για να σχηματίσουν μια αλυσίδα.

Η παρουσία > 4 μορίων Ub μαρκάρει την πρωτεΐνη για αποδόμηση.

Σήμα για Αποδόμηση

1 2 3 4 5

Στάδια:

1. Ομοιοπολική πρόσδεση μορίων ουβικουιτίνης

στην πρωτεΐνη-στόχο με τη συνδρομή

ενζύμων (Ε2, Ε3).

2. Αποδόμηση της πρωτεΐνης από το 26S

πρωτεάσωμα (Η Ub ανακυκλώνεται).

Αποδόμηση πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικουιτίνης-

πρωτεασώματος

1

2

Παράδειγμα Κλινικής σημασίας του μονοπατιού ουβικουιτίνης-

πρωτεασώματος

• Το μονοπάτι ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος είναι υπεύθυνο για την αποδόμηση αρνητικών ρυθμιστών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στο πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ).

• Η βορτεζομίδη (bortezomib), συντέθηκε ως αναστολέας του πρωτεασώματος και εμφανίζει αντι-καρκινική δράση στο ΠΜ και άλλες κακοήθειες.

βορτεζομίδη

Aυτοφαγία

Μελέτη: λυσοσωμικά αθροιστικά νοσήματα, βλ. σημειώσεις, MED 1149

>40 υδρολυτικά

ένζυμα, pH=4.8

Ανατομία του λυσοσώματος

μεμβράνη

Γλυκοζιλιωμένες

πρωτεϊνες

Aυτοφαγία

Σχηματισμός της μεμβράνης του αυτοφαγοσώματος

Εγκόλπωση πρωτεϊνών για αποδόμηση

Πλήρης σχηματισμός του αυτοφαγοσώματος

Σύντηξη με το λυσόσωμα

Αποδόμηση του περιεχομένου των αυτοφαγοσωμάτων

Μέσω ομοιοπολικών και, κυρίως, μη-ομοιοπολικών δεσμών, οι πρωτεΐνες

μπορούν να σχηματίζουν περίπλοκες δομές αλλά και να αλληλεπιδρούν με άλλα μόρια.

Η φωσφορυλίωση και η ανταλλαγή GTP-GDP ρυθμίζουν τη βιολογική δράση πρωτεϊνών και είναι ιδανικοί τρόποι γρήγορης απόκρισης σε εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια ερεθίσματα καθώς ΔΕΝ προϋποθέτουν τη de novo σύνθεση πρωτεϊνών.

Η φωσφορυλίωση πραγματοποιείται σε κατάλοιπα σερίνης, θρεονίνης και τυροσίνης με τη δράση εξειδικευμένων ενζύμων, των κινασών.

Η πολυ-ουβικουιτίνωση οδηγεί σε αποδόμηση πολλών αλλά όχι όλων των πρωτεϊνών-στόχων μέσω του πρωτεασώματος.

Η αυτοφαγία είναι ένας δεύτερος μηχανισμός για την αποδόμηση πρωτεϊνών, ο οποίος βασίζεται στα λυσοσώματα.

Περίληψη

Για μελέτη:

• Αlberts: Κεφ. 4, σελ. 194-215

• Αlberts: Κεφ. 7, σελ. 331-332

• Διαφάνειες στο e-class MED 1149

• Σημειώσεις «Μηχανισμοί Αποδόμησης Ενδοκυττάριων Πρωτεϊνών», στο e-class MED 1149 (εξετάζονται!)