ΜεταγραφικήΜεταγραφική έκφρασηέκφρασητηςτης ανάστροφηςανάστροφης μεταγραφάσηςμεταγραφάσης τηςτης τελομεράσηςτελομεράσης

((hTERThTERT))

καικαι τηςτης 2,32,3--διοξυγονάσηςδιοξυγονάσης τηςτης ινδολεαμινδολεαμiiνηςνης (IDO) (IDO)

στονστον καρκίνοκαρκίνο τουτου πνεύμοναπνεύμονα

171700 ΠανελλήνιοΠανελλήνιο ΣυνέδριοΣυνέδριο ΝοσημάτωνΝοσημάτων ΘώρακοςΘώρακος

Θ Κερενίδη, Μ Ζαμανάκου, Σ Τσόχας, Μ Νάκου, Θ Πουλαράκης, Α Χέβας, J Dahadreh, Κ Γουργουλιάνης, Α Γερμενής, Β Καρανίκας

ΠανεπιστήμιοΠανεπιστήμιο ΘεσσαλίαςΘεσσαλίας

ΤελομερήΤελομερήΔομέςΔομές σταστα άκραάκρα τωντων ευκαρυωτικώνευκαρυωτικών χρωμοσωμάτωνχρωμοσωμάτων πουπου διασφαλίζουνδιασφαλίζουν τητη διατήρησηδιατήρησητηςτης γενετικήςγενετικής σταθερότηταςσταθερότητας

ΕπαναλαμβανόμενεςΕπαναλαμβανόμενες αλληλουχίεςαλληλουχίες DNADNA 55’’--TTAGGGTTAGGG--33’’Τελομερή

επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες

Κυτταρικός θάνατος

Αθανατοποιημένα καρκινικά κύτταρα

ΤελομεράσηΤελομεράση

hTERChTERChTERThTERTTEPTEP11

IDOIDO

ΚυτοσολικήΚυτοσολική μονομερήςμονομερήςαιμοπρωτεΐνηαιμοπρωτεΐνη

430 430 αμινοξέααμινοξέα((ΜΒΜΒ 45,324 KD)45,324 KD)

IDO IDO καικαι καρκίνοςκαρκίνος

ΑνοσοκατασταλτικήΑνοσοκατασταλτική δράσηδράση

MMείωσηείωση τηςτης συγκέντρωσηςσυγκέντρωσηςτηςτης τρυπτοφάνηςτρυπτοφάνης

ΠαραγωγήΠαραγωγή τοξικώντοξικώνμεταβολιτώνμεταβολιτών γιαγια τατα ΤΤκύτταρακύτταρα

(L(L--kynurenine, kynurenine, 33--hydroxyanthranilic acid)hydroxyanthranilic acid)

Munn D, et al. Trends Mol Med 2004, Munn DH, J Clin Invest 2007, Zamanakou et al, Immunol Lett 2007

Επιχώριοςλεμφαδένας

Μεταγραφική έκφραση hTERT και IDO

α. σε κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ

β. σε καρκινικό ιστό και σε παρακείμενο μηπροσβεβλημένο ιστό (συγκριτικά) από ασθενείς μεκαρκίνο του πνεύμονα

Συσχέτιση με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρουςκαι με την επιβίωση των ασθενών

ΣκοπόςΣκοπός

9 9 καρκινικέςκαρκινικές κυτταρικές σειρές ΚΠ:

CALU-1, CALU-6, GILI, ONET, SK-LU-1,

NCI-H441, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H661

28 28 ασθενείςασθενείς

23 23 άνδρεςάνδρες καικαι 55 γυναίκεςγυναίκες ((μέσημέση ηλικίαηλικία 63.463.4 ±± 9.7 9.7 έτηέτη) )

1919 λοβεκτομέςλοβεκτομές, 1 , 1 διλοβεκτομήδιλοβεκτομή καικαι 8 8 πνευμονεκτομέςπνευμονεκτομές

ΠλήρηςΠλήρης εκτομήεκτομή ((complete resectioncomplete resection--RR0) 0)

ΙστόςΙστός αναφοράςαναφοράς: : ΑμάρτωμαΑμάρτωμα

ΥΛΙΚΟ

151556561515272712012052525757353555552626

118811883613615454884242141412122727373723231414131329294284282252251201201501503131

Όγκος(cm(cm33))

KKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK--KKKK------KKKKKKKKKKKK

ΙστόςΑσθενείς

ΝΝoo

Φύλο Ηλικία Τύπος ΔιαφοροποίησηΔιαφοροποίησηpTNMpTNM ppΣτάδιοΣτάδιο

1122334455667788991010111112121313141415151616171718181919202021212222232324242525262627272828

FFMMMMFFFFMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMFFMMFFMMMM

5656656565654848595973735555606065657474484871716161676755557979707063637979595962625959585876764040757574745959

ADADADADADADADADADADADADADADADADADADADADADADADADSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC

SCLCSCLCADAD--BACBACADAD--BACBACADAD--BACBAC

ΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΥψηλήΥψηλήΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλήΜέτριαΜέτριαΜέτριαΜέτριαΧαμηλήΧαμηλή

TT11NN11MM00TT33NN00MM00TT1N2M01N2M0TT1N0M01N0M0TT2N2M02N2M0TT2N0M02N0M0TT4N2M04N2M0TT2N1M02N1M0TT3N0M03N0M0TT2N0M02N0M0TT3N1M03N1M0TT2N2M02N2M0TT2N0M12N0M1TT1N0M01N0M0TT2N1M02N1M0TT2N0M02N0M0TT2N0M02N0M0TT3N1M03N1M0TT2N0M02N0M0TT2N1M02N1M0T2N0M0T2N0M0T1N1M0T1N1M0T2N0M0T2N0M0T2N0M0T2N0M0T3N1M0T3N1M0T2N0M0T2N0M0T2N1M0T2N1M0T4N0M1T4N0M1

IIAIIAIIBIIBIIIAIIIAIAIA

IIIAIIIAIBIB

IIIBIIIBIIBIIBIIBIIBIBIB

IIIAIIIAIIIAIIIAIVIVIAIAIIBIIBIBIBIBIB

IIIAIIIAIBIBIIBIIBIBIBIIAIIAIBIBIBIB

IIIIIAIAIBIBIIBIIBIVIV

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦ--ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦ

ΥΛΙΚΟ

ΣχεδιασμόςΣχεδιασμός--ΜέθοδοιΜέθοδοι

Καρκινικός ιστόςασθενών

Καρκινικές κυτταρικέςσειρές

Παρακείμενοςμη προσβεβλημένος

ιστός

Εκχύλιση RNΑ

Σύνθεση cDNA

PCR για:1) β-actin2) hTERT

QiagenQiagen TaqTaq MastermixMastermix

qRT PCR για:1) IDO2) ABL

Ιστός αναφοράς-αμάρτωμα

RNeasyRNeasy,, QiagenQiagen

OmniscriptOmniscript RT RT kitkit, , QiagenQiagen

SYBR SYBR supermixsupermix kitkit

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΈκφρασηΈκφραση τηςτης hTERThTERT στιςστις καρκινικέςκαρκινικές σειρέςσειρές

ONE T CALU-1 CALU-6 GILI NCIH-596

NCI-460

NCI-661

NCI-441

SK-LU-1

200

400

200

L

hTERT Καρκινικές Σειρές

0

20

40

60

80

100

120

ONET CALU-1 CALU-6 GILI NCIH596 NCIH460 NCIH661 NCIH441 SK-LU-1

Τiμή

R

8/98/9 καρκινικέςκαρκινικές σειρέςσειρές ΚΠΚΠ

ΣχετικήΣχετική έκφρασηέκφραση68.96 68.96 ±± 31.3331.33

ΑνίχνευσηΑνίχνευση τηςτης μεταγραφικήςμεταγραφικήςέκφρασηςέκφρασης τηςτης hTERThTERT

21/24 21/24 δείγματαδείγματα καρκινικούκαρκινικού ιστούιστού (87%) (87%) 71.00 71.00 ±± 68.5068.50

3/27 3/27 δείγματαδείγματα παρακείμενουπαρακείμενου μημηπροσβεβλημένουπροσβεβλημένου ιστούιστού (11%) (11%) 1.00 (1.001.00 (1.00--48.10)48.10)

112.50 ± 73.9612≥50 cm30.001

29.49 ± 24.1212<50 cm3ΟΓΚΟΣΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ

108.00 ± 85.629III-IV0.037

48.79 ± 45.9515I–IIΣΤΑΔΙΟ

31.65± 1.202M1

74.57± 70.5522M0M

99.06 ± 79.9611N1-N20.063

47.25 ± 48.2913N0N

121.30 ± 82.407T3-T40.017

50.26 ± 51.3317T1-T2T

63.46 ± 71.5313G30.569

79.90 ± 67.0111G1-G2ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ

51.58 ± 53.438ΠΛΑΚΩΔΕΣ0.487

70.49 ± 64.5715ΑΔΕΝΟΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΣΤΥΠΟΣ

86.29 ± 73.2413ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ

63.69 ± 75.327ΠΡΩΗΝ

ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ 0.406

34.08 ± 14.454ΜΗ-ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ

ΚΑΠΝΙΣΜΑ

74.16 ± 64.5750.910

70.16 ± 71.1719ΦΥΛΟ

78.87 ± 62.578≥700.699

67.05 ± 72.9216<70ΗΛΙΚΙΑ

p-valuemean ± SDn

Συσχέτιση της έκφρασης της hTERT με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους

T1-2 T3-4

0

50

100

150

200

250p=0.017

Τ-παράγοντας

mR

NA

hTE

RT

p=0.037

I-II III-IV

0

50

100

150

200

250

Στάδιο νόσου

mR

NA

hTE

RT

p= 0.001

<50 >50

0

50

100

150

200

250

Όγκος νεοπλάσματος (cm3)

mR

NA

hTE

RT

ΗΗ έκφρασηέκφραση τουτου mRNAmRNA τηςτης hTERThTERT στονστον παρακείμενοπαρακείμενο μημηπροσβεβλημένοπροσβεβλημένο ιστόιστό, , βρέθηκεβρέθηκε σημαντικάσημαντικά μικρότερημικρότερη απόαπό αυτήαυτήστονστον αυτόλογοαυτόλογο καρκινικόκαρκινικό ιστόιστό, , αλλάαλλά καικαι απόαπό αυτήαυτή στιςστις καρκινικέςκαρκινικέςσειρέςσειρές

ΔενΔεν φάνηκεφάνηκε στατιστικάστατιστικά σημαντικήσημαντική διαφοράδιαφορά τηςτης έκφρασηςέκφρασης τηςτηςμεταξύμεταξύ καρκινικούκαρκινικού ιστούιστού καικαι καρκινικώνκαρκινικών σειρώνσειρών

Φ Κ ΚΣ

50

150

250

p<0.0001 p=0.914

p=0.0008

mR

NA

hTE

RT

ΈκφρασηΈκφραση τηςτης IDOIDO στιςστις καρκινικέςκαρκινικέςσειρέςσειρέςΑνιχνεύτηκεΑνιχνεύτηκε στιςστις 3 3 απόαπό τιςτις 9 9 καρκινικέςκαρκινικές σειρέςσειρές4.68 4.68 ±± 11.08 (0.0011.08 (0.00--33.94)33.94)

1.778

4.840

ΚΚ ΦΦ

ΣύνολοΣύνολοασθενώνασθενών

8.46 8.46 ±± 15.1815.18 3.28 3.28 ±± 2.512.51

ΑΔΕΝΟΑΔΕΝΟ 11.75 11.75 ±± 18.5218.52 3.32 3.32 ±± 2.542.54

ΠΛΑΚΩΔΕΣΠΛΑΚΩΔΕΣ 3.22 3.22 ±± 2.962.96 3.32 3.32 ±± 2.752.75

Μεταγραφική έκφραση της IDOστους ασθενείς

21 / 24 δείγματα καρκινικού ιστού (87.5%)

21 / 25 δείγματα παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού (84%)

Μόνο στο αδενοκαρκίνωμα η σχετική έκφραση της IDO ήταν μεγαλύτερηστον καρκινικό ιστό έναντι του παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού

Δεν βρέθηκε διαφορά μεταξύ των δύο ιστολογικών τύπων στον καρκινικόιστό καθώς και στον παρακείμενο μη προσβεβλημένο ιστό

ΑΔ-Κ ΑΔ-Φ ΠΛ-Κ ΠΛ-Φ

0

5

10

15

20 p=0.046 p=0.945

p=0.075

p=0.998

mRN

A ID

O

12.53 ± 20.6212≥50cm30.340

4.40 ± 4.5312<50cm3ΟΓΚΟΣΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ

4.93 ± 2.989III-IV0.551

10.58 ± 18.9915I–IIΣΤΑΔΙΟ

4.05 ± 3.602M1

8.86 ± 15.8022M0M

5.73 ± 4.5911N1-N20.417

10.77 ± 20.2813N0N

9.82 ± 12.597T3-T40.309

7.90 ± 16.4517T1-T2T

7.24 ± 10.0013G30.772

9.90 ± 20.1411G1-G2ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ

3.22 ± 2.968ΠΛΑΚΩΔΕΣ0.075

11.75 ± 18.5215ΑΔΕΝΟΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΣΤΥΠΟΣ

8.96 ± 18.5313ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ

5.18 ± 5.647ΠΡΩΗΝΚΑΠΝΙΣΤΕΣ

0.590

12.55 ± 16.734ΜΗΚΑΠΝΙΣΤΕΣ

ΚΑΠΝΙΣΜΑ

19.06 ± 29.1050.078

5.67 ± 8.1719ΦΥΛΟ

11.24 ± 23.838≥700.538

7.07 ± 9.0616<70ΗΛΙΚΙΑ

p-valuemean ± SDn

Δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά τηςέκφρασης της IDO σε σχέση με τις κλινικοεργαστηριακές

παραμέτρους

ΗΗ σχετικήσχετική έκφρασηέκφραση τηςτης IDOIDO στιςστις καρκινικέςκαρκινικέςσειρέςσειρές βρέθηκεβρέθηκε μικρότερημικρότερη τόσοτόσο απόαπό αυτήαυτή στονστονπαρακείμενοπαρακείμενο μημη προσβεβλημένοπροσβεβλημένο ιστόιστό όσοόσο καικαιστονστον καρκινικόκαρκινικό ιστόιστό

ΔενΔεν βρέθηκεβρέθηκε διαφοράδιαφορά μεταξύμεταξύ παρακείμενουπαρακείμενου μημηπροσβεβλημένουπροσβεβλημένου ιστούιστού καικαι καρκινικούκαρκινικού ιστούιστού

ΚΣ Φ Κ

0

5

10

15

20 p=0.021 p=0.236

p=0.014

mRN

A ID

O

0 250 500 750 1000 1250

0

20

40

60

80

100

IDO<3.81έτους 100%, 3ετής 87%

Ημέρες μετά το χειρουργείο

p=0.033

IDO>3.81έτους 73%, 3ετής 48%

Επιβίω

ση %

Στατιστικά σημαντική συσχέτισητης έκφρασής της στον καρκινικό ιστό,με τη συνολική επιβίωση των ασθενών

MS=627 μέρες

ΣυνέκφρασηΣυνέκφραση hTERThTERT καικαι IDOIDO

ΣταΣτα 18 18 / / 24 24 δείγματαδείγματα καρκινικούκαρκινικού

ιστούιστού (75%), (75%), εκφράστηκεεκφράστηκε τοτο

mRNAmRNA καικαι τωντων δύοδύο γονιδίωνγονιδίων χωρίςχωρίς

συσχέτισησυσχέτιση μεταξύμεταξύ τουςτους

ΣυμπεράσματαΣυμπεράσματαΑνιχνεύτηκεΑνιχνεύτηκε ηη μεταγραφικήμεταγραφική έκφρασηέκφραση τωντων γονιδίωνγονιδίων τηςτηςhTERThTERT καικαι τηςτης IDOIDO -- γιαγια πρώτηπρώτη φοράφορά μεμε qRTqRT--PCRPCR-- στονστονκαρκίνοκαρκίνο τουτου πνεύμοναπνεύμονα..

ΗΗ υψηλότερηυψηλότερη έκφρασήέκφρασή τηςτης IDOIDO σταστα δείγματαδείγματα τωντων ασθενώνασθενώνπιθανόταταπιθανότατα νανα οφείλεταιοφείλεται στηνστην παραγωγήπαραγωγή τουτου ενζύμουενζύμου καικαιαπόαπό άλλαάλλα κύτταρακύτταρα εκτόςεκτός τωντων καρκινικώνκαρκινικών..

ΔιαφάνηκεΔιαφάνηκε ηη πιθανήπιθανή προγνωστικήπρογνωστική αξίααξία τηςτης σχετικήςσχετικήςέκφρασήςέκφρασής τουςτους..

ΕνώΕνώ ηη πλειοψηφίαπλειοψηφία τωντων καρκινικώνκαρκινικών δειγμάτωνδειγμάτων εκφράζειεκφράζει τηντην hTERThTERT, , έναένα ΤΑΑΤΑΑικανόικανό νανα διεγείρειδιεγείρει ειδικέςειδικές CDCD8+ 8+ κυτταρικέςκυτταρικές απαντήσειςαπαντήσεις, , ηη συνέκφρασησυνέκφραση τηςτηςIDOIDO παρεμποδίζονταςπαρεμποδίζοντας τοντον πολλαπλασιασμόπολλαπλασιασμό τωντων ΤΤ κυττάρωνκυττάρων, , πιθανόνπιθανόνσυμβάλλεισυμβάλλει στηστη διαφυγήδιαφυγή τωντων καρκινικώνκαρκινικών κυττάρωνκυττάρων απόαπό τηντην ανοσοεπιτήρησηανοσοεπιτήρησητουτου ξενιστήξενιστή. . ((στόχοστόχο ανοσοθεραπείαςανοσοθεραπείας))

Συνεργάτες:

ΠνευμονολογικήΠνευμονολογική ΚλινικήΚλινική ΠΓΝΛΠΓΝΛ:: ΘΘ. . ΚερενίδηΚερενίδη, , ΚΚ. . ΓουργουλιάνηςΓουργουλιάνης

ΜονάδαΜονάδα ΑνοσολογίαςΑνοσολογίας ΚαρκίνουΚαρκίνου, , ΕργαστήριοΕργαστήριο ΑνοσολογίαςΑνοσολογίας--

ΙστοσυμβατότηταςΙστοσυμβατότητας ΠΓΝΛΠΓΝΛ:: ΜΜ. . ΖαμανάκουΖαμανάκου, , ΣΣ. . ΤσόχαςΤσόχας, , ΘΘ. . ΠουλαράκηςΠουλαράκης, , ΑΑ. .

ΓερμενήςΓερμενής, , ΒΒ. . ΚαρανίκαςΚαρανίκας

ΕργαστήριοΕργαστήριο ΠαθολογικήςΠαθολογικής ΑνατομικήςΑνατομικής ΠΓΝΛΠΓΝΛ:: ΜΜ. . ΝάκουΝάκου

ΘωρακοχειρουργικήΘωρακοχειρουργική ΚλινικήΚλινική ΠΓΝΛΠΓΝΛ:: ΑΑ. . ΧέβαςΧέβας

ΘωρακοχειρουργικήΘωρακοχειρουργική ΚλινικήΚλινική, , ΙατρικόΙατρικό ΚέντροΚέντρο ΑθηνώνΑθηνών:: J. J. DahadrehDahadreh

Επιδοτήσεις:

Hellenic Ministry of Education, PYTHAGORAS, EPAEK II Project GraHellenic Ministry of Education, PYTHAGORAS, EPAEK II Project Grant nt

EU EU Marie Curie Incoming International Fellowship 021975Marie Curie Incoming International Fellowship 021975--IRTALUNGIRTALUNG

Hellenic Hellenic General Secretariat of R&T General Secretariat of R&T –– ΕΝΤΕΡΕΝΤΕΡ20042004 Grant# Grant# 0404ΕΡΕΡ 99

Hellenic Hellenic General Secretariat of R&T General Secretariat of R&T –– Matching fundsMatching funds

Ευχαριστώ πολύ…