Κυτταρομετρία ροής · 2020. 7. 22. · 488 DLP 500 LP 600 DLP 550 DLP 525 BP FITC...

Κυτταρομετρία ροής

Κατερίνα Ψαρρά

Τμήμα Ανοσολογίας Ιστοσυμβατότητας

ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»

Μέτρηση

• Ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσοτέρωνκυτταρικών συστατικών σε επίπεδο μεμονωμένωνκυττάρων

• Ποσοτική δομική ανάλυση των κυτταρικώνσυστατικών και των αλληλεξαρτήσεών τους

• Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών λειτουργιών

• Ποσοτικοποίηση των κυτταρικώναλληλεπιδράσεων

Κυτταρομετρητής ροής

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗΣ ΡΟΗΣ

Laser

Light

488nm

FL2 PE

SSC

FSC

Fluidics

Electronics

Computer

FL3 PerCP, Cy5

FL1 FITC

Light detectors

Howard M. Shapiro, The Evolution of Cytometers, Cytometry Part A 58A:13–20 (2004)

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html


ομοιογενές ρεύμα υγρού εισέρχεται σε κέντρο ενός άλλου ρεύματος υγρού τα δύο ρεύματα διατηρούν την θέση τους χωρίς να αναμειγνύονται



Ροή κυττάρων κατά μονάς. •ομοιόμορφη.

•εστιασμένη στο κέντρο της

David Novo, James Wood, Flow Cytometry Histograms: Transformations Resolution, and Display, Cytometry Part A 73A: 685692, 2008

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/5Data_Analysis/player.html


http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/1Intro/player.html

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/2Spectra/player.html

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/1Intro/player.html

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/2Spectra/player.html

Ορισμός

Αυτόματη μικροσκοπία φθορισμού και φωτός μεμονωμένων κυττάρων σε ροή

Πολυπαραμετρική ανάλυση: σκέδαση

φθορισμός


Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

απορρίματα

ανιχνευτής

δείγμα


Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Υδραυλικό υδροδυναμική εστίαση

Laser Argon laser (blue),

HeNe laser (red)

Οπτικό θάλαμος ροής, ανιχνευτές,

φίλτρα

Ανίχνευση φωτοπολλαπλασιαστές (PMT)

Συλλογή δεδομένων απόκτηση, ερμηνεία, παρουσίαση

(ηλεκτρονικός υπολογιστής)


Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Γραφική Αναπαράσταση Κυτταρομετρητή Ροής

Θάλαμος ροής

Υδροδυναμική εστίαση

Ταχύτητα

Οπτικό σύστημα

Πρόσθιος σκεδασμός (FSC)

< 10° σκέδαση

μέγεθος

Πλάγιος σκεδασμός (SSC)

90° σκέδαση

~ κοκκίωση

Laser

Y Ένταση φθορισμού

Πυκνότητα αντιγόνου

Οπτικό σύστημα και Κύτταρο

Σκέδαση

Οπτικό Σύστημα

Optical Path XL

Κυτταρομετρητής ροής 3 χρωμάτων

κάτοψη

Κυτταρομετρητής ροής 6 χρωμάτων

SSC

PM

T 1

PMT 2

PM

T 3

PMT 5

PM

T 4

488 DLP 500 LP

600 DLP

550 DLP

525 BP

FITC

575 BP

PE

645 DSP 620 BP

ECD

PC7

675 BP

755 LP

PC5710 DLP

Οπτικό σύστημα

Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Laser

Sample

Sheath

Waste

Detector


Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Απόκτηση

Ερμηνεία

Παρουσίαση αποτελεσμάτων

Acquisition

Analysis

DI/LISPatient report

Data

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Flow cytometry

λεμφοκύτταρα

μονοκύτταρα

κοκκιοκύτταρα

CD45-FITC

CD

14-P

E

Συνδυασμός σκεδαστικών χαρακτηριστικών

• «μορφολογική»

παρουσίαση

υποπληθυσμών

λευκοκυττάρων

• «ανοσολογική»

παρουσίαση

υποπληθυσμών

λευκοκυττάρων

Ανάλυση πλήρους αίματος μετά τη λύση των RBC

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Flow cytometry

Ιστογράμματα κατανομής συχνοτήτων

Ιστογράμματα μιας παραμέτρου

TO

TA

L C

OU

NT

Σχετική ένταση φθορισμού

Negative

Positive

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Flow cytometry

70%30%

60%

40%

1 2

3 4

LFL1

LF

L2 20% 40%

30%10%

+/-

+/+-/+

-/-

Στικτογράμματα – dot plots

Ιστογράμματα δύο παραμέτρωνFocussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Flow cytometry

Παρουσίαση δεδομένων

Plot types

Dot Plot Density

Plot

Contour

Plot

Surface 3D

Plot

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

Flow cytometry

Παρουσίαση δεδομένων

Flow cytometry

Focussing

Sample

Laser

Optics

Detection

Settings

Data

•Μέτρηση υψηλού αριθμού κυττάρων σε σύντομο χρονικό

διάστημα

•Ανίχνευση σπανίων δεδομένων (1: 100000)

•Ταυτόχρονη ανίχνευση δύο μορφομετρικών και τεσσάρων (ή

περισσοτέρων) παραμέτρων φθορισμού ανά κύτταρο ( > 6

παραμέτρους ανά κύτταρο)

• Η ανάλυση μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή επιτρέπει

τυποποίηση των κυτταρικών πληθυσμών

• Ευαισθησία (1:10000 – 1: 100000)

Πλεονεκτήματα κυτταρομετρίας ροής

πλεονεκτήματα

• Μέτρηση μεγάλου αριθμού κυττάρων σε

σύντομο χρονικό διάστημα

• Ανίχνευση «σπάνιων» events (1:100.000)

• Παράλληλη ανίχνευση 2 μορφομετρικών

και 4 ή > παραμέτρων φθορισμού ανά

κύτταρο

• Αυτοματοποιημένη ανάλυση την

τυποποίηση υποπληθυσμών

Ανοσολογία - Αιματολογία

1. Φαινοτυπική ανάλυση

λεμφοκυττάρων – υποπληθυσμών

κακοήθων κυττάρων 1:106-107 WBC

B. Greve et al, Flow Cytometry in Cancer Stem Cell Analysis and Separation, Cytometry Part A 81A: 284293, 2012

2. Διάγνωση

τυποποίηση λευχαιμιών – λεμφωμάτων

παρακολούθηση κληρονομικών – επίκτητων ανοσοανεπαρκειών

(HIV FLOW FISH, καθορισμός τροπισμού CCR5-CD195, CXCR4-

CD184

Chattopadhyay P. et al, Good Cell, Bad Cell: Flow Cytometry Reveals T-cell Subsets Important in HIV Disease,

Cytometry Part A, 77A: 614-622, 2010

αυτοάνοσων νοσημάτων

3. HLA τυποποίηση

Monneret G, et al.: Assessment of monocytic HLA-DR expression in ICU patients: analytical issues for multicentric l ow

cytometry studies. Critical Care 2010, 14:432

4. Διασταύρωση ιστοσυμβατότητας (cross matching)

Gratama, J.W., D.R. Sutherland, and M. Keeney. 2001. Flow Cytometric Enumeration and Immunophenotyping of

Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Seminars in Hematology 38:139-147

5. Έλεγχος αποτελεσματικότητας ανοσοθεραπείας –

χημειοθεραπείας – υπολειπόμενης νόσου MRD

Walter R. et al, Impact of Pretransplantation Minimal Residual Disease, As Detected by Multiparametric Flow

Cytometry, on Outcome of Myeloablative Hematopoietic Cell Transplantation for Acute Myeloid Leukemia, JOURNAL

OF CLINICAL ONCOLOGY, VOLUME 29, NUMBER 9, 2011

Υποτροπή 60-80% μετά χημειοθεραπεία

20-50% μετά μεταμόσχευση μυελού (αποτυχία)

6. Καθορισμός λευκοκυτταρικού τύπου

Cherian S. et al, Evaluation of an 8-Color Flow Cytometric Reference Method for White Blood Cell Differential

Enumeration, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:319–328 (2010)

7. Ανάλυση ΔΕΚ

8. ΑΑΑΑ, αυτόματες αποβολές αγνώστου αιτιολογίας – ΝΚTang A.W. et al, ΝΚ Natural killer cells and pregnancy outcomes in women with recurrent miscarriage and infertility: a

systematic review, Hum. Reprod. (2011) 26(8): 1971-1980

Ογκολογία

1. Ανάλυση πλοειδίας DNADunn JM. Et al, Image cytometry accurately detects DNA ploidy abnormalities and predicts late relapse to high-grade

dysplasia and denocarcinoma in Barrett’s oesophagus following photodynamic therapy, British Journal of Cancer (2010)

102, 1608 – 1617

Καθορισμός περιεκτικότητας ενός κυτταρικού

πληθυσμού σε DNA, RNA

2. Ανάλυση κυτταρικού κύκλου (% κυττάρων σε κάθε

φάση, BrdU)

Staszkiewicz J. et al, Flow cytometric and immunohistochemical detection of in vivo BrdU-labeled cells in

mouse fat depots, Biochem Biophys Res Commun. 2009 January 16; 378(3): 539–544

3. Ανάλυση ογκογονιδίων

Streicher K.L. et al, A novel oncogenic role for the miRNA-506-514 cluster in initiating melanocyte

transformation and promoting melanoma growth Oncogene 31, 1558-1570 (22 March 2012)

4. Απόπτωση Μέθοδος ανεξινης V

Wlodkowic D. et al, Flow Cytometry-Based Apoptosis Detection, Methods in Molecular Biology, 2009, Volume

559, Part 1, 19-32

5. HPV ανάλυση, πρόβλεψη καρκινογένεσης

Coquillard G. et al, Quantification of intracellular HPV E6/E7 mRNA expression increases the specificity and

positive predictive value of cervical cancer screening compared to HPV DNA, Gynecologic Oncology Volume 120,

Issue 1, January 2011, Pages 89–93

Μικροβιολογία

1. Ταυτοποίηση βακτηριδίων με χρήση χρώσεων DNA,

ενζυμικής δραστικότητας ή παραμέτρων σκέδασης

φωτός

Howard M. Shapiro, Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria: Implications for Diagnostics and

Therapeutics, Cytometry 43:223–226 (2001)

2. Προσδιορισμός και αρίθμηση μικροοργανισμών και

ενδοκυτταρικών παρασίτων

• Μέτρηση βακτηριακών κυττάρων που εμφανίζουν αδυναμία ανάπτυξης σε στερεά

θρεπτικά υλικά (ιδιαίτερα σημαντικό για περιβαλλοντικά δείγματα μικροοργανισμών)

• Βιομηχανία τροφίμων/φαρμακευτική βιομηχανία

• Περιβαλλοντικές μελέτες (έλεγχος υδάτων, εδάφους)

Άλλες εφαρμογές

1. Ενδοκυτταρικές κυτταροκίνες

Ιωδιούχο προπίδιο, 7ΑΑD 7αμινοακτινομυκινη

Ghanekar SA, Maecker HT. Cytokine flow cytometry:multiparametric approach to

immune function analysis.Cytotherapy 2003; 5: 1-6

2. Φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες (ταυτοποίηση νέων

μοριακών στόχων)

Kern F et al, 2005, TRENDS in Immunology, 26 (9): 477-484.

3. Κυτταροκαλλιέργειες

Oancea R. et al, MORPHOCYTOLOGICAL ASSAY REGARDING BEHAVIOUR OF DENTAL

PULP STEM CELLS IN GLUCOSE ENRICHED MEDIUM, Medicine in evolution, Nr. 4/2008

4. Φυτικά κύτταρα

• Ανευπλοειδίες/Πολυπλοειδίες:

Nedosekin D.A. et al, In Vivo Plant Flow Cytometry: A First Proof-of-Concept, Cytometry Part A-

79A: 855-865, 2011

σχετίζονται με εμφάνιση υπογόνιμων/στείρων απογόνων και μειωμένη

φυτική παραγωγή → αξιολόγηση φυτικών ποικιλιών/υβριδίων και μαζικό ποιοτικό

έλεγχο φυτικών εμβρύων/σπόρων

Εξωσώματα (Exosomes):

MPs ενδοκυτταρικής προέλευσης εκκρίνονται κατόπιν σύντηξης με την κυτταρική

μεμβράνη. Διάμετρος 50-100nm, περιέχουν λιπίδια, RNA, miRNA (όχι DNA).

Εκκρίνονται από επιθηλιακά κύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, Β και Τ λεμφοκύτταρα,

αιμοπετάλια. Ανιχνεύονται σε πλάσμα, ούρα, μητρικό γάλα, σίελο.

Μικροκυστίδια/Αποπτωτικά κυστίδια:

MPs από την επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης ενεργοποιημένων/αποπτωτικών

κυττάρων, διαμέτρου >100nm.

Εμπλοκή στην πήξη, φλεγμονή, κυτταρική ομοιόσταση και επιβίωση, επικοινωνία

μεταξύ κυττάρων → αυξανόμενο ερευνητικό και κλινικό ενδιαφέρον.

6. Ιστοί ληφθέντες από χειρουργικές εξαιρέσεις-FNA

• ΙΣΤΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ

• ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΜΕΝΟΙ ΙΣΤΟΙ

Ταχεία απόψυξη του δείγματος (χρήση υδατολουτρου 37oC)

• ΙΣΤΟΙ ΕΓΚΛΕΙΣΜΕΝΟΙ ΣΕ ΠΑΡΑΦΙΝΗαπομάκρυνση με θέρμανση της παραφίνης και η εμπότιση του με διαλύματα αλκοόλης αντίστροφης πορείας

σε σχέση με τον εγκλεισμό, και τελικά η ενυδάτωση του

S. Barrena et al, Flow cytometry immunophenotyping of fine-needle aspiration

specimens: utility in the diagnosis and classification of non-Hodgkin lymphomas, Histopathology 2011, 58,

906–918

Dunphy C. H., Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to

Diagnostic Hematopathology , Arch Pathol Lab Med—Vol 128, September 2004

Εφαρμογές της Κυτταρομετρίας ΡοήςΤυποποίηση Λευχαιμιών /Λεμφωμάτων

Μελέτη της πλοειδίας και των φάσεων του κυτταρικού κύκλου των Αιματολογικών κακοηθειών

Παρακολούθηση ΜεταμοσχεύσεωνΠαρακολούθηση θεραπειών

Αυτοάνοσα ΝοσήματαHLA-τυποποίησηΔιάγνωση PNH

Ποσοτικοποίηση των Αρχέγονων Αιμοποιητικών κυττάρωνΘετική διαλογή προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων

Μέτρηση των ΔΕΚΠαρακολούθηση της Σήψης

Οξειδωτική έκρηξη - ΦαγοκυττάρωσηΜελέτη του ανοσοφαινότυπου της Λευχαιμικής

Υπολειμματικής ΝόσουΒασικός έλεγχος των HIV+ ατόμων

Ανοσολογικές ΑνεπάρκειεςΜελέτη της ενεργοποίησης των Αιμοπεταλίων

DNA-ΑνάλυσηΜελέτη της αντοχής στα χημειοθεραπευτικά

Μελέτη της Απόπτωσης

Αιματολογία ΑνοσολογίαΛοιμωξιολογίαΟγκολογίαΟυρολογίαΜαιευτική και ΓυναικολογίαΣτον τομέα των ΜεταμοσχεύσεωνΠαιδιατρική Παθολογοανατομία Κυτταρολογία Πνευμονολογία ΝευρολογίαΟφθαλμολογία

Ηλεκτρονικά

ανιχνευτές

lasers

1990 1995 2000 2005

2010

Τεχνικές

ανάλυσης

δεδομένων

Πολυπαραμετρική ανάλυση

Αντιδραστήρια

Φθορίζουσες ουσίες

Πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής:

μια χρωματική έκρηξη

• Ηλεκτρομηχανολογικός εξοπλισμός – Hardware

• Αντιδραστήρια

• Ανάλυση δεδομένων

• Απεικόνιση δεδομένων

• «Χειροκίνητη» ανάλυση

• Αυτοματοποιημένη ανάλυση

• Εφαρμογές - συμπεράσματα

ΑΚΤΙΝΕΣ LASER

• Μια πηγή (488 nm)

• Δύο πηγές (488 nm + 635 nm)

• Τρεις πηγές

Αργού (Ar)

Κρυπτού (Κr)

Ηλίου - Νέου (He-Ne)

Ηλίου - Καδμίου (He-Cd)

Πράσινα lasers (532nm) ευκρίνεια

ευαισθησία

Οργανικές

Δίδυμες (tandem)

Quantum dots

(νανοτεχνολογία)

Ευρύτερα φάσματα διέγερσης

Στενότερα φάσματα εκπομπής

COMPENSATION

χρωματική αντιστάθμιση

Πριν ή εκ των υστέρων;

Ηλεκτρονική επεξεργασία δεδομένων - απεικόνιση

Η χρήση της logicle κλίμακας

Ανάλυση αποτελεσμάτων

• 4 χρώματα 16 υποπληθυσμοί

• 8 256

• 18 266144

«Αρκετά ταλαιπωρήθηκα να φθάσω ως

εδώ…»

Ο δεκάλογος του «μοντέρνου» κυτταρομέτρη

• Διάλεξε τον κατάλληλο συνδυασμό αντιδραστηρίων (όσο το δυνατόν περισσότερα μονοκλωνικά στο ίδιο σωληνάριο)

• Χρησιμοποίησε τα σωστά δείγματα ελέγχου της χρωματικής αντιστάθμισης

• Χρησιμοποίησε χρώσεις για τη διάκριση ζωντανών/ νεκρών

• Χρησιμοποίησε αυτοματοποιημένα εργαλεία σχεδιασμού πρωτοκόλλων

• Ρύθμισε σωστά το όργανο• Σύλλεξε δεδομένα χωρίς αντιστάθμιση• Αποθήκευσε και αρχειοθέτησε με ασφάλεια τα δεδομένα• Χρησιμοποίησε διαδοχικές οριοθετήσεις • Προχώρησε στην ανάλυση χρησιμοποιώντας (ή όχι) τα

νέα λογισμικά

«Χειροκίνητη» Ανάλυση

• Τιμή cut-off

• Διαδοχικές οριοθετήσεις

• Κόπος

• Τεχνητοί πληθυσμοί (artefacts)

• Προκατάληψη (bias)

Αυτοματοποιημένη ανάλυση

• Clustering

• Συστοιχίες

Αλλά

• Απαιτείται περιορισμός πηγών ποικιλότητας

Έλεγχος ποιότητας :

όλα τα σωληνάρια όμοια

CD45 / SS

Αυτόματος αλγόριθμος για την ταυτοποίηση διαφορετικών υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων

Αναλυτικά βήματα για την ταυτοποίηση κυτταρικών

υποπληθυσμών του BM με βάση τα CD13, CD33,

CD34, CD45

Συγχωνευμένα αρχεία

Microspheres and flow cytometry

Multiplex assay of 11 soluble receptors as sepsis biomarkers

Endocytic pathways and flow cytometry e.g cytokines, phosphokinases

Image analyzers

Κυτταρομετρία μάζας – συνδυασμός κυτταρομετρίας και φασματοσκοπίας μάζας

Bendall et al 2012

Σύγκριση κλασσικής κυτταρομετρίας ροής και κυτταρομετρίας μάζας

Bendall et al 2012

Bendall et al 2012

Πολυπλοκότητα ανάλυσης μεμονωμένων κυττάρων σε πολλαπλές διαστάσεις

Το χάος των CD

Human Leukocyte Differentiation Antigens – HLDA

Human Cell Differentiation Molecules - HCDM

workshops CDs Αριθμός CDs

I Paris 1982 CD1-CDw15 15

II Boston 1984 CD16-CDw26 11

III Oxford 1987 CD27-CD45 19

IV Vienna 1989 CD46-CDw78 33

V Boston 1993 CD79-CDw109 31

VI Kobe 1996 CD110-CD166 55

VII Harrogate 2000

CD167-CD247 81

VIII Adelaide 2004 CD248-CD339 93

CD cluster of differentiation (στατιστική επεξεργασία cluster analysis)

• Αντίσωμα χαρακτηρισμένο από τουλάχιστον ένα Workshop και από καλά μοριακά δεδομένα.

• Το αντιγόνο εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων και συμμετέχει σε ανοσιακές αντιδράσεις.

• Τα αντισώματα αντιδρούν με πρωτογενή κύτταρα όχι με ανασυνδυασμένες ή τεχνητές πρωτεΐνες.

• Το αντίσωμα είναι διαθέσιμο.

• Μέχρι Μάρτιο 2010 CD350• Συνήθως θεματικά – αποτελέσματα για

συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές• Αφορούν αντιγόνα επιφανείας – όχι

κυτταροπλασματικά – όχι πυρηνικά• Ορφανά μονοκλωνικά π.χ. FMC7• Μπορεί να φθάσουν τα 2400 – 5000• Τελευταίο workshop Βαρκελώνη Μάρτιος

2010

Γνωρίστε τα και χρησιμοποιείστε τα

• Το CD200 στη Β-CLL

• Το CD305 στη HCL

• To CD99 στην Τ-ALL

• Το CD135 στην AML

• To CD303 στα δενδριτικά

• Το CD127 στα Τregs

To μέλλον

• Διεύρυνση του στόχου

• Πιστοποίηση αντιδραστηρίων αντισωμάτων

• Workshops ετήσια, εστιασμένα σε ένα είδος κυττάρου

• Τεχνικές μοριακής βιολογίας αλλά

κύρια τεχνικές αντισωμάτων

Η κατάρα του CD ή η σοφία του κυττάρου ;

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ

www.kyttarometria.gr

www.escca.eu

European Society of Clinical cell analysis

Κυτταρομετρία ροής · 2020. 7. 22. · 488 DLP 500 LP 600 DLP 550 DLP 525 BP FITC...

Documents

Transcript of Κυτταρομετρία ροής · 2020. 7. 22. · 488 DLP 500 LP 600 DLP 550 DLP 525 BP FITC...