Δομή και λειτουργία των πρωτεινών

Κεφάλαιο 3 L.StryerΚεφάλαια 3.4, 3.5, 3.7, 6.6 T.M. Devlin

Σελίδες 68, 74, 76 J. Koolman

Η Μορφή των πρωτεινών

• Η μορφή (τρισδιάστατη δομή - σχήμα) μιας πρωτείνης καθορίζεται από το είδος και την αλληλουχία των αμινοξέων που την αποτελούν

• Η μορφή μιας πρωτείνης καθορίζει την λειτουργία της

Αιμοσφαιρίνη αντίσωμα ένζυμα DNA πολυμεράση

Οι πρωτείνες αντιπροσωπεύουν τη μετάβαση από τον μονοδιάστατο κόσμο των αλληλουχιώνστον τριδιάστατο κόσμο των μορίων που παρουσιάζουν μεγάλο εύρος λειτουργιών

4 Δομικά επίπεδα καθορίζουν οποιαδήποτε μορφή

Η δομή των πρωτεινών

Οι πρωτείνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους και με άλλα βιολογικά μακρομόρια για να δημιουργήσουν πολύπλοκες μακρομοριακές μηχανές

Παράδειγμα: Οργάνωση και δομή του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου

Λιπίδια

Αλληλεπιδράσεις πρωτεινών

Μερικές πρωτείνες είναι σχεδόν άκαμπτες ενώ άλλες εμφανίζουν σχετική ευκαμψία. Οι δομικές πρωτείνες είναι σχετικά άκαμπτες

Μικροσωληνίσκοι

Δυναμική συμπεριφορά των πρωτεινών

Διαμόρφωση εξοκινάσης με ελεύθερη γλυκόζη

Διαμόρφωση εξοκινάσης με συνδεδεμένη γλυκόζη

Το υπόστρωμα μπορεί να επάγει αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση της πρωτείνης

Figure 3.19 Amino Acid Sequences Have DirectionThis illustration of the pentapeptide Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (YGGFL) shows the sequence from the amino terminus to the carboxyl terminus. This pentapeptide, Leu-enkephalin, is an opioid

peptide that modulates the perception of pain. The reverse pentapeptide, Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr (LFGGY), is a different molecule and shows no such effects.

Πρωτοταγής ΔομήΤα αμινοξέα συνδέονται με πεπτιδικούς δεμούς για να σχηματίσουν πολυπεπτιδικές αλυσίδες

Η πεπτιδική αλυσίδα έχει πολικότητα: η αλληλουχία των αμινοξέων διαβάζεται προς μια μόνο κατεύθυνση

Figure 3.21 ΔιασυνδέσειςThe formation of a disulfide bond from two cysteine residues is an oxidation reaction.

Ινσουλίνη:Η πρωτείνη στην οποία επιτεύχθηκε για πρώτη φορά αλληλούχιση των αμινοξέων από τον F. Sanger το 1953

Οι πρωτείνες έχουν μοναδικές αλληλουχίες που καθορίζονται από γονίδια

Προ-ινσουλίνη

Δρεπανοκυτταρική αναιμία

Δρεπανοκυτταρική αναιμία

+ _

Ετερόζυγος(Δρεπανοκ. στίγμα)

Ομόζυγος

Δρεπανοκυτταρική αναιμία: Ανίχνευση της μη φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης HbS με ηλεκτροφόρηση

Σημειακή μετάλλαξη A T

Η αλλαγή GAG-σε-GTG εξαφανίζει το σημείο δράσης του περιοριστικού Ενζύμου MstII, το οποίο κόβει τηναλληλουχία CCTNAGG

Ανίχνευση του γονιδίου της Δρεπανοκυτταρικής αναιμίαςμε Southern blotting

Δρεπανοκυτταρική αναιμία:Ανίχνευση του μη φυσιολογικού γονιδίου της αιμοσφαιρίνης HbS με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA

Επώαση του περιοριστικού ενζύμου MstII με DNA τηςHbAτο κόβει και δίνει 2 τμήματα, ενώ επώαση με DNA της HbS δεν το κόβει και δίνει 1 τμήμα

Figure 3.23 Peptide Bonds Are PlanarIn a pair of linked amino acids, six atoms (Cα, C, O, N, H, and

Cα) lie in a plane. Side chains are shown as green balls.Figure 3.24 Typical Bond Lengths Within a Peptide Unit

The peptide unit is shown in the trans configuration.

Figure 3.25 Trans and Cis Peptide BondsThe trans form is strongly favored because of

steric clashes that occur in the cis form.

Figure 3.27 Rotation About Bonds in a PolypeptideThe structure of each amino acid in a polypeptide can be adjusted by rotation about two single bonds. (A) Phi (φ) is the angle of rotation about the bond between the nitrogen and the α-carbon atoms, whereas psi (ψ) is the angle of rotation about the bond between the α-carbon and the carbonyl carbon atoms. (B) A view down the bond between the nitrogen and the α-carbon atoms, showing how φ is measured. (C) A view down the bond between the α-carbon and the carbonyl carbon atoms, showing how ψ is measured.

Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες είναι εύκαμπτες αλλά έχουν και καθορισμένη στερεοδιάταξη

Figure 3.28 A Ramachandran Diagram Showing the Values of φ and ψNot all φ and ψ values are possible without collisions between atoms. The most favorable regions are shown in dark green; borderline regions are shown in light green. The structure on the right is disfavored because of steric clashes.

Δευτεροταγής Δομή

Χωροταξική τοποθέτηση των αμινοξέων που γειτονεύουν στην πρωτοταγή δομή.Ορισμένες από τις τοποθετήσεις αυτές περιλαμβάνουν περιοδικές επαναλήψεις επιμέρους δομών με καθορισμένη στερεοδιάταξη (δευτεροταγείς δομές), όπως η α-έλικα και η β-πτύχωση.

Η διαμόρφωση 1 πολυπεπτιδικού σκελετού μπορεί να περιγραφεί από τις γωνίες περιστροφής των ομοιοπολικών δεσμών που συνεισφέρουν στον σχηματισμό της αλυσίδας

Παράμετροι πολυπεπτιδικών αλυσίδων σε κανονικές δευτεροταγείς δομές

Η κανονική δευτεροταγής δομή συμβαίνει κατά τμήματα μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας στην οποία όλες οι γωνίες των φ- και ψ-δεσμών είναι ίσες

Figure 3.31 Ramachandran Diagram for HelicesBoth right- and left-handed helices lie in regions of allowed

conformations in the Ramachandran diagram. However, essentially all α helices in proteins are right-handed.

Figure 3.35 Ramachandran Diagram For β StrandsThe red area shows the sterically allowed conformations

of extended, β-strand-like structures.

0.35

Απόσταση μεταξύ 2 αμινοξέων

β-επιφάνεια

Δυο πεπτιδικές αλυσίδες (με β-πτύχωση) σε διαμόρφωση β-επιπέδου (β-επιφανείας)

2 πεπτιδικά τμήματα με β-πτύχωση

Η σύνδεση των β-πτυχώσεων με δεσμούς -Η δημιουργεί μια β-επιφάνεια

Οι πλευρικές αλυσίδες (R) είναι κατ’ εναλλαγήν πάνω και κάτω από το επίπεδο της β-πτύχωσης

Στην αντιπαράλληλη β-επιφάνεια οι δεσμοί -Η μεταξύ των ομάδων –ΝΗ και –CO συνδέουν το κάθε αμινοξύ με ένα και μόνο αμινοξύ στη γειτονική β-πτύχωση σταθεροποιώντας τη δομή

Στην παράλληλη β-επιφάνεια οι δεσμοί –Η συνδέουν κάθε αμινοξύ της μιας πτύχωσης με 2 διαφορετικά αμινοξέα της γειτονικής πτύχωσης.

Παράδειγμα αντιπαράλληλου β-επιπέδου

1621

2833

9398

C-άκρο

Ν-άκρο

Cu, Zn υπεροξειδική δισμουτάση

β στροφές: Απαντώνται συχνά σε θέσεις, ανάμεσα σε μεμονωμένους κλώνους αντιπαράλληλων β-δομών ή β-δομών και α-έλικας, όπου η πολυπεπτιδική αλυσίδα αλλάζει απότομα κατεύθυνση. Στα τμήματα αυτά 4 κατάλοιπα είναι διατεταγμένα με τέτοιο τρόπο ώστε η πορεία της αλυσίδας να στρέφεται κατά 180ο περίπου στην αντίθετη κατεύθυνση.

Δεσμοί Η ανάμεσα στα κατάλοιπα 1 και 4

Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες μπορούν να αλλάξουν κατεύθυνση μέσω β-στροφών και θηλιών

Θηλιές στην επιφάνεια τμήματος του μορίου ενός αντισώματος

Οι θηλιές είναι τμήματα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας που δεν έχουν κανονικές περιοδικές δομές, χρησιμεύουν στην αναστροφή της αλυσίδας και βρίσκονται κυρίως στην επιφάνεια των πρωτεινών

Τριτοταγείς Δομές

Τριτοταγής δομή:Είναι η διαδρομή που ακολουθεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα μιας πρωτείνης στον χώρο. Είναι η τρισδιάστατη στερεοδιάταξη μιας πρωτείνης που απαρτίζεται από στοιχεία δευτεροταγούς δομής και περιοχές με ακανόνιστη διάταξη. Αναπαριστά τη θέση κάθε ατόμου στο χώρο.

Αλληλεπιδράσεις που σταθεροποιούν τη στερεοδιάταξη: Η φυσική στερεοδιάταξη των πρωτεινών σταθεροποιείται από μια σειρά διαφορετικών αλληλεπιδράσεων.

Σχηματισμός συμπλέγματος με μεταλλικά ιόντα

Δισουλφιδικοί δεσμοί

Δεσμοί Υδρογόνου

Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

Πολικές αλληλεπιδράσεις

Πρωτείνες που αποτελούνται αποκλειστικά από α-ελικοειδείς περιοχές (πτύχωση σφαιρίνης) όπως η μυοσφαιρίνη. Οι α-δομές έχουν 7 ή 8 τομείς α-έλικας συνδεδεμένους με μικρότερα τμήματα που επιτρέπουν στις έλικες να πτυχώνονται μεταξύ τους ώστε να σχηματίζουν τη χαρακτηριστική σφαιρική δομή.

αίμη

Μικρή περιοχή β-επιφάνειας που αποτελείται από 2 β-κλώνους(β-πτυχώσεις) συμβάλλει στη σύνδεση της οιστραδιόλης.

Δομικά πρότυπα αναδίπλωσης

Εναλλαγή τμημάτων α-έλικας και β-κλώνων. Πέντε παράλληλοι β-κλώνοι σχηματίζουν τον πυρήνα της φλαβοδοξίνης.

Στερεοδιάταξη της β-υπομονάδας της G-πρωτείνης μεταγωγίνης.Επτά δομές β-επιφάνειας σχηματίζουν μια μεγάλη συμμετρική «β-προπέλα». Το Ν-άκρο περιέχει 1 επιμήκη και 1 βραχεία έλικα.

Παράδειγμα αναδίπλωσης α,β-περιοχής

Συνήθης υπερπτύχωση (πτύχωση παρόμοιας δομής από πρωτείνες μη σχετιζόμενες ως προς τη λειτουργία, την αλληλουχία ή την εξέλιξη) όπου οι β-κλώνοι σχηματίζουν έναν β-κύλινδρο στο κέντρο της περιοχής με τμήματα α-έλικας να βρίσκονται εξωτερικά της περιοχής.Περιοχές α-έλικας εναλλάσσονται με β-κλώνους εντός της διαμόρφωσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας.

Παράδειγμα υπερπτύχωσης καθολικά β-περιοχής

Αντιπαράλληλοι β-κλώνοι

β-κύλινδρος «ελληνικό κλειδί» β-κύλινδρος «ζελατινώδης»

Αλλαγή στη τριτοταγή δομή μιας πρωτείνης μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στις φυσικοχημικές της ιδότητες με αποτέλεσμα την πρόκληση παθολογικών καταστάσεων: π.χ. Σπογγώδης Εγγεφαλοπάθεια

Μετατροπή της φυσιολογικής PrPC σε τοξική PrPSc: Στόχευση της PrPC θα μπορούσε να ακυρώσει την νευροτοξικότητα της prion

(a) PrPC (blue partial circles)undergoes conformational change,converting into PrPSc (orange partial pentagons). PrPSc is proteaseresistant and amyloidogenic, andaggregates in the brain(accumulation). The process is autocatalytic, newly formed PrPSc recruiting more PrPC, leading to escalating conversion and deposition. The nature of the toxic species is not known, and may be an unknown intermediate formed duringconversion, oligomeric PrPSc molecules or small aggregates of PrPSc. Depleting PrPC itself removes the substrate for conversion and formation of the neurotoxic species, whatever this might be.

(b) Scheme showing that grafted wild-type (PrP-expressing; PrP+/+) neural tissue into PrP-null (PrP0/0) brains is the only tissue where PrPSc is deposited and prion neurotoxicity occurs after prion infection [13]. Hence PrPSc only exerts its toxicity where PrPC is also expressed.

N. C. Verity and G. R. MallucciBiochem. J. (2011) 433, 19–29

Η τοξική πρωτείνη PrPsc δεν προκαλεί νευροτοξικότητα απουσία της φυσιολογικής μορφής PrPC

Εγκέφαλος ποντικού όπουδεν εκφράζεται PrPc

Μόσχευμα όπου εκφράζεται PrPc

Molecular surface graphs evidencing the differences in the predicted DNA-binding sites (left panel, colored blue) and the electrostatic potential distribution (right panel, colored blue for positive charge and red for negative charge) among PrP molecules from distinct mammalian species (PDB codes: 1QM1, 1DWZ, 1XYX, 1B10 and 2FJ3 for human, cattle, mouse, Syrian hamster and rabbit PrPs, respectively). Interestingly, All surface graphs were generated using MolMol (Koradi et al., Journal of Molecular Graphics, 1996).

J.L. Silva et al., Methods (2011)

Rabbits are the only species known to be resistant to infection with prions isolated from other species

PrP from rabbit, which constitutes, to date, the only known TSE agent-resistant species,presents a relatively small putative DNA-contacting surface. DNA-binding predictions were performed using DISPLAR.

Τριτοταγής δομή της θρυψίνηςΔιαμόρφωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας

Δομή που δείχνει τις πλευρικές αλυσίδες

Στερεοτακτική δομή. Κάθε άτομο (C,N,O)απεικονίζεται κατά μέγεθος.

Ενεργό κέντρο

S-S

Ser 177His 40Asp 85

Στην ινσουλίνη κυριαρχούν οι περιοχές α έλικας (57%). Το 6% αποτελείται από δομές β-πτυχωτής επιφάνειας, το 10% από β-στροφές και το υπόλοιπο 27% σε ακανόνιστες δομές

Τριτοταγής δομή της Ινσουλίνης

Τριτοταγής δομή της Ινσουλίνης

2. Αμινοξέα πάντα ή σχεδόν πάντα στην επιφάνεια, και σχεδόν το σύνολο στη μια πλευρά, σε όλες τις γνωστές ινσουλίνες. Πιθανός ρόλος στη σύνδεση της ινσουλίνης με τον υποδοχέα της.3. Πλάγιες αλυσίδες πολικών (υδρόφιλα στην επιφάνεια) και μη πολικών υδρόφοβων καταλοίπων (κίτρινο στο εσωτερικό και ροζ στην επιφάνεια για σταθεροποίηση της τεταρτοταγούς δομής μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων).

Τεταρτοταγής Δομή

Σχηματισμός συμπλεγμάτων (ολιγομερή) λόγω μη-ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων πολυπεπτιδικών υπομονάδων ή μονομερών των πρωτεινών (αιμοσφαιρίνη).

Δεν έχουν όλες οι πρωτείνες τεταρτοταγή δομή, όπως πρωτείνες αποτελούμενες από * 1 πολυπεπτίδιο (μυοσφαιρίνη) ή * διαφορετικά πολυπεπτίδια συνδεόμενα με ομοιοπολικούς (S-S) δεσμούς (α-χυμοθρυψίνη).

Εξαμερές ινσουλίνης που σταθεροποιείται με τη βοήθεια ιόντων Zn++.Μορφή αποθήκευσης της ινσουλίνης στο πάγκρεας

Ισοένζυμα

• Πολλαπλές μοριακές μορφές ενός ενζύμου• Κωδικοποιούνται από διαφορετικούς γενετικούς τόπους• Καταλύουν την ίδια αντίδραση• Εμφανίζουν διαφορές ως προς τις κινητικές

παραμέτρους• Εχουν διαφορετικές ρυθμιστικές ιδιότητες• Μπορούν να διαχωριστούν το ένα από το άλλο με βάση

τις βιοχημικές τους ιδιότητες (ηλεκτροφορητική κινητικότητα)

• Εκφράζονται σε συγκεκριμένα όργανα και στάδια εξέλιξης

• Συμβάλλουν στον συντονισμό του μεταβολισμού

Προέλευση των ισοενζύμων

π.χ. CK

π.χ. LDH

Ισοένζυμα LDH

H

M

Ημέρες πριν (-) καιμετά (+) τη γέννηση

Ισοένζυμα καρδιάς αρουραίουκατά την ανάπτυξη

Κατανομή ισοενζύμων σε διάφορους ιστούςενήλικα αρουραίου

Οι πρωτείνες αποδιατάσσονται

• Οι αποδιαταγμένες πρωτείνες χάνουν τη μορφή τους και κατά συνέπεια την λειτουργία τους- Πως μπορεί να να αποδιαταχτεί μια πρωτείνη?

Εκθεση σε: Ισχυρό οξύΙσχυρή βάσηΘέρμανσηΟργανικούς διαλύτεςΑναγωγικά μέσα

- Οι αποδιαταγμένες πρωτείνες μπορεί να χάσουν τη τεταρτοταγή, τριτοταγή και δευτεροταγή δομή τους- Η πρωτοταγής δομή μένει ανέπαφη

Αποδιάταξη και επαναδιάταξη της στερεοδομής πρωτεινών

Ριβονουκλεάση

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

The molecular weight of hemoglobin is approximately 64,500 daltons. Hb is composed of two pairs of dissimilar chains, α and β, each defined by a specific amino acid sequence and incorporating an iron-containing heme group. Two α–β dimers combine to form a hemoglobin tetramer. This allows for the "heme–heme" interaction necessary for effective oxygen uptake (deoxyhemoglobin → oxyhemoglobin) and delivery (oxyhemoglobin → deoxyhemoglobin). The oxygen affinity of hemoglobin is a function of this heme–heme interaction and of pH (Bohr effect), and is a measure of how many hemoglobin molecules have oxygen bound to them for a given level of oxygen tension. In a normal individual the major hemoglobin is Hb A, constituting approximately 97% of the total hemoglobin. Variations and/or amino acid substitutions in these chains exist. Some are deleterious to the normal function of hemoglobin, whereas others may have relatively normal oxygen affinity and stability. Hemoglobins containing different types of chains make up the remainder of the hemoglobin content in red cells (α2δ2 = Hb A2 approximately 2%; α2γ2 = Hb F approximately 1%).Substitutions in the normal hemoglobin amino acid sequence may result in hemoglobins that have different sub-unit interactions and varying affinities for oxygen. For example, a substitution of the sixth amino acid on the beta chain causes Hb S, or sickle hemoglobin. Hb S has a lower oxygen affinity and surrenders its oxygen more readily. Hb F, a normal minor hemoglobin constituent, has a higher oxygen affinity.

Δρεπανοκυτταρική αναιμία

POINT MUTATION

Δρεπανοκυτταρική αναιμία

Δομή της πράσινης φθορίζουσας πρωτείνης (GFP). The rearrangement and oxidation of the sequence Ser-Tyr-Gly is the source of fluorescence.

Παράδειγμα αναδίπλωσης α,β-περιοχής

PrPC is encoded by only one exon of the single-copy PRNP gene, which is located on human chromosome 20 [15]. The mature PrPC is composed of 208–209 amino acids and is attached to the outer leaflet of the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor [6] in a non-, mono- or di-glycosylated form [6]. A signal peptide of 22 amino acids is cleaved from the N-terminal region, which has a flexible, random coil sequence of about 100 amino acids. This region also contains four repeats of a sequence of eight amino acids (PHGGGWGQ), named the octapeptide or octarepeat domain, which is related to copper binding [16]. This region is also related to the binding of glycosaminoglycans and nucleic acids, especially RNA [17–19]. The C-terminal region is globular, with three alpha helices at positions 144–154, 173–194 and 200–228. A disulfide bond is formed between cysteine residues 179 and 214 [20].

In a general way, the conversion of PrPC to its altered isoform, PrPSc, leads to a refolding of alpha-helical and coil structures into a beta sheet [21,22]. These structural changes confer differentphysicochemical characteristics to PrPSc, such as insolubility in denaturing detergents and partial resistance to digestion by proteinases [15]. The tendency to aggregation of this isoform is related to its insolubility, and protease-resistant aggregates accumulate in the brain [6], which is one of the features of TSEs. Unlike PrPC, the three-dimensional structure of PrPSc has not yet been completely elucidated due to the heterogeneity of aggregates and the impossibility of purifying it in a soluble form. The increased beta-sheetcontent in PrPSc compared to PrPC has been detected through techniques such as Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Circular Dichroism (CD) [21,22]; thus, a cross-beta-sheet conformationwas proposed for scrapie prion rods [23]. Additionally, the overall structural organizations of fibrils from three different species (mouse, bovine and elk) have been shown to be very similar through hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Moreover, two regions (24–98) and (182–212) have been observed to be highly protected, and thus, the regions between them, with a higher solvent accessibility, have been proposed to be involved in the formation of the fibrillar interface [24].

J.L. Silva et al., Methods (2011)

Αλλαγή στη δευτεροταγή δομή μιας πρωτείνης μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στις φυσικοχημικές της ιδότητες με αποτέλεσμα την πρόκληση παθολογικών καταστάσεων: π.χ. Σπογγώδης Εγγεφαλοπάθεια

• Prion Diseases

• Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are infectious neurodegenerative conditions characterized by vacuolar degeneration of the central nervous system (CNS) and deposition of an abnormal isoform of the host-encoded prion protein (PrP). These diseases affect a wide variety of animal species and display limited zoonotic potential. Usually displaying prolonged incubation periods, they are clinically recognized via progressive neurological deterioration resulting from synaptic and neuronal loss and associated activated glial responses to CNS damage. Identification of genetically inherited forms of these diseases implicate further the critical role of the prion protein in disease pathogenesis and their classification as protein-misfolding disorders, with similarities to other progressive dementias such as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases and amyotrophic lateral sclerosis. Sporadic prion diseases, with no known genetic risk factor or exposure to infection, have also been identified. The disease-associated isoform of the prion protein gains several properties including ability to transmit infection, limited protease resistance, and increased ability to fibrillize and form amyloid, these observations on both etiology and biochemical nature of the agent resulted in the prion hypothesis.

• The prion hypothesis proposed that the infectious agent may be solely composed of a proteinaceous particle, i.e., the disease-associated isoform of the prion protein (PrPSc), with the means to self-propagate via an auto-catalytic process of template-mediated refolding of the nascent cellular prion protein (PrPC). The pathway and mechanisms from refolding of the prion protein to neurodegeneration are still unknown.

Viruses 2012, 4

Prion disease and the innate immune system

Viruses 2012, 4