211

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΚΑΤΟ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ ΣΤΗΝ ΟΡΓΑΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ,

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ

Η χημεία ελευθέρων ριζών και η φασματοσκοπία Ηλεκτρονικού

Παραμαγνητικού Συντονισμού (ΗΠΣ) έχουν σημαντικές εφαρμογές σε

πολλούς τομείς της χημείας, φυσικοχημείας, βιοχημείας, βιολογίας και

ιατρικής. Ο συνδυασμός των μηχανισμών ελευθέρων ριζών, ιδιαίτερα των

οξυγονούχων και αζωτούχων, σε βιοχημικές και βιολογικές αντιδράσεις και η

μεγάλη σημασία των ελευθέρων ριζών στο οξειδωτικό stress, στις χρόνιες

ασθένειες και κακοήθεις νεοπλασίες, έχουν δημιουργήσει πληθώρα

εφαρμογών στους τομείς αυτούς.

Επίσης, η χημεία ελευθέρων ριζών έχει επεκταθεί στη χημεία της

διατροφής λόγω της ευεργετικής δράσης των αντιοξειδωτικών συστατικών

των φυτικών τροφίμων, της δράσης των αντιοξειδωτικών βιταμινών και

ενζύμων που ρυθμίζουν το οξειδωτικό stress και πολυάριθμους ρυθμιστικούς

παράγοντες προστασίας των βασικών βιομορίων και του κυτταρικού και

μιτοχονδριακού DNA.

Tέλος, σημαντικές εφαρμογές της χημείας ελευθέρων ριζών

παρουσιάζονται στην περιβαλλοντική χημεία, την περιβαλλοντική

τοξικολογία και οικοτοξικολογία. Με ποικιλία μηχανισμών που υπάρχουν

ήδη στο φυσικό περιβάλλον, οι μηχανισμοί ελευθέρων ριζών μπορούν να

χρησιμοποιηθούν στη φωτοδιάσπαση τοξικών ρύπων στα υδατικά συστήματα

και την απολύμανση του πόσιμου νερού. Επίσης, οι μηχανισμοί ελευθέρων

ριζών συνδέονται άμεσα με τις τοξικές και επικίνδυνες δράσεις πολλών

ξενοβιοτικών ουσιών σε απλούς βιολογικούς οργανισμούς, σε ζώα, σε φυτά

και σε οικοσυστήματα.

Στο κεφάλαιο αυτό θα παρουσιασθούν πρακτικές εφαρμογές της

χημείας ελευθέρων ριζών με πρακτικά παραδείγματα και βιβλιογραφία σε

212

τρεις τομείς: στη μελέτη των οξειδωτικών βλαβών που προκύπτουν από τη

δράση ελευθέρων ριζών και οξειδωτικών ενώσεων (ROS, reactive oxygen

species) στο DNA των κυττάρων, στη μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης

φυτικών προϊόντων και στη φωτοχημική διάσπαση τοξικών οργανικών

ουσιών σε υδατικά συστήματα μέσω μηχανισμών ελευθέρων ριζών.

10.1 Μελέτη και εφαρμογές των οξειδωτικών βλαβών στο

κυτταρικό DNA μέσω ελευθέρων ριζών, ΗΠΣ και άλλων

μεθόδων

10.1.1. Εισαγωγή

Ο ρόλος των ελευθέρων ριζών στην πολυσταδιακή καρκινογένεση

κρίνεται κυρίως από τις οξειδωτικές βλάβες που προκαλούν στο DNA και η

μετεξέλιξη των βλαβών αυτών σε κακοήθεις νεοπλασίες. Οι βλάβες αυτές είναι

αποτέλεσμα είτε της ενδογενούς δράσης δραστικών οξυγονούχων ελευθέρων

ριζών και δραστικών οξειδωτικών μορίων, είτε με τη διείσδυση εξωγενών

καρκινογόνων παραγόντων στα εσωτερικά κυτταρικά διαμερίσματα,

μετατροπής τους σε ενεργούς μεταβολίτες μέσω ελευθέρων ριζών και

αντίδρασης με το χρωμοσωμικό δομικό υλικό του δεσοξυρίβοζο νουκλεϊνικού

οξέος (DNA).1

Τα τελευταία χρόνια έχει αυξηθεί το επιστημονικό ενδιαφέρον για την

οξειδωτική δράση ενδογενών τοξικών προϊόντων του φυσιολογικού

κυτταρικού μεταβολισμού σε ζωντανούς οργανισμούς και οι βλάβες στο DNA

που θα μπορούσαν να χαρακτηρισθούν ως “βλάβες υποβάθρου στο DNA”

(baseline,background DNA damage).2,3 Ο ποσοτικός και ποιοτικός προσδιο-

ρισμός των βλαβών αυτών έχει γίνει δυνατός τα τελευταία χρόνια με

εξαιρετικά ευαίσθητες αναλυτικές τεχνικές και βιολογικές δοκιμασίες, τόσο ως

προς τη δομή των συμπλόκων ή «προσθέτων» με το DNA (DNA-adducts) με

τις καρκινογόνες ουσίες, όσο και το είδος των σχάσεων στους κλώνους του

DNA, τις σημειακές μεταλλάξεις, τις σταυροσυνδέσεις, την ανταλλαγή

213

αδελφών χρωματίδων κ.λπ. Οι βλάβες αυτές αποτελούν προκαρκινικές

καταστάσεις που έχουν δυνητικά την ικανότητα να εξελιχθούν σε κακοήθεις

νεοπλασίες.4

Σχήμα 10.1. Δραστικές οξυγονούχες ελεύθερες ρίζες, στάδια καρκινογένεσης και

αντιδράσεις με βασικά βιομόρια βιολογικών οργανισμών

Καρκινογόνες χημικές ουσίες, ακτινοβολία κλπ, ικανότητα καρκινογένεσης

ΈΝΑΡΞΗ: ξενοβιοτικές χημικές ουσίες ενεργοποίηση κυτταρικών

πηγών ↓ ↓ ↓ άμεση επίδραση ↓ έμμεση επίδραση ↓ ↓ πρωτογενείς ελεύθερες ρίζες δραστικές οξυγονούχες ενώσεις(ROS) υπεροξυλο-(ROO•) O2 + e- → O2•- αλκοξυλο-(RO•) O2•- + O2 + 2H+ → H2O2 + O2 φαινοξυ-(C6H5-O•) Fe3+ + O2•- → O2 + Fe2+ αλκυλο-(RC•) Fe2+ + H2O2 → HO• + OH- + Fe3+ οργανικές ρίζες(R•) Προστατευτικοί αμυντικοί μηχανισμοί: αντιοξειδωτικά (ένζυμα και ουσίες μικρού μοριακού βάρους): υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), καταλάση, κερουλοπλασμίνη, Βιταμίνη C, Βιταμίνη Ε, ουρικό οξύ κλπ

↓ αντιδράσεις, βλάβες σε βιομόρια

↓ γονίδια ή ένζυμα DNA κυττάρων πρωτεΐνες λιπίδια μεμβρανών ενεργοποίηση / βλάβες / επιδιόρθωση οξείδωση λιπιδική υπεροξείδωση απενεργοποίηση

↓ δείκτες οξειδωτικού stress

ενεργοποίηση ογκογονιδίων παράγωγα οξειδωμένων οξειδωτική βλάβη προαγωγή κακοήθων όγκων DNA, πρωτεϊνών LOO•, L• (8-υδροξυ-δεοξυγουανοσίνη)

↓ Προαγωγή

↓ λανθάνουσα περίοδος

Μετεξέλιξη προς δημιουργία κακοήθων όγκων

↓ κακοήθη νεοπλάσματα

214

10.1.2. Βλάβες στο DNA από Οξυγονούχες Ελεύθερες Ρίζες και Δραστικά

Οξυγονούχα Είδη Ενώσεων

Το διατομικό Οξυγόνο (Ο2) δεν έχει την ικανότητα να οξειδώσει άμεσα

το DNA στη θερμοκρασία του σώματος των ζωντανών οργανισμών.

Ορισμένα όμως οξυγονούχα προϊόντα του φυσιολογικού μεταβολισμού, όπως

το υπεροξειδικό ανιόν (Ο2•−) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), θα

μπορούσαν να αντιδράσουν άμεσα με το DNA όταν οι συγκεντρώσεις τους

ξεπεράσουν τα φυσιολογικά επίπεδα.5 Οι περισσότερες όμως οξυγονούχες

ελεύθερες ρίζες (όπως η ρίζα υδροξυλίου, ΗΟ•), αζωτούχες ελεύθερες ρίζες και

άλλα δραστικά οξειδωτικά είδη ενώσεων μπορούν να αντιδράσουν και να

προκαλέσουν συγκεκριμένες βλάβες στη δομή του DNA, μεταλλάξεις και

πρόσθετα-DNA. Μέχρι σήμερα έχουν καταγραφεί από πειραματικά

αποτελέσματα πάνω από 100 είδη οξειδωτικών μετατροπών στο DNA.6

Οι βλάβες στο DNA από ελευθέρες ρίζες είναι κυρίως τριών ειδών:

α. Πρόκληση δομικών αλλαγών στο DNA: μεταλλάξεις σε ζεύγος βάσεων (base

pair mutations), μεταθέσεις, απάλειψη (deletion), εισαγωγές και επέκταση της

σειράς-διαδοχής (αλληλουχία) των νουκλεοβάσεων (insertions, sequence

amplifications), νίτρωση, απαμίνωση κ.λπ. Τέτοια είδη βλαβών μπορούν να

προκληθούν από τη ρίζα υδροξυλίου, το μονήρες Οξυγόνο (1Ο2, singlet

oxygen), αλκοξυ- και υπεροξυλο- ρίζες (RO•, ROO•), το όζον (Ο3), το

υπεροξυνιτρώδες ανιόν (Ο=ΝΟΟ−, peroxynitrite anion) και τα οξείδια του

αζώτου.7,8 Τα δραστικά οξυγονούχα είδη ενώσεων (που δεν είναι ελεύθερες

ρίζες, αλλά έχουν ισχυρή οξειδωτική δράση) μπορούν να προκαλέσουν

σημειακές μεταλλάξεις και μαζικές αλλαγές στα χρωμοσώματα. Οι αλλαγές

αυτές συμβάλλουν στην αδρανοποίηση ή απώλεια δυτέρου φυσικού (άγριου)

τύπου αλληλομόρφου (second wild-type allele) ενός μεταλλαγμένου πρωτο-

ογκογονιδίου ή κατασταλτικού ογκογονιδίου κατά τη διάρκεια της

προαγωγής ή μετεξέλιξης του κακοήθους κυττάρου, επιτρέποντας την

έκφραση μεταλλαγμένου φαινοτύπου.9,10

215

β. Η δεύτερη σημαντική επίδραση των οξυγονούχων ελευθέρων ριζών στην

κυτταρική λειτουργία είναι στους μηχανισμούς-οδούς μεταγωγής σημάτων

(signal transduction pathways) σε κυτταροπλασματικό και πυρηνικό

επίπεδο.11 Για παράδειγμα, το Η2Ο2 που διαπερνά εύκολα τις μεμβράνες των

κυττάρων και οργανιδίων, μπορεί να οδηγήσει σε μετατόπιση της

ανασταλτικής υπομονάδας από τον κυτταροπλασματικό μεταγραφικό

παράγοντα στον πυρηνικό παράγοντα κΒ, επιτρέποντας στον παράγοντα

ενεργοποίησης να μεταναστεύει στον πυρήνα.11,12 Σε άλλο παράδειγμα, η

νίτρωση της τυροσίνης από το Ο=ΝΟΟ− μπορεί να παρεμποδίζει την

φωσφορυλίωση.13

γ. Οι ελεύθερες ρίζες (οξυγονούχες και αζωτούχες) μπορούν να

διαμορφώσουν την ενεργότητα των πρωτεΪνών και γονιδίων που

ανταποκρίνονται στο οξειδωτικό στρες και τα οποία ρυθμίζουν τον κυτταρικό

πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και κυτταρική απόπτωση. Πολυάριθμες

έρευνες δείχνουν ότι οι οξυγονούχες ελεύθερες ρίζες ενεργοποιούν

ογκογονίδια με τα οποία θεωρείται ότι συμβάλλουν σε μηχανισμούς

καρκινογένεσης.14-16

10.1.3. Χημεία των Οξειδωτικών Βλαβών στο DNA: οξειδωτικές βλάβες στις νουκλεοβάσεις

Η οξειδωτική δράση των οξυγονούχων ελευθέρων ριζών δραστικών

οξυγονούχων μορίων που προκύπτουν από ενδογενείς και εξωγενείς πηγές

προκαλούν αλλοιώσεις στο μόριο των νουκλεοπρωτεϊνών και του DNA με

οξείδωση, μεθυλίωση, αποπουρίνωση (depurination) και απαμίvωση

(deamination).17-19 Οι χημικές αυτές αλλοιώσεις είναι κυρίως προσθήκες ή

σχάσεις στις νουκλεοβάσεις, στο υδατανθρακικό τμήμα του DNA, αλλά και σε

τμήματα εκτός της νουκλεοβάσης, μονοκλωνικές θραύσεις και

σταυροσυνδέσεις DNA-πρωτεϊνών με μεγάλη ποικιλία μηχανισμών.20,21

216

Σχήμα 10.2. Χημικοί τύποι των τεσσάρων νουκλεοβάσεων και των δύο σακχάρων και η

ελικοειδής διδιάστατη δομή του DNA.

Οι οξειδωτικές αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα με την επίδραση των

ελευθέρων ριζών στις νουκλεοβάσεις οφείλονται κυρίως στις ρίζες υδροξυλίου

(ΗΟ•) και σε ενυδατωμένα ηλεκτρόνια (eaq−). Οι ρίζες υδροξυλίου

προστίθενται στον διπλό δεσμό μεταξύ του C5-C6 των πυριμιδινών

(ουρακίλη, θυμίνη και κυτοσίνη), σχηματίζοντας 5-υδροξυ-6-υλο- και 6-

υδροξυ-5-υλο- ελεύθερες ρίζες. Η θέση C5 στις πυριμιδίνες είναι η θέση που

προτιμάται λόγω της υψηλότερης ηλεκτρονικής πυκνότητας και της υψηλής

ηλεκτρονιόφιλης φύσης της ρίζας υδροξυλίου. Στην περίπτωση των

πυριμιδινικών βάσεων των νουκλεϊνικών οξέων, θυμίνης και κυτοσίνης, η

προσθήκη της ρίζας υδροξυλίου γίνεται στη θέση C5 σε ποσοστό 60% και 90%

(περίπου) αντίστοιχα, και στη θέση C6 σε ποσοστό 30% και 10% αντίστοιχα.22

Εκτός από την προσθήκη, η ρίζα υδροξυλίου αφαιρεί ένα άτομο Η από τη

μεθυλο- ομάδα της θυμίνης σε ποσοστό (περίπου) 10%. Η ελεύθερη ρίζα που

προκύπτει διαφέρει ως προς τις οξειδοαναγωγικές της ιδιότητες. Η 5-υδροξυ-

6-υλο- ρίζα έχει αναγωγικές ιδιότητες, ενώ η 6-υδροξυ-5-υλο- ρίζα έχει

οξειδωτικές ιδιότητες.8

217

Οι αντιδράσεις που συμβαίνουν σε βιολογικά συστήματα, όταν

παράγονται ηλεκτρόνια σε υδατικό διάλυμα, έχουν σαν αποτέλεσμα την

παραγωγή ενώσεων προσθήκης με πυριμιδίνες. Τα ριζικά ιόντα που

σχηματίζονται δίνουν τις 6-υδροξυ-5-υλο- ελεύθερες ρίζες (Σχήμα 3).23

HN

NH

O

CH3

HO

+ e aqHN

N

O

CH3

HO

HN

NH

O

CH3

HO

HH

Θυμίνη Ριζικό ανιόν 6-υδρο-υλο ρίζα θυμίνης Σχήμα 10.3. Αντιδράσεις του eaq

− με πυριμιδίνες και τα προϊόντα που προκύπτουν με

τη θυμίνη, καθώς και η ακολουθούμενη πρωτoνίωση.

Οι αντιδράσεις της ρίζας υδροξυλίου με τις πουρινικές νουκλεοβάσεις

(αδενίνη, γουανίνη) είναι προσθήκες στους άνθρακες σε θέσεις C4, C5 και C8,

με αποτέλεσμα να σχηματίζονται παρόμοιες ποσότητες οξειδωμένων και

αναγωμένων ριζικών ενώσεων προσθήκης (adduct radicals).24 Παράδειγμα

αποτελεί η αντίδραση ρίζας υδροξυλίου με την γουανίνη (Σχήμα 4).

HN

N

N

NH

O

H2N H+ OH

HN

N

N

NH

O

H2N HOH

Ρίζα: C4-OH-πρόσθετο (adduct radical)

HN

N

N

NH

O

H2N H

OH

Ρίζα: C5-OH-πρόσθετο

HN

N

N

NH

O

H2NH

OH

Ρίζα: C8-OH-πρόσθετο

Γουανίνη

Σχήμα 10.4. Αντιδράσεις προσθήκης της ρίζας υδροξυλίου στην γουανίνη.

218

Οι ριζικές ενώσεις προσθήκης έχουν διαφορετικές μεσομερείς δομές. Οι

ριζικές ενώσεις προσθήκης C4-OH και C5-OH μπορούν να υποστούν

αφυδρογόνωση και να μετατραπούν σε ρίζες με οξειδοαναγωγικές ιδιότητες. 25,26 Η ριζική ένωση προσθήκης C8-OH στις πουρίνες μπορεί να υποστεί

μονομοριακή διάνοιξη του ιμιδαζολικού δακτυλίου. Το καλύτερο

παράδειγμα επαμφοτερίζουσας κατάστασης είναι η ρίζα C8-OH

(συμβολίζεται και ως G8OH•), όπου η πυκνότητα του spin βρίσκεται στους

άνθρακες C-4 και C-2. Η ρίζα αυτή είναι αναγωγική καθώς και το κατιόν

της, που σταθεροποιείται από άτομα α-αζώτου. Η αναγωγή από

ενδοκυτταρικές θειόλες (RSH) προκαλεί διάνοιξη του δακτυλίου και

σχηματισμό της ένωσης φορμαμιδοπυριμιδίνης (FAPy). Η ίδια ένωση μπορεί

να σχηματισθεί και από τη διάνοιξη του δακτυλίου της ρίζας C8-OH μετά από

αναγωγή. Η τελική ένωση FAPy είχε αρχικά διαχωριστεί από DNA αερόβιου

κυττάρου με ακτινοβόληση, αλλά αργότερα βρέθηκε σε ανθρώπινα κύτταρα

και στο ήπαρ μυών μετά ολική ακτινοβόληση, παρουσία ή μη οξυγόνου

(Σχήμα 5).28,29

HN

N N

N

O

H2NR

2 4

567

8

9

HN

N N

N

O

H2NR

4

OH

+HN

N N

N

O

H2NR

OH

5

Γουανίνη G4OH G5OH+

HN

N N

N

O

H2NR

4

8 OH

H

HN

N N

N

O

H2NR

8 OH

H

7HN

N N

N

O

H2NR

OH

G8OHΔιάνοιξηδακτυλίου

οξείδωση αναγωγή

+ e -, + H + + e -, + H +- e -, - H +

ή+ O2 , - O2 , -H+

HN

N N

N

O

H2NR

5OH

HN

N N

N

O

H2NR

OH

H

HN

N NH

N

O

H2NR

O

Διάνοιξηδακτυλίου

FAPyG

OH

Σχήμα 10.5. Μηχανισμοί προσθήκης ριζών υδροξυλίου σε γουανίνη και οι ενώσεις

που προκύπτουν με τη διάνοιξη του δακτυλίου.

219

Αλλά συμβαίνουν και διάφορες παραλλαγές των αντιδράσεων αυτών.

΄Όταν γίνει οξείδωση στους άνθρακες C-4 και C-2 των δομών συντονισμού

της G8OH•, τότε απομακρύνεται ένα πρωτόνιο του ιμιδαζολικού δακτυλίου

και παράγεται η 8-υδροξυγουανίνη. Το παράγωγο αυτό έχει βρεθεί σε

ακτινοβολούμενο DNA χρωματίνης, ανθρώπινα κύτταρα και ηπατικά

κύτταρα μυών.29-31 Το παράγωγο αυτό καλείται επίσης 7,8-διϋδρο-8-οξο-

γουανίνη (8-oxo-G), και αποτελεί την πλέον ποσοτικά άφθονη βλάβη σε

νουκλεοβάσεις του DNA, μετά από ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία,

η οποία ως γνωστόν έχει υψηλή μεταλλαξογόνο δράση στα βιολογικά

κύτταρα.32

Η ελεύθερη ρίζα G4OH• έχει οξειδωτικές ικανότητες, αλλά με την

απώλεια ύδατος μπορεί να παραχθεί η ουδέτερη ρίζα G(−H)• (Σχήμα 6).

HN

N N

N

O

H2NR

HN

N N

N

O

H2NR

OH

5

Γουανίνη(αναγεννημένη)

G4OH G5OH

4 8

οξείδωση

+ e -, + H +

HN

N N

N

O

H2NR

OH

οξείδωση

6

OH

- H2O

N

N N

N

O

H2NR

οξείδωση

αναγωγή

HN

N N

N

O

H2NR

G(-H)

Σχήμα 10.6. Ρίζες γουανίνης και επιδιορθώσεις με αφυδρογόνωση.

Με την πρόσληψη όμως ενός ηλεκτρονίου και την πρωτονίωση που

ακολουθεί αναπαράγεται η γουανίνη χωρίς βλάβες. Αυτό το παράδειγμα

οξειδοαναγωγικής μετατροπής είναι ενδιαφέρουσα περίπτωση επιδιόρθωσης

βλάβης σε νουκλεοβάση. Επίσης, η αναγωγική ρίζα G5OH• με την απώλεια

ύδατος παράγει τη ρίζα G(−H)•, η οποία μετατρέπεται σε γουανίνη.

Αναγωγικές ενώσεις, όπως οι θειόλες (RSH), μπορούν να διατηρήσουν την

220

αντίδραση in vivo και να δράσουν μέσω της γλουταθειόνης μέσα στα όρια του

συμπλόκου DNA-πρωτεΐνες, έχουν δε την ικανότητα να επιδιορθώσουν τις

βλάβες στις νουκλεοβάσεις του DNA, όπως στο παράδειγμα με την

γουανίνη.33,34

10.1.4. Προϊόντα Αντιδράσεων Μεταξύ Ελευθέρων Ριζών και DNA

Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα με την επίδραση των ελευθέρων

ριζών στα τμήματα των βάσεων και των σακχάρων του DNA είναι αρκετές

για να δώσουν ποικιλία προϊόντων που έχουν προσδιορισθεί με αρκετά

ευαίσθητες αναλυτικές τεχνικές.35

Οι ρίζες που σχηματίζονται με την επίδραση των ελευθέρων ριζών,

ιδιαίτερα με την απόσπαση Η, μπορούν να οξειδωθούν ή να υποστούν

αναγωγή ανάλογα με τις οξειδοαναγωγικές τους ιδιότητες και τις ουσίες με τις

οποίες αντιδρούν. Για παράδειγμα, η οξείδωση της 5-υδροξυ-6-υλο- ρίζας της

θυμίνης συνοδεύεται με την προσθήκη ΗΟ− (ή προσθήκη νερού συνοδευό-

μενη με αποπρωτονίωση) που οδηγεί στο σχηματισμό της θυμινικής γλυκό-

λης.36 Παρουσία οξυγόνου, σχηματίζεται αρχικά η 5-υδροξυ-6-υπεροξυλο-

ρίζα και με απώλεια Ο2•− παράγεται ξανά γλυκόλη της θυμίνης (Σχήμα 7).37

HN

NH

O

O

CH3

OH

H

HN

NH

O

O

CH3

OH

H

οξείδωση

- e-

HN

NH

O

O

CH3

OH

H

OH

H2O

-H+

5-υδροξυ-6-υλο-ρίζα γλυκόλη θυμίνης

HN

NH

O

O

CH3

OH

H

HN

NH

O

O

CH3

OH

H

H2O

-H+HN

NH

O

O

CH3

OH

H

OH

O2

O2-O2 ,

6-υδρο-5-υλο ρίζα θυμίνης 5-υδροξυ-6-υλο-ρίζα γλυκόλη θυμίνης

Σχήμα 10.7. Σχηματισμός της γλυκόλης θυμίνης από την οξείδωση της 5-υδροξυ-6-

υλο- ρίζας της θυμίνης. Παρουσία οξυγόνου σχηματίζεται η 5-υδροξυ-6-υπεροξυλο-

ρίζα και με απόσπαση του σχηματίζεται ξανά η γλυκόλη της θυμίνης (thymine glycol).

221

Τα αρχικά προϊόντα προσθήκης σε πουρινικές βάσεις (για παράδειγμα

η γουανίνη) της ρίζας υδροξυλίου και μετά το σχηματισμό της ρίζας C8-OH,

μπορούν να υποστούν αντιδράσεις οξειδοαναγωγής. Η οξείδωση ενός-

ηλεκτρονίου (1e-) οδηγεί σε 8-υδροξυπουρίνες, ενώ οι φορμαμιδο-πυριμιδίνες

σχηματίζονται από την αναγωγή με 1e- του ανοικτού ιμιδαζολικού

δακτυλίου. Επίσης, η αναγωγή 1e- της ρίζας-προσθέτου C8-OH, χωρίς τη

διάνοιξη δακτυλίου, οδηγεί αρχικά στην 7-υδρο-8-υδροξυγουανίνη και μετά

στη φορμαμιδοπυριμιδίνη (Σχήμα 8). Οι πειραματικές συνθήκες των

θραύσεων του DNA με ακτινοβολία (UV) χρησιμοποιούνται ως πρότυπα,

γιατί αντιπροσωπεύουν κλασικές καρκινογόνες δράσεις στο DNA, μέσω

ελευθέρων ριζών και προσομοιάζουν με βλάβες των οξυγονούχων ελευθέρων

ριζών.38,39

H2N

HN

N N

N

O

H2N

HN

N N

N

O

H2N

HN

N N

HN

O

H2N

HN

N N

NHCHO

O

dR

-e-, -H+

+ e-, +H+

dR

dR

dR

H2N

HN

N NH

NHCHO

O

dRαναγωγή

+ e-, +H+

2,6-διαμινο-4-υδροξυ-5-φορμαμιδοπυριμιδίνη

αναγωγή

7-υδροξυ-8-υδροξυγουανίνη

8-υδροξυγουανίνη

οξείδωση

C8-OH-πρόσθετο

OH

H

OH

OH

H

Σχήμα 10.8. Αντιδράσεις της ρίζας-προσθέτου C8-OH της γουανίνης και των

προϊόντων που προκύπτουν με οξειδοναναγωγικές αντιδράσεις.

10.1.5. Μεθοδολογία και Αναλυτικές Χημικές Τεχνικές για το Ποιοτικό και

Ποσοτικό Προσδιορισμό των Οξειδωτικών Βλαβών στο DNA

Η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των βλαβών στο DNA που

προκαλούν οι ελεύθερες ρίζες και οι δραστικές οξειδωτικές ουσίες είναι

222

μεγάλης σημασίας για να διερευνήσουμε και να τεκμηριώσουμε το είδος των

βλαβών και τις βιολογικές διεργασίες στην ανάπτυξη και προαγωγή των

κακοηθών νεοπλασιών. Οι βασικές μεθοδολογικές προσεγγίσεις για τις

αναλύσεις αυτές περιλαμβάνουν τεχνικές αέριας χρωματογραφίας

/φασματομετρίας μάζας (GC/MS) ή υγρής χρωματογραφίας υψηλής

πίεσης/φασματομετρία μάζας (HPLC/MS), ανοσοχημικές τεχνικές

(immunochemical), δοκιμασίες μετασήμανσης (postlabeling assays),

Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό (NMR) για τη μελέτη της διαμόρφωσης της

δομής οξειδωτικών προϊόντων, ηλεκτροχημικές τεχνικές, Ηλεκτρονικό

Παραμαγνητικό Συντονισμό (Electron Paramagnetic Resonance) για την

πιστοποίηση της δομής ελευθέρων ριζών, τεχνικές δεσμεύσεις των ριζών (spin

trapping) για τη δέσμευση ασταθών ελευθέρων ριζών, τη δοκιμασία Comet,

κλπ.40-43

Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει σημαντικές προσπάθειες να

μελετηθούν οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA και να γίνουν ποσοτικές και

ποιοτικές αναλύσεις σε κυτταρικές καλλιέργειες, σε πειραματόζωα και στον

άνθρωπο.44 Πολλές από τις τεχνικές αυτές έχουν βελτιωθεί σημαντικά ώστε να

μετρήσουν ποιοτικά και ποσοτικά εξαιρετικά μικρές ποσότητες προϊόντων

οξείδωσης του DNA (της τάξης των 10-6-10-7 M και femtmole) σε κυτταρικά

εκχυλίσματα από διάφορα όργανα των πειραματόζωων, αλλά και του

ανθρώπου.45,46 Οι αναλυτικές αυτές τεχνικές διερεύνησαν τους πολύπλοκους

οξειδωτικούς μηχανισμούς και τα ενδιάμεσα ή τελικά προϊόντα των

μετασχηματισμών που συμβαίνουν στις δομές του DNA.47,48 ΄Έχει αποδειχθεί

πειραματικά ότι οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA συνδέονται άμεσα με

διάφορους τύπους καρκίνου.49-51 Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται

εκτεταμένα η ποσοτική ανάλυση της βλάβης 8-υδροξυ-2’-δεοξυγουανοσίνη ως

δείκτης καρκινογένεσης και για την εκτίμηση κινδύνου ανάπτυξης κακοήθων

όγκων.52

Η τεχνική του Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού (EPR)

έχει χρησιμοποιηθεί με αρκετή επιτυχία για την πιστοποίηση της δομής των

223

ελευθέρων ριζών που σχηματίζονται στις νουκλεοβάσεις και στο δίκλωνο

DNA μετά από επίδραση ριζών υδροξυλίου.53-55

Οι τεχνικές της υγρής και αέριας χρωματογραφίας σε συνδυασμό με τη

φασματομετρία μάζας είναι πλέον οι πλέον χρησιμοποιούμενες για την

ανάλυση των προϊόντων οξείδωσης του DNA από ελεύθερες ρίζες. Τα αρχικά

προβλήματα και οι παραπλανητικές ενδείξεις κατά τις ποσοτικές μετρήσεις

έχουν μειωθεί σημαντικά, ενώ οι διαφορετικές τεχνικές ανίχνευσης των

ενώσεων, όπως η ηλεκτροχημική ανίχνευση έχει βελτιώσει την αναλυτική

μεθοδολογία.56-58

10.1.6. Βιβλιογραφία

1. Beckman KB, Ames BN. Oxidative decay of DNA. J Biol Chem 1997, 272:19633-

19636.

2. Marnett LJ, Burcham PC. Endogenous DNA adducts potential and paradox.

Chem Res Toxicol 1993, 6:771-785.

3. Gupta RC, Lutz WK. Background DNA damage from endogenous and

unavoidable exogenous carcinogens: a basis for spontaneous cancer incidence?

Mutat Res 1999, 424:1-8.

4. Nath RG, Rnderath K, Li D, Chung FL. Endogenous production of DNA adducts.

Regul Toxicol Pharmacol 1996, 23:22-28.

5. Halliwell B, Aruoma OI. DNA damage by oxygen-derived species: its mechanism

and measurement in mammalian systems. FEBS Lett 1991, 281:9-19.

6. Cadet J, Berger M, Douki T, Ravanat JL. Oxidative damage to DNA: formation,

measurement, and biological significance. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1997,

131:1-87.

7. Dizdaroglu M. Chemistry of free radical damage to DNA and nucleoproteins. In:

Halliwell B, Aruoma OI, eds. DNA and Free Radicals. Ellis Horwood Ltd,

Chichester, 1993:19-39.

8. Steenken S. Purine base, nucleosides, and nucleotides: aqueous solution redox

chemistry and transformation reactions of their radical cations and e- and OH

adducts. Chem Rev 1989, 89:503-520.

9. Cerutti PA. Prooxidant states and tumor promotion. Science 1985, 227:375-381.

224

10. Cerutti PA. Oxy-radicals and cancer. Lancet 1994, 344:862-863.

11. Burton RH, Alliangana D, Gill V. Endogenously generated active oxygen species

and cellular glutathione levels in relation to BHK-21 cell proliferation. Free Rad

Res 1994, 21:121-133.

12. Hu JJ, Dubin N, Kurland D, Ma B-L, Roush GC. The effects of hydrogen peroxide

on DNA repair activities. Mutat Res 1995, 336:193-201.

13. Ιschiropoulos H, Zhu L, Chen J, Tsai M, Martin J, Smith C, Beckman JS.

Peroxynitrite-mediated nitration of tyrosine catalyzed by superoxide dismutase.

Arch Biochem Biophys 1992, 298:431-437.

14. Schreck R, Albermann K, Bauerle PA. Nuclear factor kB: an oxidative stress-

responsive transcription factor of eukaryotic cells. Free Rad Res Commun 1992,

17:221-237.

15. Jackson JH. Potential molecular mechanisms of oxidant-induced carcinogenesis.

Environ Health Perspect 1994, 102(Suppl 10):155-157.

16. Stevenson MA, Pollock SS, Coleman CN, Calderwood SK. X-irradiation, phorbol

esters, and H2O2 stimulated nitrogen-activated pro NIH-373 cells through the

formation of reactive oxygen intermediates. Cancer Res 1994, 54:12-15.

17. Ames BN. Endogenous DNA damage as related to cancer and aging. Mutat Res

1989, 214:41-46.

18. Fiala ES, Conaway CC, Mathis JE. Oxidative DNA and RNA damage in the livers

of Sprague-Dawley rats treated with the hepatocarcinogen 2-nitropropane. Cancer

Res 1989, 49:518-5522.

19. Cerda S, Weitzman SA. Influence of oxygen radical injury on DNA methylation.

Mutat Res 1997, 386:141-152.

20. Oleinick NL, Chiu S, Ramakrishnan N, Xue L. The formation, identification and

significance of DNA-protein cross-links in mammalian cells. Br J Cancer 1987,

55(Suppl 8):135-140.

21. Nackerdien Z, Olinski R, Dizdaroglu M. DNA base damage in chromatin of γ-

irradiated cultured human cells. Free Rad Res Commun 1992, 16:259-273.

22. Fujita S, Steenken S. Pattern of HO radical addition to uracil and methyl- and

carboxyl-substituted uracils. Electron transfer of HO adducts with N,N,N’,N’-

tetramethyl-p-phenylenediamine and tetranitromethane. J Am Chem Soc 1981,

103:2540-2545.

225

23. Das S, Deeble DJ, Schuchmann MN, von Sonntag C. Pulse radiolytic studies on

uracil and uracil derivatives. Protonation of their electron adducts at oxygen and

carbon. Int J Rad Biol 1984, 46:7-9.

24. O’ Neil P. Pulse radiolytic study of the interaction of thiols and ascorbate with

HO-adducts of dGMP and fG. Implications for DNA repair processes. Radiation

Res 1983, 96:198-210.

25. Kawanishi S, Hiraku Y, Oikawa S. Mechanism of guanine-specific DNA damage

by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging. Review. Mutat Res

2001, 488:65-76.

26. Vieira AJSC, Steenken S. Pattern of HO radical reactions with adenine and its

nucleosides and nucleotides. Characterization of two types of isomeric HO

adducts and their unimolecular transformation reactions. J Am Chem Soc 1990,

112:6986-6994.

27. Hems G. Chemical effects of ionizing radiation on deoxyribonucleic acid in dilute

aqueous solution. Nature 1960, 186:710-712.

28. Gajewski E, Rao G, Nackerdien Z, Dizdaroglu M. Modification of DNA bases in

mammalian chromatin by radiation-generated free radicals. Biochemistry 1990,

29:7876-7882.

29. Kasai H, Tanooka H, Nishimura S. Formation of 8-hydroxyguanine residues in

DNA by X-irradiation. Gann 1984, 75:1037-1039.

30. Kasai H, Crain PF, Kuchino Y, Nishimura S, Ootsuyama A, Tanooka H.

Formation of 8-hydroxyguanine moiety in cellular DNA by agents producing

oxygen radicals and evidence for its repair. Carcinogenesis 1986, 7:1849-1851.

31. Mori T, Hori Y, Dizdaroglu M. DNA base damage generated in vivo in hepatic

chromatin of mice upon whole body γ-irradiated. Int J Radiat Biol 1993, 64:645-

650.

32. Moriya M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in

mammalian cells: 8-oxoguanosine in DNA induces targeted C.C-T.A

transversions in simian kidney cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:1122-1126.

33. O’ Neill P, Chapman PW. Potential repair of free radical adducts of dGMP and

dG by a series of reductants: a pulse radiolytic study. Int J Radiat Biol 1985, 47:71-

80.

34. Breen AP, Murphy JA. Reactions of oxyl radicals with DNA. Review. Free Rad

Biol Med 1995, 18:1033-1077.

226

35. Dizdaroglu M, Bergtold DS. Characterization of free-radical-induced base

damage in DNA at biologically relevant levels. Anal Biochem 1986, 156:182-188.

36. Teoule R. Radiation-induced DNA damage and its repair. Int J Radiat Biol 1987,

51:573-589.

37. Teoule R, Cadet J. Radiation-induced degradation of the base component in DNA

and related substances-final products. In: Huttermann J, Kohnlein W, Teoule R,

Bertinchamps AJ, eds. Effects of Ionizing Radiation on DNA. Springer, New York,

1978:171-203.

38. Fuciarelli AF, Wegher BJ, Blakely WF, Dizdaroglu M. Yields of radiation-induced

base products in DNA: effects of DNA conformation and gassing conditions. Int J

Radiat Biol 1990, 58:397-415.

39. Simic MG. DNA markers of oxidative processes in vivo: relevance to

carcinogenesis and anticarcinogenesis. Cancer Res 1994, 54 (Suppl): 1981S-1923S.

40. Mouret JF, Odin F, Polvorelli M, Cadet J. 32P-Postlabeling measurement of

adenine N-1-oxide in cellular DNA exposed to hydrogen peroxide. Chem Res

Toxicol 1990, 3:102-110.

41. Dizdaroglu M. Facts and artifacts in the measurements of oxidative DNA base

damage by gas chromatography-mass spectrometry. Review. Free Rad Res 1998,

29:551-563.

42. Cadet J, Douki T, Pouget JP, Ravanat JL. Singlet oxygen DNA damage products:

formation and measurement. Methods Enzymol 2000, 319:143-153.

43. Pflaum M, Will O, Epe B. Determination of steady-state levels of oxidative DNA

base modifications in mammalian cells by means of repair endonucleases.

Carcinogenesis 1997, 18:2225-2231.

44. Dizdaroglu M. Chemical determination of free radical-induced damage to DNA.

Free Rad Biol Med 1991, 10:225-242.

45. Cadet J, Delatour T, Douki T, Gasparutto D, Pouget J-P, Ravanat J-L, Sauvaigo S.

Hydroxyl radicals and DNA base damage. Mutat Res 1999, 424:9-21.

46. Cadet M, Berger T, Douki T, Ravanat J-L. Oxidative damage to DNA: formation,

measurement, and biological significance. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1997,

131:1-87.

47. Collins J, Cadet J, Epe B, Gedik C. Problems with the measurement of 8-

oxoguanine in human DNA. Carcinogenesis 1997, 18:1833-1836.

227

48. Helbock HJ, Beckman KB, Shigenaga MK, Walter PB, Woodall AA, Yeo HC,

Ames BN. DNA oxidation matters: the HPLC-electrochemical detection assay of

8-οxο-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:283-

293.

49. Olinski R, Zastawny TH, Folkinski M, Windorbska W, Jaruga P, Dizdaroglu M.

DNA base damage in lymphocytes of cancer patients undergoing radiation

therapy. Cancer Lett 1996, 106:207-215.

50. Malins DC, Polissar NL, Gunselman SJ. Progression of human breast cancers to

the metastatic state is linked to hydroxyl and radical-induced DNA damage. Proc

Natl Acad Sci USA 1996, 93:2557-2563.

51. Loft S, Poulsen HE. Cancer risk and oxidative DNA damage in man. J Mol Med

1996, 74:297-312.

52. Kasai H. Analysis of a form of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2’-

deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during carcinogenesis.

Mutat Res 1997, 387:147-163.

53. Catterall H, Davies MJ,Gilbert BC, Polack NP. EPR spin-trapping studies of the

reaction of hydroxyl radicals with pyrimidine nucleobases, nucleosides and

nucleotides and DNA. Direct evidence for sites of initial attack and for strand

breakage. J Chem Soc Perkin Trans 2 1993:2039-2047.

54. Hazlewood C, Davies MJ, Gilbert BC, Packer JE. Electron paramagnetic

resonance studies of the reaction of aryl radicals with nuclei acids and their

components. J Chem Soc Perkin Trans 2 1995 :2167-2174.

55. Davies MJ, Gilbert BC, Hazlewood C, Polack NP. EPR spin-trapping studies of

radical damage to DNA. J Chem Soc Perkin Trans 2 1995:13-21.

56. Halliwell B, Dizdaroglu M. The measurement of oxidative damage to DNA by

HPLC and GC/MS techniques. Free Rad Res Commun 1992, 16:75-87.

57. Halliwell B. Oxidative DNA damage: meaning and measurement. In: Halliwell B,

Aruoma OI, eds. DNA and Free Radicals. Ellis Horwood, New York, 1993:67-79.

58. Aruoma B, Halliwell B, eds. DNA and Free Radicals, Techiques, Mechanisms and

Applications. OICA International Press, St Lucia, 1998.

228

Παράδειγμα 1. Πειραματική διεργασία και φάσμα ΗΠΣ.

Οι αντιδράσεις της ρίζας υδροξυλίου με τις νουκλεοβάσεις αδενίνη και

γουανίνη, είναι προσθήκες στις θέσεις 4, 5 και 8, με αποτέλεσμα να

σχηματίζονται ενώσεις προσθήκης (adduct radicals). Η αντίδραση της ρίζας

υδροξυλίου με τη γουανίνη φαίνεται στο σχήμα 9.

H2N

HN

N N

N

O

dR

12

3 4

56 7

89

H2N

HN

N N

N

O

dR

+

H2N

HN

N N

N

O

dROH

H2N

HN

N N

N

O

dR

OH

OH

H

OH

Σχήμα 10.9. Σχηματισμός ενώσεων προσθήκης της ρίζας υδροξυλίου με τη γουανίνη

H2N

HN

N NH

N

O

H2N

HN

N NH

N

O

OHH2N

HN

N NH

N

OOH

OH

H

N

But

O

N

But O

N

But

O

C4-OH-πρόσθετο C5-OH-πρόσθετο C8-OH-πρόσθετο αΝα=1.54mT αΝα=1.61mT αΝα=1.61mT αΗβ=0.33mT

Σχήμα 10.10. Η προσθήκη του δεσμευτή ριζών ΜΝΡ [(CH3)3—N+—O-] σχηματίζει

τις C4, C5 και C8 δεσμευμένες ρίζες και αναγνωρίζονται με φασματοσκοπία ΗΠΣ.

Ρίζα: C4-OH-πρόσθετο Ρίζα: C5-OH-πρόσθετο Ρίζα: C5-OH-πρόσθετο

229

Σχήμα 10.11. Φάσμα ΗΠΣ ριζικών ενώσεων προσθήκης της 5-φωσφορικής

γουανοσίνης με ΜΝΡ (Φασματ.παράμετροι: αΝα=1.53mT και 1.52mT, αΗβ=0.18mT

και 0.30mT).

Το φάσμα αυτό θεωρείται ότι αποτελείται από υπερκαλυπτόμενα

σήματα ριζικών ενώσεων προσθήκης:

- O3POH2C

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HH

HH

OH

NBut O

- O3POH2C

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HH

HH

NBut O

HO

H

C4-OH-πρόσθετο C4-OH-πρόσθετο

230

HN

NH

O

O

N

NH

O

O

HOH

H

HO HN

NH

O

O

HN

NH

O

O

H

OHH

HO

C5 C6

Σχήμα 10.12. Το ΗΠΣ φάσμα των πρόσθετων με ΜΝΡ σε θέσεις C5 και C6 της

ουρακίλης.

(Catterall H, Davies MJ, Gilbert BC, Polack NP. EPR spin-trapping studies of

the reaction of the hydroxyl radical with pyrimidine nucleobases, nucleosides

and nucleotides, polynucleotides and RNA. Direct evidence for sites of initial

attack and for strand breakage. J.Chem Soc Perkin Trans 2, 1993:2039-2047)

231

Παράδειγμα 2. Διαχωρισμός και ανίχνευση της 8-υδροξυδεοξυ-

γουανοσίνης (8-OHdG) με HPLC, με UV(A) και με ηλεκτροχημικό

ανιχνευτή (B).

Σχήμα 10.13. Η δράση της ρίζας υδροξυλίου στην δεοξυγουανοσίνη(dG) παράγει το

κλασικό μεταλλαξογόνο πρόσθετο 8-υδροξυδεοξυ-γουανοσίνη (8-OHdG) που

αναγνωρίζεται ως η κύρια βλάβη σε νουκλεοβάσεις του DNA από τη δράση ελευθέρων

ριζών. Η πιστοποίηση τη8-υδροξυδεοξυ-γουανοσίνης με τη μέθοδο HPLC την καθιστά

ως βιοδείκτη βλαβών, που δύνανται να οδηγήσουν σε κακοήθεις νεοπλασίες.

(Mikhailova MV, et al. Cadmium-induced 8-hydroxydeoxyguanosine

formation, DNA strand breaks and antioxidant enzyme activities in

lymphoblastic cells. Cancer Lett 1997, 115:141-148)

232

Παράδειγμα 3.

Οι βλάβες στο DNA κυττάρων από ελεύθερες ρίζες (ιδιαίτερα HO● )

μπορούν να προσδιοριστούν και με τη μέθοδο Comet Assay. Η μεθοδολογία

περιλαμβάνει αλκαλική μικρο-γέλη ηλεκτροφόρηση.

Οι βασικές αρχές της Comet Assay παρουσιάζονται παρακάτω:

Σχήμα 14. Σχηματική παράσταση της Comet Assay για ανίχνευση βλαβών στο

κυτταρικό DNA

(Johnson MK, Loo G.Effects of epigallocatechin and quercetin on oxidative

damage to cellular DNA. Mut.Res. 459: 211-218, 2000)

233

Παράδειγμα 4.

Μελέτη των βλαβών στο DNA από ελεύθερες ρίζες με τη μέθοδο Comet

Assay.

Σχήμα 10.15. Βλάβες στο DNA και Comet Assay σε WTK-1 λυμφοβλάστες

ανθρώπων.

(α) δείγμα χωρίς ακτινοβολία

(b) προσθήκη deuteroporphyrin (DP) φωτοευαίσθητης που παράγει ελεύθερες ρίζες

Ο2(1Δg)

(c), (d), (e) αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών και παρουσίαση της ‘’ουράς’’ του

DNA που υποδεικνύει βλάβες

(f), (g) προσθήκη οξειδωτικών (trolox)

(Ouedraogo GD, Redmond RW, Secondary reactive oxygen species extend the

range of photosensitization effects in cells: DNA damage produced via initial

membrane photosensitization. Photochem Photobiol, 2003, 77: 192-203)

234

Παράδειγμα 5.

Μελέτη της παραγωγής 8-υδροξυδεοξυγουανοσίνης (8-OHdG) με την

αντίδραση Fenton.

Σχήμα 10.16. Χρωματογραφία HPLC Της 8-OHdG με ανιχνευτή UV στα 260 nm

και με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή. Πλασμίδια DNA υπέστησαν την επίδραση Fe3+ /

H2O2 σε ρυθμιστικό διάλυμα. Επίσης; Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε

πήκτωμα αγαρόζης( η φωτογραφία μετά από χρώση με ethidium bromide).

(Toyokumi S, Sagripanti JL. Association between 8-hydroxy-2’-deoxy-

guanosine formation and DNA strand breaks mediated by copper and ion.

Free Rad Biol Med, 1996, 20: 859-864)

235

10.2. Πρακτικές εφαρμογές και μεθοδολογία στη μελέτη της

αντιοξειδωτικής δράσης των συστατικών φυτικών τροφίμων

Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής δράσης

ουσιών (φυσικά προϊόντα φυτών, τροφίμων, βιταμίνες, κ.λπ) στις αντιδράσεις

με τις ελεύθερες ρίζες. Μία από τις πλέον χρήσιμες μεθόδους είναι η

χρησιμοποίηση της σταθερής ρίζας DPPH σε διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης. Η

DPPH απορροφά στην ορατή περιοχή στα 517 nm. H απορρόφηση μειώνεται

σταδιακά (συνήθως μετράται η μείωση μέσα σε 30 min) με την προσθήκη

μικρών συγκεντρώσεων αντιοξειδωτικών ουσιών (π.χ. ταννίνες τσαγιού,

πολυφαινόλες ερυθρού οίνου, βιταμίνες ελαιολάδου κ.λπ) και από τη μείωση

σε 50% εξάγεται ένα μέτρο της αντιοξειδωτικής δράσης και συγκρίνεται με

άλλες γνωστές αντιοξειδωτικές ουσίες, όπως η κερκετίνη, η βιταμίνη C, E ή

συνθετικό παράγωγο της βιταμίνης Ε, (Trolox).

N N

O2N

O2N

NO2 RH + DPPH DPPH H + R

σταθερή ρίζαλόγω συντονισμού

DPPH

Η αντιοξειδωτική δράση θεωρείται ότι γίνεται με 3 τρόπους ως προς τη

σταθερή ρίζα DPPH:

(α) μεταφορά δεύτερου υδρογόνου από την αντιοξειδωτική ουσία στη

σταθερή ρίζα DPPH συνοδευόμενο από ηλεκτρονική μετατόπιση προς τον

υποκαταστάτη p-θέση

(β) από το διμερισμό δύο φαινοξυ-ριζών χωρίς υποκαταστάτες σε ο- ή p-θέση.

Μετά το διμερισμό τα υδροξύλια των φαινολών ανανεώνονται και αντιδρούν

εκ νέου

(γ) δημιουργία σύμπλοκης ένωσης μεταξύ του DPPH και μιας άρυλο-ρίζας

236

Παράδειγμα 1. Μελέτη της σταθερής ελεύθερης ρίζας DPPH και μείωση της

απορρόφησης στα 517nm με την προσθήκη αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος.

Σχήμα 10.17. Η απορρόφηση στα 517 nm μειώνεται με την αυξανόμενη προσθήκη

αντιοξειδωτικών συστατικών(εκχυλίσματα φυτικών τροφίμων). Η στατιστική ανάλυση

των αποτελεσμάτων σε σχέση με την ποσοτική ανάλυση την ποσοτική σχέση του

αντιοξειδωτικού μας παρέχει την εικόνα της αντιοξειδωτικής ικανότητας

Παράδειγμα 2. Μετρήσεις αντιοξειδωτικής δράσης του ελαιολάδου (RS50)

Σχήμα 10.18. Αντιοξειδωτική μέτρηση για το μεθανολικό εκχύλισμα ελαιολάδου

(παραλαμβάνει τις πολυφαινόλες) με DPPH με UV-VIS στα 517 nm και μελέτη της

κινητικής της εξουδετέρωσης. Η RSC (Radical Scavenging Capacity) είναι μέτρο της

ικανότητας των πολυφαινολών να εξουδετερώσουν βλαβερές οξυγονούχες ελεύθερες

ρίζες.

237

(Espin JC, Soler-Rivas C, Wichers HJ. Characterization of the total free radical

scavenger capacity of vegetable oils fractions using 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl radical. J Agric Food Chem, 48: 648-656, 2000)

Παράδειγμα 3.

Η τεχνική με το DPPH μπορεί να εφαρμοσθεί και για μετρήσεις με

Ηλεκτρονικό Παραμαγνητικό Συντονισμό(ΗΠΣ). Το ΗΠΣ φάσμα του DPPH

μειώνεται με την προσθήκη μικρών ποσοτήτων αντιοξειδωτικής ουσίας. Με

στατιστική ανάλυση της μείωσης των κορυφών μπορεί να υπολογισθεί το

RSC50 ή IC50 (inhibition capacity 50%).

Σχήμα 10.19. Μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης με τη βοήθεια του ΗΠΣ φάσματος

του ΗΠΣ. Οι ακραίες κορυφές είναι εσωτερικό πρότυπο Mg2+. Η προσθήκη αυξημένων

ποσοτήτων της κατεχίνης (-)-EGGg μειώνει τις κορυφές του φάσματος.

238

Παράδειγμα 4. Αντιοξειδωτική δράση φυτικών προϊόντων σε σχέση με τις

ρίζες υδροξυλίου.

Η αντιοξειδωτική δράση των συστατικών φυτικών τροφίμων μπορεί να

μελετηθεί σε σχέση με την παραγωγή ριζών υδροξυλίου(ΟΗ•) με το σύστημα

Fenton:

Fe2+ + H2O2 HO + HO + Fe3+

Η πιο συνηθισμένη μεθοδολογία είναι να δεσμευθεί η ρίζα υδροξυλίου

με DMPO (spin trap) και να μελετηθεί το φάσμα ΗΠΣ των τεσσάρων

κορυφών (1:2:2:1), όπως δείχνει τα παρακάτω σχήμα:

HON

O

CH3

CH3++

N

O

CH3

CH3

H

OH

DMPO DMPO-OH

Σχήμα 10.20. Φάσματα ΗΠΣ με δέσμευση ριζών υδροξυλίου με DMPO. Το ύψος των

κορυφών του φάσματος μειώνεται με την επίδραση αντιοξειδωτικών ουσιών (όπως

εκχύλισμα από τσάι, ερυθρό κρασί, ελαιθόλαδο).

239

Σχήμα 10.21. Επίδραση του αντιοξειδωτικού rebamopide στο ύψος των κορυφών του

ΗΠΣ φάσματος του DMPO-OH που παράγεται από το σύστημα Η2Ο2 / FeSO4

παρουσία DMPO. (a) DMPO, (b) repamipide, (c)0.01 mM, (d) 0.02 mM, (e) 0.05

mM, (f) 0.1 mM, (g) 0.2 mM, (h) 0.5 mM

(Νaito Y, Yoshikawa T, Tanigava T, et al. Free Rad Biol Med, 18: 117-123,

1995)

Σχήμα 10.22. Επίδραση του M-5011 στο σχηματισμό του DMPO-OH, το οποίο

παράγεται από το σύστημα Η2Ο2 / FeSO4 παρουσία DMPO.

(Kataoka M, Tonooka K, Ando T, et al. Free Rad Res, 27: 419-427, 1997)

240

Παράδειγμα 5. Μείωση της παραγωγής Ο2●—με αντιοξειδωτικά

εκχυλίσματα.

Μια άλλη προσέγγιση της αντιοξειδωτικής δράσης συστατικών των

τροφίμων είναι η μείωση του υπεροξειδικού ανιόντος(Ο2●—) που παράγεται

από διάφορα συστήματα (ξανθίνη / οξειδάση ξανθίνης), ΚΟ2 / αιθέρας

στέμμα) σε υδατικό διάλυμα ή σε DMSO.

H δέσμευση του Ο2●— επιτυγχάνεται με DMPO. Το φάσμα της

δεσμευμένης ρίζας [DMPO—ΟΟΗ] μελετάται με φάσματα ΗΠΣ. Η μείωση

του ύψους των κορυφών είναι γραμμική σε σχέση με τη συγκέντρωση της

αντιοξειδωτικής ουσίας.

Σχήμα 10.23. Φάσματα ΗΠΣ για το DMPO—ΟΟΗ και μείωση των κορυφών με την

προσθήκη αντιοξειδωτικών.

(Kataoka M, Tonooka K, Ando T, et al. Hydroxyl radical scavenging activity

of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Free Rad Res, 27: 419-427, 1997)

241

OH

OH

R+

O

OH

+ RH

O

OH

+ R

O

O

+ RH

Σχήμα 10.24. Αντιοξειδωτική δράση των ο-διϋδροξυπαραγώγων και σταθεροποίηση

της παραγόμενης ρίζας, μέσω δομών που είναι λιγότερο δραστικές ή σταθερές κινόνες.

Ομάδα γαλλικού εστέρα

Catechins Configuration R1 R2 Sc50 (μΜ)

(+)-Epicatechin (επικατεχίνη)

(+)-Catechin (κατεχίνη)

(-)-Epicatechin (επικατεχίνη)

(-)-Catechin (κατεχίνη)

(-)-Epigallocatechin (επιγαλλοκατεχίνη)

(-)-Gallocatechin (γαλλοκατεχίνη)

(-)-Epicatechin gallate (επικατεχίνη γαλλικού εστέρα)

(-)-Catechin gallate (κατεχίνη γαλλικού εστέρα)

(-)-Epigallocatechin gallate (επιγαλλοκατεχίνη

γαλλικού εστέρα)

(-)-Gallocatechin gallate (γαλλοκατεχίνη γαλλικού

εστέρα)

α-Tocopherol (Vitamin E) (α–Τοκοφερόλη, βιταμίνη Ε)

Ascorbic acid(Vitamin C) (ασκορβικό οξύ, βιταμίνη C)

2S, 3R

2R, 3S

2R, 3R

2S, 3R

2R, 3R

2S, 3R

2R, 3R

2S, 3R

2R, 3R

2S, 3R

OH

OH

OH

OH

OH

OH

GA

GA

GA

GA

H

H

H

H

OH

OH

H

H

OH

OH

2.9

2.9

3.0

2.7

1.8

2.1

1.2

1.4

1.2

1.1

18

13

Σχήμα 10.25. Μέτρηση της SC50 (Scavenging Capacity 50%) ορισμένων κατεχινών

και σύγκριση με α-τοκοφερόλη (βιταμίνη Ε) και ασκορβικού οξέος (βιταμίνη C), (GA:

γαλλικό οξύ).

(Nanjo F, Gotok K, Seto, Suzuki M, Hara Y. Scavenging effects of teacatechins and

their deritives of 1,1-Dimethyl-2-picryllhydrazylradical. Free Rad Biol Med, 1996, 21:

895-902).

242

10.2.1. Παραδείγματα ουσιών (συστατικών τροφίμων) που παρουσιάζουν αντιοξειδωτική ικανότητα.

ΚΑΤΕΧΙΝΕΣ

ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΕΣ

ΚΑΡΟΤΕΝΟΕΙΔΗ

Σχήμα 10.26. Χημικές δομές αντιοξειδωτικών ουσιών.

243

10.2.2 Άλλες μέθοδοι προσδιορισμού ελευθέρων ριζών σε βιολογικά συστήματα

Οι ελεύθερες ρίζες λόγω της υψηλής δραστικότητας δίνουν ταχύτατα

διάφορες χαρακτηριστικές αντιδράσεις και τα προϊόντα που δημιουργούνται

μπορούν να ανιχνευθούν ποιοτικά και ποσοτικά. Πολλές από αυτές τις

μεθόδους χρησιμοποιούνται σε βιολογικά συστήματα.

Στις περισσότερες μεθοδολογικές προσεγγίσεις οι ελεύθερες ρίζες λόγω

δραστικότητας προκαλούν μια εμφανή μετατροπή ή προϊόν που ανιχνεύεται

με ευαίσθητες τεχνικές, όπως η HPLC, η UV-VIS, η ηλεκτροχημική, αέρια

χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας(GC-MS), HPLC-MS, χρωματο-

μετρικές , φθορισμομετρία κ.λπ.

(Rice-Evans CA, Diplock AT, SymonS MCR. Techniques in Free Radical Research.

Elsevier, Amsterdam, 1991)

Πίνακας 10.1. Τύπος

αντίδρασης Μέθοδος και βασική

αρχή Ειδικές παρατηρήσεις για τη

μέθοδο Αλλαγή χρώματος (αποχρωματισμός)

Εξουδετέρωση του χρώματος της p-nitroso dimethylaniline(PNDA) Μέθοδος θρυπτοφάνης

PNDA αντιδρά με ΗΟ•και προκαλείται απώλεια κίτρινου χρώματος (VIS 440 nm). Χρησιμοποιείται σε βιολογικά συστήματα. Αντίδραση ΗΟ• με θρυπτοφάνη που παράγει χαρακτηριστικά προϊόντα ή αποχρωματισμό στα 278 nm.

Απόσπαση υδρογόνου (χρωματομετρική)

Μέθοδος δεοξυριβόζης Αντίδραση της ΗΟ• δεοξυ-ριβόζης με άλλους υδατάνθρακες και τα προϊόντα θερμαίνονται με θειοβαρβιτουρικό οξύ (ΤΒΑ) σε χαμηλό pH. Παράγεται χρώμα (στα 532 nm). Πολύ ευαίσθητη μέθοδος για τη δράση ριζών υδροξυλίου.

Αρωματική υδροξυλίωση (προσθήκη

ΗΟ•)

(α) χρωματομετρική (β) HPLC προϊόντων υδροξυλίωσης (γ) βενζοϊκός εστέρας, φθορισμομετρία

Μέτρηση έγχρωμων προϊόντων Ηλεκτροχημική ανίχνευση ειδι-κών προϊόντων 3- και 4-υδροξυ βενζοϊκών εστέ-ρων, φθορίζοντα (407 nm Em, 305 nm Ex).

Βλάβες στις βάσεις του DNA

GC-MS HPLC (αέρια χρωμ / φασματ. μάζας ή Υγρή Χρωμ.Υψηλ. Πίεσης).

ευαίσθητη μέθοδος προσδιο-ρισμού βλαβών από ΗΟ• σε βάσεις του DNA.

244

Οξειδωτικές βλάβες σε πρωτεΐνες

Πρωτεϊνικά καρβονύλια (Α360-930)

Καρβονύλια μπορούν να παραχθούν και από οξείδωση λιπιδίων και νουκλεϊνικών οξέων. Ο σίδηρος παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή τους.

Σχηματισμός αλανίνης Αφυδρογονάση αλανίνης/NAD+ Ex340 / Em450

Τα ερυθρά αιμοσφαίρια δεν μπορούν να συνθέσουν αλανίνη, άρα η παρουσία της δείχνει πρωτεϊνική διάσπαση.

ΤΒΑ-δραστικότητα οξει-δωμένων αμινοξέων

Θειοβαρβιτουρικό οξύ, δραστικότητα Α532, Ex532/Em553

Ορισμένα αμινοξέα παράγουν ΤΒΑRs με την οξείδωσή τους.

Υπεροξείδωση λιπιδίων ανάλυση λιπαρών οξέων

με GLC ή HPLC

απώλεια ακόρεστων λιπαρών οξέων

Πολύ καλή μέθοδος για την εκτίμηση υπεροξείδωσης των λιπιδίων από σύμπλοκα μετάλλων.

Απελευθέρωση ιωδίου Υπεροξείδωση λιπιδίων Τα λιπιδικά υπεροξείδια οξειδώνουν το Ι- και Ι2 που ογκομετρείται με θειοσουλφονι-κά. Χρήσιμη μέθοδος, εφαρμό-ζεται σε εκχυλίσματα βιολογικών δειγμάτων εάν απουσιάζουν άλλες οξειδωτικές ουσίες.

Υπεροξειδάση της γλουτα-θειόνης

(GSHpase)

Υπεροξείδωση λιπιδίων GSHpase αντιδρά με Η2Ο2 και υδροϋπεροξείδια, οξειδώνοντας το GSH σε GSSG. Προσθήκη της ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης + NADPH για αναγωγή της GSSG σε GSH. Κατανάλωση της NADPH σχετίζεται με την περιεκτικότητα σε υπεροξείδια. Υψηλή θερμοκρασία.

GLC/ Φασματογράφος μάζας

Φθορισμομετρία

Υπεροξείδωση λιπιδίων/αλδεϋδών Αλδεϋδες

Εκχύλιση, αναγωγή (βοροϋδρί-δια) σε αλκοόλες, διαχωρισμός με GLC, προσδιορισμός με φασματ. Μάζας. Αλδεϋδες, όπως η μαλδοδι-αλδεϋδη, αντιδρούν με την αμινο ομάδα σχηματίζοντας βάσεις Schiff. Φθορισμομετρικός προ-σδιορισμός.

Test Θειοβαρβιτουρικού oξέος (ΤΒΑ)

ΤΒΑ- δραστικές ενώσεις (ΤΒΑRS)

Το υλικό θερμαίνεται σε χαμηλό pH με θειοβαρβιτουρικό οξύ με αποτέλεσμα να σχηματίζεται ροδόχρουν χρωμοφόρο που μετράται σε απορρόφηση ~532 nm ή φθορισμομετρικά σε 553nm.

245

10.3. Φωτοχημική διάσπαση οργανικών ρύπων σε υδατικά

συστήματα. Μεθοδολογία της μελέτης μηχανισμών φωτο-διάσπασης

μέσω ελευθέρων ριζών.

Μεγάλη ανησυχία προκαλούν οι αυξανόμενες ποσότητες επικίνδυνων

υλικών που αποτίθενται στο υδάτινο περιβάλλον, με αποτέλεσμα αυτό να

υφίσταται ρύπανση από οργανικές ενώσεις που είναι τοξικές ή που

βιοσυσσωρεύονται στους βιολογικούς οργανισμούς του υδάτινου

περιβάλλοντος.1

Η μεγάλη ποικιλία των επικίνδυνων ουσιών όσον αφορά την χημική

τους σύσταση, αποκλείει τη χρήση μιας συνολικής μεθόδου για τη διαχείριση

των ουσιών αυτών και οδήγησε στη δημιουργία και ανάπτυξη ειδικών

μεθόδων για την απορρύπανση των υδάτων.2,3 Κατά συνέπεια χημικές

μέθοδοι διαχείρισης των υδάτων γνωστές ως Εξελιγμένες Μέθοδοι Οξείδωσης

(Advanced Oxidation Processes, AOPs) αναπτύχθηκαν με τη χρήση

μεθοδολογιών οξειδωτικής διάσπασης, κατάλυσης και φωτοχημικής

διάσπασης.4,5 Οι εξελιγμένες αυτές μέθοδοι οξείδωσης προσελκύουν την

προσοχή των επιστημόνων τις τελευταίες δεκαετίες και η εφαρμοσιμότητά

τους έχει επαληθευτεί με την βοήθεια ορισμένων ρύπων-μοντέλων.6-8

Μεταξύ των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τη διαχείριση και την

απορρύπανση των υδάτων είναι η φωτοδιάσπαση χρησιμοποιώντας

συστήματα, UV/TiO2 και UV/H2O2/Fe2+.9-11 Επίσης, συστήματα που

βασίζονται στη χρήση όζοντος, οδηγούν στην παραγωγή ριζικών ενδιάμεσων

(ιδίως ρίζες υδροξυλίου οι οποίες είναι εξαιρετικά δραστικές και αντιδρούν με

τις περισσότερες οργανικές ενώσεις).12 Ο συνδυασμός Ο3/Η2Ο2 είναι η

ευρύτερα εφαρμοσμένη ΑΟΡ στη διαχείριση του πόσιμου νερού, ιδιαίτερα για

την αντιμετώπιση των χλωροφαινολών.13

Ανάμεσα στους πιο σημαντικούς ρύπους των υδάτινων συστημάτων

συγκαταλέγονται οι χλωροφαινόλες.14 Οι χλωριωμένες φαινόλες που

βρίσκονται στα υγρά απόβλητα, παράγονται κυρίως από χημικά ενδιάμεσα ή

παραπροϊόντα της βιομηχανίας των πετροχημικών, χαρτοβιομηχανιών,

246

βιομηχανιών πλαστικών, εντομοκτόνων και παρασιτοκτόνων, και από τον

συμβατικό τρόπο απολύμανσης του πόσιμου νερού.15-17 Πρόσφατες εξελίξεις

στον τομέα της οξειδωτικής διάσπασης των χλωροφαινολών με καταλυτικές

και φωτοχημικές μεθόδους έχουν σημειωθεί και δημοσιευτεί.18-22

Είναι γνωστό ότι το όζον, σε μετρίως όξινο περιβάλλον, προσβάλλει τις

οργανικές ενώσεις, τις οδηγεί σε οξείδωση και τελικά σε διάσπαση.23-25 Όταν

το διάλυμα του όζοντος ακτινοβοληθεί με UV ακτινοβολία, η διάσπαση των

ρύπων καθίσταται γρηγορότερη εξαιτίας της παραγωγής ριζών

υδροξυλίου(ΟΗ•).

Στην περίπτωση όπου η ακτινοβολία είναι UVΒ λαμβάνουν χώρα οι

αντιδράσεις:

Ο3 + Η2Ο + hv → H2O2 + O2 (1)

H2O2 + hv → 2HO• (2)

ενώ με ακτινοβολία UVΑ το όζον αντιδρά απευθείας με H2O2 και παράγει

HO•:

H2O2 + Ο3 → HO• + HO2• + O2 (3)

Στο κλασσικό σύστημα Fenton τα ιόντα σιδήρου καταλύουν την

παραγωγή ριζών υδροξυλίου παρουσία του H2O2 :26

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO• + HO ― (4)

Ο οξειδωμένος σίδηρος Fe3+ που προκύπτει μπορεί στη συνέχεια να αναχθεί:

Fe3+ + H2O2 + hv → Fe2+ + HO• + Η+ (5)

Κατά την οξείδωση με υπεροξείδιο του υδρογόνου, η UVΑ

ακτινοβολία σπάει αργά τον υπεροξειδικό δεσμό παράγοντας δύο ρίζες

υδροξυλίου, όπως στην αντίδραση (2).

Η ρίζα υδροξυλίου έχει πολύ μικρό χρόνο ζωής και είναι εξαιρετικά

δραστική απέναντι στις οργανικές ενώσεις, με αποτέλεσμα να προσβάλλει μια

247

οργανική ένωση αποσπώντας της ένα άτομο υδρογόνου και παράγοντας μια

οργανική ρίζα (R•). H ρίζα αυτή μπορεί να αντιδράσει περαιτέρω με H2O2 :

RH + HO• → R• + Η2Ο (6)

R• + H2O2 → ROH + HO• (7)

Η παραγωγή ριζών υδροξυλίου οδηγεί στην έναρξή αλυσωτών αντιδράσεων

που οδηγούν στην οξείδωση των οργανικών ενώσεων. Η καταλυτική οξείδωση

των οργανικών ενώσεων οδηγεί στο σχηματισμό ολικώς ή μερικώς

οξειδωμένων προϊόντων, όπως κετόνες, οξέα και αλκοόλες που γενικά είναι

λιγότερο τοξικά και περισσότερο βιοδιασπάσιμα σε σχέση με τις αρχικές

ενώσεις.27 Σημαντικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι φωτοχημικές αντιδράσεις

στην στρατόσφαιρα μέσω ελευθέρων ριζών.28

10.4. Βιβλιογραφία 1. Neilson AH, Allard AS, Hynning PA, Remberger M. A strategy for evaluating organic

compounds in the aquatic environment. Environ Sci Technol, 28: 278A-288A, 1994.

2. Ramalho RS. Introduction to wastewater treatment processes, Academic Press, New

York, 1983.

3. Legrini O, Oliveros E, Braun AM. Photochemical processes for water treatment. Chem

Rev, 93: 671-680, 1993.

4. Ollis DF, Al-Ekabi H, EDS. Photocatalytic purification and treatment of water and air.

Elsevier, New York, 1993.

5. Larson RA, Weber EJ. Reaction mechanisms in environmental organic chemistry. Lewis

Publishers, Boca Raton, FL, 1994.

6. Carey JH. An introduction to advanced oxidation processes (AOP) for destruction of

organics in wastewater. In proceedings: A symposium on advanced oxidation processes

for the treatment of contaminated water and air. Toronto, Canada, Wastewater

Technology Center, Burlington, Canada.

7. Glaze WH, Kang JW, Chapin DH. The chemistry of water treatment processes involving

ozone, hydrogen peroxide and UV-radiation. Ozone Sci Enghg, 9: 335-352, 1987.

8. Halmann MM. Photodegradation of water pollutants. CRC Press, New York, 1996.

248

9. Acher A, Ficher E, Turnheim R, Manor Y. Ecologically friendly wastewater disinfection

techniques. Water Res, 31: 1398-1404, 1997.

10. Casero I, Sicilia D, Rubio S, Perez-Bendito D. Chemical degradation of aromatic amines

by Fenton’s reagent. Water Res, 31: 1985-1995, 1997.

11. Sedlak Dl, Andren AW. Oxidation of chlorobenzene with Fenton’s reagent. Environ Sci

Technol, 25: 777-782, 1991.

12. Haag WR, Yao CCD. Rate constants for reaction of hydroxyl radicals with several

drinking water contaminants. Environ Sci Technol, 26: 10005-1013, 1992.

13. Trapido M, Hirvonen A, Veressinina Y, Hentunen J, Iunder R. Ozonation, ozone/UV and

Vuv/H2O2 degradation of chlorophenols. Ozone Sci Eng, 17: 75-95, 1995.

14. Patterson JW. Industrial wastewater treatment technology, 2nd ed., Butterworth

Publishers, Boston, 1985.

15. Chapman PM, Romberg GP, Vigers CA. Design of monitoring studies for priority

pollutants. J Wat Pollut Control Fed, 54: 292-297, 1982.

16. Exon JH. A review of chlorinated phenols. Vet Hum Toxicol, 26: 508-519, 1984,

17. D’Oliveira JC, Al-Sayyed G, Pichat P. Photodegradation of 2- and 3- chlorophenol in TiO2

aqueous suspensions. Environ Sci Tecnol, 24: 990-996, 1990.

18. Minero C, Pelizzeti E, Pichat P, Sega M, Vincenti M. Formation of condensation products

in advanced oxidation technologies: the photocatalytic degradation of dichlorophenols on

TiO2. Environ Sci Technol, 29: 2226-2234, 1995.

19. Lipczynska-Kochany E, Bolton JR. Flash photolysis/HPLC applications. 2. Direct

photolysis vs hydrogen peroxide mediated photodegradation of 4-chlorophenols as

studied by flash photolysis/HPLC technique. Environ Sci Technol, 26: 259-261, 1992.

20. Lucking F, Koser H, Jank M, Ritter A. Iron powder, graphite and activated carbon as

catalysts for the oxidation of 4-chlorophenol with hydrogen peroxide in aqueous solution.

Water Res, 32: 2607-2614, 1998.

21. Yue B, Zhou Y, Xu J, Wu Z, Zhang X, Zou Y, Jin S. Photocatalytic degradation of aqueous-

chlorophenol by silica-immobilized polyoxometalates. Environ Sci Technolo, 36: 1325-

1329, 2002.

22. Fukushima M, Tatsumi K. Degradation pathways of pentachlorophenol by photo-Fenton

systems in the presence of iron(III), humic acid, and hydrogen peroxide. Environ Sci

Technol, 35: 1771-1778, 2001.

23. Adams C, Scanlan PA, Secrist ND. Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-

dioxane using hydrogen peroxide and ozone. Environ Sci Techn, 28: 1812, 1994.

24. Han SK, Ichikawa K, Utsumi H. Quantitative analysis for the enhancement of hydroxyl

radical generation by phenols during ozonation of water. Water Research, 32: 3261-3266,

1998.

249

25. Camel V, Bermond A. The use of ozone and associated oxidation processes in drinking

water treatment. Water Res, 32: 3208-3222, 1998.

26. Catalkaya EC, Bali U, Sengul F. Photochemical degradation and mineralozation of 4-

chlorophenol. Environ Sci Pollut Res Int, 10 :113-120, 2003.

27. Chu W, Law CK. Treatment of trichlorophenols catalytic oxidation process. Water Res,

37: 2339-2346, 2003.

28. Mouks PS. Gas-Phase radical chemistry in the troposphere. Chem Soc Previews, 34: 376-

395, 2005.

Παράδειγμα 1. Μελέτη της πορείας φωτοδιάσπασης 4-νιτροφαινόλης με

UV κατά την επίδραση ελευθέρων ριζών.

Σχήμα 10.27. Τυπικό διάγραμμα φασματοσκοπίας UV για τη διάσπαση 4-

νιτροφαινόλης με καταλυτική επίδραση ελευθέρων ριζών (παρουσία αιωρήματος ΤiO2

και επίδρασης ορατού φωτός από 0-95 λεπτών).

(Chen D, Ray AK. Photodegradation of 4-nitrophenol in ΤiO2 suspension.

Water Res, 32: 3223-3234, 1998)

250

10.3.1. Μηχανισμοί παραγωγής ελευθέρων ριζών κατά την επίδραση (UV)

ακτινοβολίας σε υδατικό αιώρημα ΤiO2.

O2

O C

O

C

H

HH

Ti

Ti

etr-htr

+

hv

e-

O2

O C

O

C

H

HH

Ti

Ti

>Ti—O2 + H2O ↔ > Ti—OH + HO2•

2HO2• + 2H+ → H2O2 + O2

O2

OH

Ti

Ti

etr-htr

+

hv

e-

O2

OH

Ti

Ti

> Ti—OH• + RCH2R’’ → > Ti—OH2 + RR’’CH•

RR’’CH• + O2 → RR’’CHO2•

RR’’CHO2• + R’H → RR’’CHOOH + R’•

RCHR’’OOH → RR’’C=O + H2O2

(Mills G, Hoffmann MR. Photocatalytic degradation of pentachlorophenol on

TiO2 particles: identification of intermediates and mechanism of reaction.

Environ Sci Technol, 27: 1681-1689, 1993.)

251

Tο Η2Ο2 σχηματίζεται με την ακτινοβολία στις επιφάνειες ΤiO2 με

αναγωγή διοξυγόνου μέσω μεταγωγής ηλεκτρονίων όταν υπάρχει

κατάλληλος δότης ηλεκτρονίων, όπως οξικού εστέρα ή

PCP(πενταχλωροφαινόλη).

Παράδειγμα 2. Φωτοκαταλυτική διάσπαση του φυτοφαρμάκου Alachlor

παρουσία αιωρήματος TiO2 και υπεροξειδίου του υδρογόνου(Η2Ο2).

Σχήμα 10.28. Προτεινόμενοι μηχανισμοί διάσπασης του Alachlor με Η2Ο2 και

φωτοκατάλυση.(Αlachlor: 2-chloro-2’,6’-diethyl-n(methoxymethyl)acetanilide, 2-

χλωρο-2’, 6’-διαιθυλο-n-(μεθοξυμεθυλο) ακετανιλίδιο).

252

Mηχανισμός:

H2O2 + hv → 2HO•

e- + H2O2 → HO• + HO-

H2O2 + HO• → H2O + HO2•

HO2• + HO• → H2O2 + O2

ΤiO2 + hv → ΤiO2 (e- + h+)

h+ + HO-→ HO•

e- + O2 + → O2•

Σχήμα 10.29. Φωτοκαταλυτική διάσπαση του Alachlor σε διάφορες συγκεντρώσεις

H2O2 (0.05-124.0 mmol/L) σε 300 nm και με ΤiO2 (5mg/L) σε pH=6.

(Wong CC, Chu W. The hydrogen peroxide-assisted photocatalytic

degradation of Alachlor in TiO2 suspensions. Environ Sci Technol , 37: 2310-

2316, 2003)

253

Παράδειγμα 3. Καταλυτική διάσπαση της 2,4,6-Τριχλωροφαινόλης με το

σύστημα Fenton (Fe2+/H2O2).

(b)

Σχήμα 10.30. Καμπύλες καταλυτικής διάσπασης της 2,4,6-Τριχλωροφαινόλης με

μίγμα Fe2+/H2O2 σε διάφορες αναλογίες. Στην (α) η συγκέντρωση είναι 0.2.mmol/L και

στη (β) 0.15 mmol/L (FR ration: Fe2+/H2O2).

(Chu W, Law CK. Treatment of trichlorophenol by catalytic oxidation process.

Water Res, 37: 2339-2346, 2003)

254

Παράδειγμα 4. Μηχανισμοί και προϊόντα φωτοδιάσπασης της

πενταχλωροφαινόλης με το σύστημα φωτο- Fenton (Fe2+/H2O2/UV).

Σχήμα 10.31. Πιθανοί μηχανισμοί και προϊόντα (που ανιχνεύονται με HPLC) της

πενταχλωροφαινόλης με το σύστημα φωτο- Fenton.

Σχήμα 10.32. Διάγραμμα της καταλυτικής φωτοδιάσπασης του PCP σε pH 5.0 με

διαφορετικές αναλογίες H2O2 /FeIII , ακτινοβολίας και χουμικού οξέος (ΗΑ).

(Fukushima M, Tatsumi K. Degradation pathwaysof PCP by photo-Fenton systemw

in the pesence of iron( III), humic acid and hydrogen peroxide. Environ Sci Technol,

35: 1771-1778, 2001)