1

Κεφάλαιο 16 Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Πήκτωμα αγαρόζης, στο οποίο έχουν διαχωριστεί με ηλεκτρο- φόριση τμήματα DNA, ενώ εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία.

2

Θέση περιορισμού συμμετρική ως προς τον άξονα που περνά από το μέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρο- μη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση (στο παράδειγμα αυτό είναι 5΄ GAATTC 3΄).

W. Arber, D. Nathans, H. Smith….Nobel Prize 1978.

Περιοριστικά ένζυμα

4

5

6

7

Παραδείγματα του τρόπου με τον οποίο τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA. (α) Η SmaI δημιουργεί λεία άκρα. (β) Η BamHI δημιουργεί προεξέχοντα 5΄ μο- νόκλωνα (κολλώδη) άκρα. (γ) Η PstI δημιουργεί προεξέχοντα 3΄ μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα.

8

Πέψη του DNA από το ένζυμο περιορισμού EcoRI.

Το ένζυμο EcoRI δημιουργεί δύο συμμετρικές εγκοπές που ονομάζονται ασυμπτωτικές. Έτσι προκύπτουν κολλώδη άκρα. Όταν δύο τμήματα DNA προέρχονται από πέψη με το ίδιο ένζυμο, έχουν τα ίδια κολλώδη άκρα και μπορούν να συνδεθούν μέσω ζευγαρώματος των συμπληρωματικών βάσεων. Οι εγκοπές που παραμένουν είναι δυνατόν να κλείσουν με το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών από την DNA λιγάση.

9

Το πλασμίδιο αυτό φέρει μια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), το δείκτη επιλογής ampR και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τμήμα άλφα του γονιδίου της β-γαλακτοζιδάσης, lacZ+.

Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης pUC19.

10

Ένθεση ενός τμήματος DNA στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pUC19 και δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA.

12

Κλωνοποίηση cDNA με τη χρήση συνδετών BamHI.

13

Paul Berg Nobel Prize in Chemistry 1980

14

In 1973, he and Stanley Norman Cohen, a fellow researcher, created the first genetically engineered organism. The pair transferred genes offering antibiotic resistance into a plasmid which was inserted into E.coli. The generations of bacteria that followed were found to be resistant to some antibiotics. It started a revolution in genetic engineering and biotechnology. Herbert Boyer

In 1976, Boyer was contacted by venture capitalist Robert Swanson and they founded the pharmaceutical company Genentech, the first biotechnological company. In August 1978, he produced synthetic insulin using his new transgenic genetically modified bacteria, followed in 1979 by a growth hormone. Herb Boyer a very rich man. According to 'Time' magazine, he was biotech's first ever multimillionaire.

Κλωνοποίηση VIDEO

16

Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτώματος αγαρόζης (δεξιά) και τροφοδοτικό (αριστερά).

Ηλεκτροφόρηση VIDEO

18

20

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

21

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

22

23

VIDEO

Kary Banks Mullis

Nobel Prize in Chemistry, 1993