ΑΣΚΗΣΗ 12ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ... 12.pdf ·...

295

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ

12. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ, ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ

ΑΣΚΗΣΗ 12│ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ, ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΠΡΩΤΟΖΩΟ

TETRAHYMENA THERMOPHILA

Εισαγωγή

Κατάταξη και βιολογικός ρόλος λιπιδίων 1, 2

Τα λιπίδια ορίζονται ως η ετερογενής κατηγορία βιολογικών μορίων που είναι ευδιάλυτα σε μη

πολικούς οργανικούς διαλύτες (όπως βενζόλιο, αιθέρας, χλωροφόρμιο) και δυσδιάλυτα σε πολικούς,

όπως το νερό.

Σύμφωνα με τον βιολογικό τους ρόλο διακρίνονται στις ακόλουθες κατηγορίες:

– Τα τριγλυκερίδια, λίπη και έλαια κυρίως αποθηκεύουν και μεταφέρουν τη μεταβολική ενέρ-

γεια.

– Οι κηροί, υδρογονάνθρακες και λιπαρές αλκοόλες (τα περισσότερα μη πολικά λιπίδια) σχημα-

τίζουν κυρίως προστατευτικές επιφάνειες στους ιστούς φυτών και ζώων (αν και οι κηροί χρησιμεύουν

σε μερικά υδρόβια ζώα αντί των τριγλυκεριδίων για αποθήκευση ενέργειας).

– Η πιο σημαντική ίσως κατηγορία λιπιδίων είναι αυτά που χρησιμεύουν ως δομικά συστατικά

των βιολογικών μεμβρανών (φωσφολιπίδια, γλυκολιπίδια, σφιγγολιπίδια και στερόλες -τα δύο τε-

λευταία δεν υπάρχουν στις βακτηριακές μεμβράνες-). Χαρακτηριστική κοινή τους ιδιότητα είναι το

γεγονός ότι στο ίδιο μόριο περιέχουν μία μη πολική περιοχή, που συνήθως αποτελείται από μία ή

δύο εστεροποιημένες αλυσίδες λιπαρών ακυλομάδων και μία πολική, συνήθως φωσφορική ομάδα

ενωμένη με κάποια βάση (αιθανολαμίνη, χολίνη, σερίνη, γλυκερόλη, ινοσιτόλη, κ.λπ).

– Τέλος, υπάρχει μια μεγάλη κατηγορία λιπιδίων σχετικά μικρού μοριακού βάρους (στεροειδή,

τερπένια, προσταγλανίδες και κινόνες) που παίζουν σπουδαίο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού

296

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


(ορμόνες, βιταμίνες, φωτοπαθείς χρωστικές κ.λπ.).

Διαλυτότητα λιπιδίων

Τα λιπίδια κατά γενικό κανόνα είναι ευδιάλυτα σε οργανικούς διαλύτες και κυρίως σε μίγματα

CHCI3-CH3OH. Πιο συγκεκριμένα:

– Τα ουδέτερα λιπίδια διαλύονται σε αιθέρα, χλωροφόρμιο, ακετόνη, πετρελαϊκό αιθέρα κλπ,

ενώ είναι δυσδιάλυτα σε μεθανόλη και αιθανόλη (κυρίως τα τριγλυκερίδια). Εξαίρεση αποτελούν τα

σχετικά πολικότερα ουδέτερα λιπίδια, όπως διγλυκερίδια, μονογλυκερίδια, λιπαρές αλκοόλες, χολη-

στερόλη, που διαλύονται σε μεθανόλη και αιθανόλη.

– Τα φωσφολιπίδια (PL) διαλύονται σε χλωροφόρμιο, ψυχρή αιθανόλη, μίγματά τους σε αιθέρα

κλπ., ενώ είναι αδιάλυτα δυσδιάλυτα σε ακετόνη. Η ιδιότητα μάλιστα αυτή χρησιμοποιήθηκε πολύ

παλαιότερα για την απομόνωσή τους (παλιότερα).

– Τα γλυκολιπίδια διαλύονται σε οξεικό αιθυλεστέρα, πυριδίνη και είναι λίγο διαλυτά σε αιθέρα,

ακετόνη και σε υδατικά διαλύματα 0.9% KCl.

– Τέλος, τα σφιγγοσινούχα διαλύονται σε θερμό αιθέρα, χλωροφόρμιο, οξεικό οξύ, θερμή πυρι-

δίνη κ.λπ., ενώ είναι δυσδιάλυτα σε ακετόνη και σε ψυχρό αιθέρα, αλκοόλη και πυριδίνη.

Απομόνωση λιπιδίων

Τα λιπίδια είναι εξ ορισμού υδρόφοβα μόρια, ως εκ τούτου εκχυλίζονται από τα κύτταρα και

τους ιστούς με μίγματα μη-πολικών διαλυτών.

Η ευαισθησία των μορίων, κυρίως στην οξείδωση από τον ατμοσφαιρικό αέρα, επιβάλλει προ-

σοχή κατά την απομόνωσή τους, εξασφάλιση αδρανών συνθηκών (οι εξατμίσεις γίνονται σε ρεύμα

αζώτου), χαμηλές θερμοκρασίες κατά τον χειρισμό (μέχρι 40οC) και σε περίπτωση διατήρησης/απο-

θήκευσης επί μακρόν στους -20° ή -80° C, προσθήκη αντιοξειδωτικών στο διάλυμα, όπως βουτυλο-υ-

δροξυ-τολουόλιο (ΒΗΤ).

Κατά την εκχύλιση των λιπιδίων από ιστούς πρέπει να λαμβάνονται υπ’ όψιν από τον αναλυτή

τα παρακάτω δεδομένα, τα οποία πιθανώς να οδηγήσουν σε μη αναπαραγώγιμα αποτελέσματα ή

θέτουν περιορισμούς στην ανάλυση:

• Τα λιπίδια βρίσκονται συχνά δεσμευμένα με πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Για να διασπαστούν

τα σύμπλοκα αυτά, απαιτούνται πολλές φορές δραστικές συνθήκες που μπορεί να επηρεάσουν την

ακεραιότητα των λιπιδικών μορίων.

• Τα μίγματα λιπιδίων έχουν την ικανότητα να μεταφέρουν μη λιπιδικές ενώσεις στους οργανικούς

διαλύτες (με ιοντικές αλληλεπιδράσεις), που ανακτώνται στα εκχυλίσματα (π.χ. αμινοξέα, σάκχαρα,

ανόργανα άλατα κ.λπ.).

297

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


• Τα φωσφολιπίδια συχνά περιέχουν ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων που αυτοξειδώνο-

νται εύκολα με την παρουσία αλάτων Cu2+ ή Fe3+. Έτσι, πολλές φορές η εκχύλιση πρέπει να γίνεται σε

ατμόσφαιρα αζώτου, με διαλύτες ελεύθερους υπεροξειδίων ή παρουσία αντιοξειδωτικών.

• Η υγρασία των ιστών συχνά έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό γαλακτωμάτων κατά την εκχύλι-

ση, οπότε πρέπει να προηγηθεί αφυδάτωση του ιστού. Αυτό όμως πολλές φορές έχει ως αποτέλεσμα

την μη αντιστρεπτή σύνδεση λιπιδίων με συστατικά του ιστού και και τη χαμηλή απόδοση κατά την

εκχύλιση.

• Οι διαλύτες έχουν διαφορετική εκχυλιστική ικανότητα για διαφορετικές κατηγορίες λιπιδίων. Έτσι,

συχνά απαιτείται σειρά διαλυτών ή μίγματα για την ποσοτική εκχύλιση όλων των λιπιδικών συστατι-

κών.

• Λιπολυτικά ένζυμα (λιπάσες και φωσφολιπάσες), που μπορεί να ενεργοποιηθούν από οργανικούς

διαλύτες, οδηγεί σε απομόνωση παραγώγων διάσπασης και όχι των αρχικών λιπιδικών μορίων. Ο

βαθμός ενεργοποίησης αυξάνει με τη θέρμανση.

Για τους παραπάνω λόγους, δεν μία υπάρχει μία μέθοδος εκχύλισης απόλυτα ικανοποιητική για

κάθε είδος ιστού. Γενικά, πάντως, θεωρείται ότι τα μίγματα χλωροφορμίου-μεθανόλης δίνουν τα πιο

ικανοποιητικά και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, σύμφωνα με τις μεθόδους των Bligh-Dyer 3, των

Folch-Lees-Sloane-Stanley 4 ή τροποποιήσεις τους.

Διαχωρισμός λιπιδίων

Παλαιότερα, ο διαχωρισμός στηριζόταν σε διαφορικές κλασματώσεις των ολικών λιπιδίων μετά

από κατανομή σε μίγματα οργανικών διαλυτών διαφορετικής πολικότητας. Η διαδικασία αυτή δεν

εξασφάλιζε καθαρά κλάσματα λιπιδίων, οι δε περιβαλλοντικές συνθήκες, ιδιαίτερα η θερμοκρασία,

μπορούσε να επηρεάσει τα αποτελέσματα. Πρέπει να σημειωθεί ότι ακόμα και η ποιοτική και ποσο-

τική παρουσία άλλων λιπιδίων είναι πιθανό να επηρεάσει τα αποτελέσματα της κλασμάτωσης, μετα-

βάλλοντας επιλεκτικά την διαλυτότητα και την κατανομή των λιπιδίων.

Διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές αποτελούν μεθόδους επιλογής για τον διαχωρισμό των

λιπιδίων (βλ.5 για γενικότερη μελέτη στη θεωρία και αρχές της χρωματογραφίας και 6 για τις οδηγίες

ορολογίας κατά IUPAC). Ο διαχωρισμός των λιπιδίων σε τάξεις (βλ. φωσφολιπίδια, Κεφάλαιο 2.1)

μπορεί να γίνει με χρωματογραφία στήλης. Για μίγματα ουδετέρων και πολικών λιπιδίων χρησιμο-

ποιούνται στήλες από πυριτικό οξύ ή Florisil και ως εκλουστικά μέσα, διαλύτες συνεχώς αυξανόμενης

πολικότητας 7. Για τα πολικά λιπίδια χρησιμοποιούνται επίσης ιοντανταλλακτικές στήλες DEAE ή ΤΕΑ-

Ε-κυτταρίνης 8,9. Με λιπόφιλη Sephadex (LH-20) 10 μπορούμε επίσης να διαχωρίσουμε μεγάλες τάξεις

λιπιδίων.

Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (thin layer chromatography, TLC), η αεριοχρωματογραφία

298

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


(gas-liquid chromatography, GLC) και η χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) αποτελούν τρεις πολύ

ευαίσθητες και αποτελεσματικές μεθόδους επιλογής για τον διαχωρισμό των λιπιδίων σε αναλυτική

κλίμακα.

Η TLC, που χρησιμοποιείται στην άσκηση, είναι χρωματογραφία προσρόφησης. Για τον διαχω-

ρισμό λιπιδίων χρησιμοποιείται συνήθως ως στατική φάση πυριτικό οξύ, ισχυρά πολικό υλικό, που

αποτελεί και το προσροφητικό μέσο. Για το σύστημα ανάπτυξης χρησιμοποιούνται μίγματα λιγότερο

πολικών διαλυτών, η συνολική πολικότητα των οποίων υπολογίζεται από ειδικούς καταλόγους με

τους δείκτες πολικότητας και αναμιξιμότητας (polarity and miscibility index) (βλ. Παράρτημα Άσκησης

12). Ο διαχωρισμός εξαρτάται από την πολικότητα των ενώσεων του προς ανάλυση μίγματος. Οι πιο

πολικές (φωσφολιπίδια) προσροφώνται ισχυρότερα στο προσροφητικό μέσο και κατά συνέπεια θα

μετατοπισθούν σε μικρότερο Rf σε σχέση με τις λιγότερο πολικές ενώσεις, όπως είναι, μεταξύ άλλων,

τα τρι-, δι- και μονο-γλυκερίδια, στερόλες, λιπαρά οξέα, λιπαρές αλκοόλες. Η ανάλυση συνδυάζει τα-

χύτητα, ευαισθησία και ικανοποιητική διαχωριστική ικανότητα.

Η εμφάνιση των λιπιδίων γίνεται ή με γενικά αντιδραστήρια εμφάνισης (π.χ. ατμοί ιωδίου, υδα-

τικό διάλυμα 0.0012% ροδαμίνης-G και εμφάνιση σε λάμπα UV) ή με ειδικά αντιδραστήρια που εμ-

φανίζουν χαρακτηριστικές ομάδες (π.χ. αντιδραστήριο νινυδρίνης για εμφάνιση ελεύθερης αμινομά-

δας (Σχήμα 12.1), κυανούν του μολυβδαινίου για εμφάνιση -ΡΟ43-, αντιδραστήριο Schiff για εμφάνιση

πλασμαλογόνων 9, 10 κ.λπ).

Με την χρωματογραφία αέριας φάσης (gas-liquid chromatography, GLC) διαχωρίζονται λιπίδια

Σχήμα 12.1 Έγχρωμη αντίδραση νινυδρίνης με ελεύθερη αμινομάδα.

299

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


όπως υδρογονάνθρακες, λιπαρές αλκοόλες, λιπαρά οξέα και εστέρες τους, στερόλες, κλπ. Η μέθοδος

βασίζεται στην κατανομή των συστατικών του ατμοποιημένου μίγματος μεταξύ μιας κινητής, αδρα-

νούς αέριας φάσης (ήλιο ή άζωτο) και μιας στατικής μη πτητικής υγρής φάσης, προσροφημένης σε

ένα αδρανές υπόστρωμα. Στο εμπόριο υπάρχει μεγάλη ποικιλία πληρωτικών υλικών για τις στήλες

της χρωματογραφίας αέριας φάσης. Υπάρχει επίσης ποικιλία ανιχνευτών, με διαφορετική ευαισθη-

σία και εξειδίκευση, οπότε η δυνατότητα επιλογής είναι μεγάλη. Συνήθως, σε αναλύσεις λιπιδίων,

χρησιμοποιείται ανιχνευτής φλόγας ιοντισμού (FID), ή συνδυασμός με φασματόμετρο μάζας (GC-

MS). Περιορισμός της μεθόδου είναι ότι τα αναλυόμενα μόρια πρέπει να είναι σχετικά πτητικά τα ίδια

ή παράγωγά τους και σχετικά σταθερά στις θερμοκρασίες ανάλυσης.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή υψηλής απόδοσης (high pressure/performance liquid

chromatography, HPLC), βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην ανάλυση ουδέτερων και πολικών λιπιδίων.

Η αρχή λειτουργίας της είναι η ίδια με την απλή χρωματογραφία στήλης, με τη διαφορά ότι διαχω-

ρισμοί γίνονται υπό πίεση. Τα πλεονεκτήματά της είναι η μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, ο μικρός

χρόνος ανάλυσης και οι ιδιαίτερα οι ήπιες συνθήκες ανάλυσης, σε συνδυασμό με την ευαισθησία

και αναπαραγωγιμότητα. Πέραν αυτών, η μέθοδος προσφέρει δυνατότητα ανάλυσης μεγάλων πο-

σοτήτων με χρήση ειδικών διατάξεων παρασκευαστικής κλίμακας. Πρέπει όμως να σημειωθεί ότι η

τεχνική αυτή δεν μπορεί να υποκαταστήσει την TLC, χρησιμοποιείται όμως συμπληρωματικά, με πολύ

καλά αποτελέσματα.

Συνήθως, στην ανάλυση λιπιδίων χρησιμοποιούμε αρχικά HPLC κανονικής φάσης (normal phase

HPLC), στην οποία το πληρωτικό υλικό της στήλης είναι πιο πολικό από τους διαλύτες έκλουσης και

είναι συνήθως υλικά που βασίζονται στο πυριτικό οξύ. Έτσι διαχωρίζονται τα λιπίδια σε τάξεις. Με την

HPLC ανάστροφης φάσης (reversed phase HPLC), στην οποία το πληρωτικό υλικό είναι λιγότερο πο-

λικό από τους διαλύτες, διαχωρίζονται τα μοριακά είδη κάθε τάξης λιπιδίων, δηλαδή διαχωρίζονται

τα μόρια ανάλογα με το είδος λιπαρών αλυσίδων που περιέχουν. Το πληρωτικό οξύ συνήθως είναι

πυριτικό οξύ ομοιοπολικά συνδεδεμένο με λιπαρές αλυσίδες με 8 ή 18 άτομα άνθρακα (C8 ή C18,

αντίστοιχα) i.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Α. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ BLIGH-DYER

Σε γυάλινηii φιάλη αναμιγνύουμε 10mL υδατικού εναιωρήματος κυττάρων Tetrahymena

i Χρήσιμες, ακριβείς και εξειδικευμένες πληροφορίες για τις ιδιότητες και εφαρμογές των πληρωτικών υλικών μπορεί ο αναλυτής να βρει σε ενημερωτικά φυλλάδια εταιρειών που παρασκευάζουν στήλες για HPLC.ii ΠΡΟΣΟΧΗ: κατά τις εκχυλίσεις χρησιμοποιούμε αποκλειστικά γυάλινα σκεύη για αποφυγή ρύπανσης του δείγματός μας

300

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


thermophila, της οποία γνωρίζουμε τον συνολικό αριθμό κυττάρων (περίπου 5x106 κύτταρα συνολι-

κά), με τριπλάσιο όγκο χλωροφορμίου-μεθανόλης (1:2, v/v). Αναδεύουμε περιοδικά για 10min και

προσθέτουμε σταδιακά ένα όγκο (10mL) χλωροφορμίου και μετά από ισχυρή ανάδευση ένα όγκο

(10mL) νερού.

Το διφασικό σύστημα διηθείται υπό κενό από ηθμό πορώδους πορσελάνης στον οποίο έχει το-

ποθετηθεί ομοιόμορφα στρώμα πάχους 2-3mm σελίτη (celite), γνωστού και ως γη διατόμων iii. Ο

ηθμός κατεργάζεται με 10mL CHCI3 για ποσοτική ανάκτηση του υπολείμματος. Η τελική αναλογία

διαλυτών είναι CHCI3-CH3OH-H2O (3:2:2, v/v/v).

Τα ενωμένα διηθήματα μεταφέρονται προσεκτικά από την φιάλη κενού σε διαχωριστική χοάνη

και παραμένουν για εξισορρόπηση και διαχωρισμό των δύο φάσεων, χωρίς ανατάραξη.

Παραλαμβάνουμε τη χλωροφορμική φάση (κατώτερη), μετράμε τον όγκο της με ογκομετρικό

κύλινδρο και καταγράφουμε την ένδειξη. Η φάση αυτή περιέχει τα ολικά λιπίδια.

Tο χλωροφορμικό εκχύλισμα χρησιμοποιείται για τις παρακάτω αναλύσεις

– Διαχωρισμό λιπιδίων με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας

– Ποσοτικό προσδιορισμό φωσφολιπιδίων (χλωροφορμικού εκχυλίσματος ολικών λιπιδίων και

προσροφημένων στην πλάκα TLC)

Το υπόλοιπο φυλάσσεται σε γυάλινο βιδωτό δοκιμαστικό σωλήνα, στους -20°C, σε ατμόσφαι-

ρα αζώτου.

Β. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ (THIN LAYER

CHROMATOGRAPHY, TLC)

Διπλά δείγματα του 1mL μεταφέρονται σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες και εξατμίζονται

μέχρι ξηρού σε ατμόσφαιρα αζώτου. Το υπόλειμμα επαναδιαλύεται με περίπου 4 σταγόνες χλωρο-

φορμίου και τοποθετείται ποσοτικά σε μία λωρίδα της πλάκας, με μορφή γραμμής. Στις δύο ακραίες

λωρίδες τοποθετούνται πρότυπες ενώσεις φωσφατιδυλαιθανολαμίνης και φωσφατιδυλοχολίνης ή

εκχύλισμα αυγού, που περιέχει κυρίως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη και φωσφατιδυλοχολίνη. Η πλάκα

αφήνεται να αναπτυχθεί για μία ώρα σε ερμητικά κλειστό θάλαμο χρωματογραφίας κορεσμένο με

μίγμα CHCI3:CH3OH:H2O (65:25:4, v/v/v).

• Μετά το τέλος της χρωματογραφίας σημειώνουμε με μολύβι το μέτωπο του διαλύτη και η πλάκα

στεγνώνεται (σε απαγωγό εστία, με ρεύμα ζεστού αέρα).

• Στη συνέχεια η πλάκα εμφανίζεται σε ατμούς ιωδίου για 2min (σημειώνουμε τις κηλίδες που εμ-με εκχυλίσματα πλαστικού. iii Η γη διατόμων είναι απολιθώματα πυριτικής φύσεως, με μικρά ποσοστά προσμίξεων από άλλα οξειδία, όπως αργιλί-ου και σιδήρου. Τα διάτομα είναι ειδικού τύπου άλγες.

301

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


φανίζονται με χρώμα κίτρινο). Μετράμε τα Rf iv 14 (Σχήμα 12.2) και αντιστοιχίζουμε τα πρότυπα (PE,

PC) με τις κηλίδες που εμφανίζονται στα δείγματά μας.

• Κατόπιν, ψεκάζουμε με διάλυμα νινυδρίνης και τοποθετούμε την πλάκα σε φούρνο 100οC για

3min. Τα λιπίδια που περιέχουν ελεύθερη αμινομάδα (π.χ. η ΡΕ) εμφανίζονται ροζ, λόγω της χαρα-

κτηριστικής αντίδρασης νινυδρίνης.

• Στη συνέχεια ψεκάζουμε την πλάκα με το διάλυμα εμφάνισης των φωσφολιπιδίων. Μέσα σε

10min, σε θερμοκρασία δωματίου, τα φωσφολιπίδια εμφανίζονται ως σκούρες μπλε κηλίδες.

ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα αντιδραστηρία εμφάνισης έχουν αυξημένη τοξικότητα και απαιτούν χειρισμό σε

απαγωγό και χρήση γαντιών.

Αποτελέσματα

1) Συμπληρώνουμε τον Πίνακα:

Rf Ιώδιο Νινυδρίνη ΦωσφόροςΡΕPC

2) Καταγράφουμε τους όγκους όλων των φάσεων.

3) Καταγράφουμε την τοξικότητα των αντιδραστηρίων εμφάνισης σύμφωνα με τη νομοθεσία της ΕΕ.

iv Στην επίπεδη χρωματογραφία, όπως η TLC, η σύντμηση Rf προκύπτει από τον όρο retardation factor, που μεταφράζεται ως παράγων υστέρησης. Ορίζεται ως ο λόγος της απόστασης που έχει διανύσει μια ένωση στην TLC δια της απόστασης την οποία έχει διανύσει ο διαλύτης ανάπτυξης από την αρχή τοποθέτησης του δείγματος και είναι σταθερή για μία ένωση σε συγκεκριμένες συνθήκες ανάπτυξης.

Σχήμα 12.2 Υπολογισμός του παράγοντα υστέρησης Rf (retardation factor) στην χρωματογραφία λεπτής στιβάδας και γενικότερα στην επίπεδη χρωματογραφία (planar chromatography)..

302

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


Γ. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ

Αρχή της μεθόδου 12

Ο φωτομετρικός προσδιορισμός λιπιδικού φωσφόρου βασίζεται στη μετατροπή του οργανικού

φωσφόρου σε ανόργανα φωσφορικά ιόντα μετά από καύση, στο σχηματισμό φωσφορομολυβδαινι-

κών με την προσθήκη μολυβδαινικού αμμωνίου και τέλος αναγωγή αυτού προς κυανού του φωσφο-

μολυβδαινίου, με θέρμανση, σε όξινο περιβάλλον. Το μίγμα φωτομετρείται στα 820 nm. Ως αναγωγι-

κό χρησιμοποιείται αμινο-ναφθολο-σουλφονικό οξύ (ANSA).Πειραματικά ακολουθείται το διάγραμμα

του Σχήματος 12.3.

Προετοιμασία δειγμάτων

α) Ολικά λιπίδια

Διπλά δείγματα λιπιδίων περιεκτικότητας 1-5μg φωσφόρου (1mL χλωροφορμικού εκχυλίσμα-

τος) φέρονται προσεκτικά με σιφώνιο ακριβείας σε καθαρούς και στεγνούς δοκιμαστικούς σωλήνες

pyrex. Ο διαλύτης εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε ρεύμα αζώτου.

Σχήμα 12.3 Διάγραμμα ροής χρωματομετρικού προσδιορισμού φωσφολιπιδίων.

303

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


β) Φωσφολιπίδια μετά από ΤLC.

Αποξύνουμε προσεκτικά τις κηλίδες ΡΕ και PC από την ΤLC με ειδικό ξέστρο και τις μεταφέρουμε

σε αντίστοιχους δοκιμαστικούς σωλήνες.

Καύση δειγμάτων

Προσθέτουμε σε όλους τους σωλήνες (α, β) από 0.5mL HClO4 70% και ακολουθεί καύση σε αμμό-

λουτρο 170-180°C, για μία ώρα.

Αντιδραστήρια

1. 70% υπερχλωρικό οξύ

2. 0.4% μολυβδαινικό αμμώνιο: 2.125g μολυβδαινικό αμμώνιο. 4Η2Ο διαλύονται σε απεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 500mL

3. Διάλυμα ANSA: 30g NaHSO3 (ή 28.5g Na2S2O5) και 6g Na2SO3 διαλύονται σε 250mL νερού.

Σ’ αυτό το διάλυμα των θειωδών αλάτων διαλύονται 0.5g, 1,2,4-αμινο-ναφθο-σουλφονικού οξέος

(ANSA). Aν σε 3 ώρες σχηματισθεί ίζημα, διηθείται και διατηρείται σε ψυγείο.

4. Αντιδραστήριο ANSA

Προκύπτει από ανάμιξη 4mL διαλύματος ANSA με 6mL νερό. Παρασκευάζεται πριν από την εκτέλεση

του πειράματος.

5. Πρότυπο διάλυμα φωσφορικών:

Παρασκευάζεται διάλυμα ΚΗ2ΡΟ4 που περιέχει ακριβώς 4μg φωσφόρου/mL ή 1.7575mg KH2PO4 ανά

100mL. To KH2PO4 ξηραίνεται στους 105°C για μια ώρα πριν ζυγιστεί.

Εκτέλεση προσδιορισμού

• Μετά το τέλος της καύσης, τα δείγματα αφήνονται να ψυχθούν και προστίθενται σε όλους τους

σωλήνες από 1mL H2O (συνολικός όγκος 1.5mL).

• Ακολουθεί η διαδικασία των καμπυλών αναφοράς: Σε έξι δοκιμαστικούς σωλήνες προσθέτουμε

από το πρότυπο διάλυμα ΚΗ2ΡΟ4 αντίστοιχα: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 και 1.0mL, συμπληρώνουμε με Η2Ο

μέχρι το 1.0mL, προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα από 0.5mL HClO4 (συνολικός όγκος 1.5mL). Προετοιμά-

ζουμε 2 ίδιες σειρές προτύπων.

• Σε όλους τους σωλήνες προτύπων και δειγμάτων προσθέτουμε από 3mL μολυβδαινικού αμμωνίου

και μετά από ισχυρή ανάδευση 0.5mL αντιδραστηρίου ANSA. Ακολουθεί ανάδευση και θέρμανση σε

υδατόλουτρο 100°C επί 15min ακριβώς.

• Μετά το πέρας της θέρμανσης, οπότε έχει ολοκληρωθεί η αντίδραση, (κριτήριο πλήρους καύσης

είναι ο αποχρωματισμός των δειγμάτων), οι σωλήνες ψύχονται σε λουτρό νερού βρύσης. Τα δείγματα

304

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


χρωματίζονται μπλε, ανάλογα με τη συγκέντρωση σε φωσφορικά. Τα τυφλά δείγματα παραμένουν

χωρίς χρώμα.

• Στη συνέχεια, διαχωρίζουμε (Α) τα δείγματα που δεν περιέχουν πυριτικό οξύ (δείγματα α) και τη

μία πρότυπη σειρά, από τα (Β) δείγματα που περιέχουν πυριτικό οξύ από την πλάκα TLC (δείγματα β)

και τη δεύτερη πρότυπη σειρά.

• Τα (Α) φωτομετρούνται απευθείας στα στα 820nm, μετά από μηδενισμό με το τυφλό των προτύ-

πων.

• Στα (Β) (πρότυπα και δείγματα) προστίθενται 5mL oξεικού αιθυλεστέρα. Μετά από ισχυρή ανά-

δευση των σωλήνων σε κυκλοαναδευτήρα (vortex), το μπλε σύμπλοκο εκχυλίζεται στην οργανική στι-

βάδα. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 780 nm της πάνω φάσης στην οποία έχει εκχυλισθεί ποσοτικά το

μίγμα κυανού του φωσφορομολυβδενίου.

ΠΡΟΣΟΧΗ:

• Οι σωλήνες πρέπει να είναι καθαροί και στεγνοί. Πλένονται σχολαστικά με απορρυπαντικό και

στη συνέχεια με χρωμοθειϊκό οξύ ή 1% νιτρικού οξέος για απομάκρυνση των απορρυπαντικών. Τα

απορρυπαντικά, επειδή περιέχουν φωσφορικά άλατα, αφήνουν στα τοιχώματα ένα λεπτό φιλμ που

περιέχει φωσφόρο που μπορεί να επηρεάσει τις μετρήσεις.

• Μετά την προσθήκη κάθε αντιδραστηρίου αναδεύουμε ισχυρά. Ακολουθεί θέρμανση σε υδατό-

λουτρο 100°C για 15min ακριβώς.

Υπολογισμοί

• Κατασκευάζουμε πίνακες με τα αποτελέσματα της φωτομέτρησης και χαράσσουμε τις καμπύλες

αναφοράς Α820 ή 780, γ φωσφόρου).

• Υπολογίζουμε την περιεκτικότητα του μέσου όρου των 2 δειγμάτων κάθε άγνωστου δείγματος σε

φωσφόρο, με βάση την αντίστοιχη πρότυπη καμπύλη.

305

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


Αντιδραστήρια Τ 1 2 3 4 5ΚΗ2ΡΟ4

(mL)

(μg φωσφόρου)

0

0

0.2

0.8

0.4

1.6

0.6

2.4

0.8

3.2

1.0

4.0Η2Ο (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

HClO4 70% (mL) 0.5

(NH4)6Mo7O24·4H2O (mL) 3.0

ANSA (mL) 0.5

α) Απορρόφηση 820 nm

β) Απορρόφηση 780 nm

Αποτελέσματα

1. Περιεκτικότητα δειγμάτων σε φωσφόρο (μέσοι όροι).

2. Ολική ποσότητα φωσφολιπιδίων (σε mol ή mg φωσφόρου) ανά 106 κύτταρα.

3. Επί τοις εκατό (%) περιεκτικότητα φωσφατιδυλαιθανολαμίνης και φωσφατιδυλοχολίνης στα φω-

σφολιπίδια των κυττάρων του Τ. thermophila.

Βιβλιογραφία

1 Laboratory techniques in biochemistry & Molecular Biology, Volume 3, Part 2, Techniques of lipidology, M. Kates (ed.), 1986, Elsevier Publishing Co, N.Y.

2 Hanahan DJ (1997) A Guide to Phospholipid Chemistry, Oxford University Press.3 Bligh EG, Dyer WJ (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J

Biochem Physiol, 37:911-917.4 Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH (1957) A simple method for the isolation and purification

of total lipides from animal tissues. J Biol Chem, 226(1):497-509.5 Skoog DA, Holler FJ, Crouch SR, Αρχές Ενόργανης Ανάλυσης (μετάφραση 6ης έκδοσης) Μ. Ι.

Καραγιάννης, Κ. Η. Ευσταθίου, 2014, Εκδόσεις Κωσταράκη.6 http://www.iupac.org/publications/pac/1993/pdf/6504x0819.pdf.

Ettre LS (1993) Nomenclature for chromatography, IUPAC Recommendations 1993. Pure Appl Chem, 65(4) pp. 81H72. [International Union of Pure and Applied chemistry , Analytical Chemistry Division, Commission on Chromatography and other Analytical Separations , Commission on Analytical Nomenclature, Nomenclature for Chromatography. Prepared for publication by Ettre LS].

7 Carroll KK (1961) Separation of lipid classes by chromatography on florisil. J Lipid Res, 2:135-141.

http://www.iupac.org/publications/pac/1993/pdf/6504x0819.pdf

306

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ


8 Rouser G, Kritchevsky G, Yamamoto A (1976) Ιn "Liquid chromatographic analysis”, (GV Marinetti GV (ed.) Dekker, NY, 2nd ed, vol 3, p 713.

9 Markham JE, Li J, Cahoon EB, Jaworski JG (2006) Separation and identification of major plant sphingolipid classes from leaves. J Biol Chem, 281:22684 -22694.

10 Downey WK, Keogh MK, Murphy RF (1968) Lipid separation on sephadex LH-20. Biochem J. 110(2):13P–14P.

11 Kresge AJ, Chiang Y (1967) The hydrolysis of ethyl vinyl ether. Part 1. Reaction mechanism. J Chem Soc B, 1967:53–57.

12 Frosolono MF, Rapport MM (1969) Reactivity of plasmalogens: kinetics of acid-catalyzed hydrolysis. J Lipid Res, 10(5):504-506.

13 Bartlett GR (1959) Phosphorus assay in column chromatography. J Biol Chem 274, 466-468, modified by Long C, Staples DA (1961) Chromatographic separation of brain lipids: cerebroside and sulphatide. J Biochem, 78:179-185.

ΑΣΚΗΣΗ 12ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ... 12.pdf ·...

Documents

Transcript of ΑΣΚΗΣΗ 12ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ... 12.pdf ·...