Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο...

41
Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Βιοτεχνολογίας ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αθήνα 2014

Transcript of Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο...

Page 1: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Τμήμα Βιοτεχνολογίας

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Αθήνα

2014

Page 2: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΑΣΚΗΣΗ 1Η : ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ........................................................................................ - 1 -

ΓΕΝΙΚΑ ....................................................................................................................................................... - 1 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ............................................................................................................................ - 4 -

ΑΣΚΗΣΗ 2Η : ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ............................................... - 7 -

ΓΕΝΙΚΑ ....................................................................................................................................................... - 7 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ .......................................................................................................................... - 15 -

ΑΣΚΗΣΗ 3Η: ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ................................................................................................................. - 17 -

ΓΕΝΙΚΑ ..................................................................................................................................................... - 17 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ .......................................................................................................................... - 20 -

ΑΣΚΗΣΗ 4Η: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΑ BRADFORD- 22 -

ΓΕΝΙΚΑ ..................................................................................................................................................... - 22 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ .......................................................................................................................... - 23 -

ΑΣΚΗΣΗ 5Η: ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ........................................................................................................... - 26 -

ΓΕΝΙΚΑ ..................................................................................................................................................... - 26 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ .......................................................................................................................... - 29 -

ΑΣΚΗΣΗ 6Η : ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡHΣΗ ....................................................................................................... - 31 -

ΓΕΝΙΚΑ ..................................................................................................................................................... - 31 -

ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ .......................................................................................................................... - 37 -

Page 3: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 1 -

ΑΣΚΗΣΗ 1η : Παρασκευή Διαλυμάτων

Γενικά

Η πραγματοποίηση των πειραμάτων στο εργαστήριο βιοχημείας απαιτεί τις περισσότερες

φορές την μελέτη των βιομορίων μακριά από το φυσικό τους σύστημα, μέσα σε ένα τεχνητό

περιβάλλον το οποίο δημιουργείται συνήθως σε διαλύματα μέσα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα (in

vitro). Γίνεται λοιπόν φανερό, ότι η όσο το δυνατό ακριβέστερη μελέτη των χαρακτηριστικών των

βιομορίων, απαιτεί την δημιουργία του κατάλληλου περιβάλλοντος, του οποίου οι φυσικοχημικές

ιδιότητες θα είναι οι βέλτιστες για την λειτουργία τους. Στους σημαντικότερους παράγοντες

περιλαμβάνονται η ιονική δύναμη, η τιμή pH, η παρουσία κατάλληλων συγκεντρώσεων από

συνενζυμικούς παράγοντες, μέταλλα κ.τ.λ.. Συνεπώς, η εργασία στο εργαστήριο βιοχημείας απαιτεί

καλές γνώσεις σχετικά με την παρασκευή διαλυμάτων. Οι βασικές αρχές που διέπουν την

παρασκευή διαλυμάτων αποτελούν το αντικείμενο της πρώτης εργαστηριακής άσκησης.

Γενικοί ορισμοί:

Μοριακότητα (Molarity, Μ) ορίζεται ως ο αριθμός των γραμμομορίων (mol) της

διαλυμένης ουσίας σε ένα λίτρο διαλύματος.

Μοριακότητα (Μ) = (αριθμός γραμμομορίων της διαλυμένης ουσίας) / (όγκος διαλύματος σε λίτρα)

Γραμμομόριο (mol) = (μάζα ουσίας σε gr) / (μοριακό βάρος της ουσίας Μ.Β.)

Άρα Μ = (γραμμάρια διαλυμένης ουσίας) / Μ.Β. x (όγκος διαλύματος σε λίτρα) (Eξίσωση 1)

Κανονικότητα (Normality, N) ορίζεται ως ο αριθμός των γραμμοϊσοδύναμων της

διαλυμένης ουσίας σε ένα λίτρο διαλύματος.

Κανονικότητα (Ν) = (αριθμός γραμμοϊσοδύναμων διαλυμένης ουσίας) / (όγκος διαλύματος σε

λίτρα) (Eξίσωση 2)

Ως γραμμοϊσοδύναμο ορίζεται η ποσότητα σε γραμμάρια της διαλυμένης ουσίας ίση με το αριθμό

του χημικού ισοδυνάμου της. Το χημικό ισοδύναμο ορίζεται ως το πηλίκο του μοριακού βάρους

της ουσίας δια του αριθμού των υδρογόνων που μπορεί να ελευθερώσει ή να δεσμεύσει το οξύ ή η

βάση αντίστοιχα. Στην περίπτωση αλάτων, το χημικό ισοδύναμο ορίζεται ως το πηλίκο του

μοριακού βάρους της ουσίας δια του αριθμού των υδρογόνων που απελευθερώθηκαν ή έλαβαν

μέρος στην αντίδραση σύνθεσης του, ενώ στην περίπτωση οξειδο-αναγωγικών ενώσεων

Page 4: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 2 -

υπολογίζεται ο αριθμός των ηλεκτρονίων που χάνει ή κερδίζει η ένωση κατά τη διάρκεια της

αντίδρασης οξειδοαναγωγής.

Αραίωση

Η αραίωση διαλυμάτων αποτελεί μια από τις καθημερινές εργασίες στο εργαστήριο

βιοχημείας, καθώς τις περισσότερες φορές τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στις εργαστηριακές

δοκιμές (διαλύματα εργασίας) παρασκευάζονται με την αραίωση και την ανάμιξη πυκνών

διαλυμάτων των επιμέρους ουσιών (μητρικά διαλύματα). Κατά κανόνα οι αραιώσεις διαλυμάτων

πραγματοποιούνται είτε με την προσθήκη νερού, είτε αναμειγνύοντας το μητρικό διάλυμα με ένα

άλλο διάλυμα. Ανεξάρτητα με τον τρόπο αραίωσης, η αρχική ποσότητα της διαλυμένης ουσίας

παραμένει σταθερή ενώ αυξάνεται ο τελικός όγκος του διαλύματος.

Όπως είναι γνωστό η συγκέντρωση (C) της διαλυμένης ουσίας σε ένα διάλυμα δίνεται από τη

σχέση:

C = M / V (Εξίσωση 3)

Όπου, Μ η μάζα της διαλυμένης ουσίας και V o όγκος του διαλύματος.

Καθώς κατά την αραίωση η μάζα της διαλυμένης ουσίας παραμένει σταθερή, η συγκέντρωση της

στο τελικό διάλυμα μετά την αραίωση υπολογίζεται από τη σχέση:

V1 x C1 = V2 x C2 (Εξίσωση 4)

Όπου V1, C1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού διαλύματος και

V2, C2, ο τελικός νέος όγκος και η τελική συγκέντρωση στο διάλυμα μετά την αραίωση.

Κατά την εφαρμογή του τύπου 4, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στη χρησιμοποίηση ίδιων

μονάδων όγκου και συγκέντρωσης και στα δύο σκέλη της εξίσωσης.

Διαλύματα οξέων και άλλων υγρών αντιδραστηρίων

Πολλά οξέα και αντιδραστήρια, παρέχονται στη μορφή διαλυμάτων για τα οποία η

συσκευασία αναφέρει το μοριακό βάρος της ουσίας (ΜΒ), την πυκνότητα του διαλύματος (d) και

την επί τοις εκατό περιεκτικότητα του αντιδραστηρίου (% w/w). Στις περιπτώσεις αυτές, για την

παρασκευή διαλύματος του αντιδραστηρίου συγκεκριμένης μοριακότητας και κανονικότητας

πρέπει πρώτα να υπολογιστεί η μοριακότητα και η κανονικότητα του μητρικού διαλύματος που

διατίθεται στο εμπόριο: Ο τρόπος υπολογισμού δίνεται παρακάτω με τη βοήθεια ενός

παραδείγματος:

Για το υδροχλωρικό οξύ (HCl) γνωρίζουμε ότι διατίθεται στο εμπόριο υπό τη μορφή

διαλύματος περιεκτικότητας 37% (w/w) και πυκνότητας d=1.19 Κg/lt. Επίσης, το ΜΒ του HCl

είναι 36.461.

Page 5: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 3 -

Από τον ορισμό της πυκνότητας προκύπτει ότι:

d = Μ / V => B = V x d (Εξίσωση 5)

Συνεπώς ένα λίτρο διαλύματος HCl έχει μάζα 1000 x 1.19 = 1190 gr

Επειδή η περιεκτικότητα του διαλύματος είναι 37%, η καθαρή μάζα του HCl σε ένα λίτρο

διαλύματος είναι:

mHCl = 1190 x 37% = 440.3 gr

Η Μοριακότητα του διαλύματος υπολογίζεται με βάση τον τύπο 1:

ΜHCl = 440 / (36.461 x 1 lt) = 12.06 mol / lt

Και η Κανονικότητα δίνεται από τον τύπο 2:

ΝHCl = (440 x 1) / (36.461 x 1lt) = 12.06 N

Γνωρίζοντας την κανονικότητα και τη μοριακότητα του μητρικού διαλύματος HCl, μπορούμε να

παρασκευάζουμε οποιοδήποτε διάλυμα του οξέος εφαρμόζοντας την μέθοδο της αραίωσης

(Εξίσωση 4).

Ιονική δύναμη διαλυμάτων ηλεκτρολυτών

Η ιονική δύναμη ενός διαλύματος ισούται με το ημιάθροισμα των συγκεντρώσεων όλων

των ιόντων που βρίσκονται στο διάλυμα πολλαπλασιασμένες επί το τετράγωνο του σθένους του

αντίστοιχου ιόντος.

Ιονική δύναμη = ½ Σi ci zi2 (Εξίσωση 6)

Η ιονική δύναμη δίνει ένα μέτρο του ηλεκτρικού πεδίου του διαλύματος. Στις περιπτώσεις ασθενών

ηλεκτρολυτών θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και ο βαθμός διάστασης.

Ρυθμιστικά διαλύματα

Ο ρόλος των ρυθμιστικών διαλυμάτων στην πραγματοποίηση βιοχημικών δοκιμών είναι

ουσιώδης, καθώς δημιουργούν και διατηρούν την βέλτιστη τιμή του pH για την λειτουργία των υπό

μελέτη βιομορίων. Όπως είναι γνωστό, ρυθμιστικά διαλύματα είναι τα διαλύματα που έχουν την

ιδιότητα να διατηρούν το pH τους σταθερό κατά την προσθήκη μικρών ποσοτήτων οξέων ή

βάσεων. Η ιδιότητα αυτή των ρυθμιστικών διαλυμάτων είναι καθοριστικής σημασίας για την in

vitro μελέτη των βιομορίων, καθώς η πραγματοποίηση των βιοχημικών διεργασιών απαιτεί

περιβάλλον καθορισμένου και σταθερού pH.

Τα ρυθμιστικά διαλύματα είναι μίγματα ασθενών οξέων με τα αντίστοιχα άλατα τους (π.χ.

μίγμα οξικού οξέος με οξικό νάτριο) ή ασθενών βάσεων με τα αντίστοιχα άλατα τους. Η τιμή pH

ενός ρυθμιστικού διαλύματος οξέος με το αντίστοιχο άλας, δίνεται από την εξίσωση των

Henderson-Hasselbalch, η γενική μορφή της οποίας είναι:

Page 6: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 4 -

pH = pKa + log([βάση]/[οξύ]) (Εξίσωση 7)

Όπου, pK είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της σταθεράς διάστασης της του οξέος ή της

βάσης, και [βάση], [οξύ] είναι η συγκέντρωση της ουσίας που παίζει το ρόλο βάσης ή οξέος,

αντίστοιχα.

Στην περίπτωση του ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος/οξικού νατρίου έχουμε:

Σε αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, το οξικό οξύ έχει το ρόλο του ασθενούς οξέως, ενώ το οξικό ανιόν

έχει το ρόλο της βάσης.

Από τη σχέση 7 προκύπτει ότι το pH του ρυθμιστικού διαλύματος είναι συνάρτηση του

λόγου των συγκεντρώσεων [βάση], [οξύ] και όχι των αριθμητικών τους τιμών. Συνεπώς, το pH

παραμένει σταθερό ακόμα και μετά την αραίωση του ρυθμιστικού διαλύματος. Στην περίπτωση

όπου [βάση] = [οξύ], από την εξίσωση 7 προκύπτει ότι :

pH = pKa

Σε αυτή την περιοχή τιμών pH, το ρυθμιστικό διάλυμα έχει την μεγαλύτερη ρυθμιστική ικανότητα.

Στη συνήθη εργαστηριακή πρακτική, τα ρυθμιστικά διαλύματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε

περιοχές pH που βρίσκονται μέχρι μία μονάδα από την τιμή pKa (pH = pKa ± 1).

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια

Στερεό ΝαΟΗ

Ένυδρο στερεό οξικό νάτριο (CH3COONa.3H2O)

Πυκνό οξικό οξύ (CH3COOΗ)

Στερεό NaCl

Εξοπλισμός

Πιπέτες γυάλινες

Ποτήρι ζέσεως

Μαγνητικός αναδευτήρας

Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας

Page 7: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 5 -

Πειραματική διαδικασία

Α) Παρασκευή διαλυμάτων 10 mM και 10 μΜ NaCl

1) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 10 mM ΝaCl (MBNaCl=58.44)

Για την παρασκευή 100 ml 10 mM NaCl απαιτούνται:

molNaCl = M x V = 0.01 M x 0.1 lt = 0.001 mol NaCl

Συνεπώς, η ποσότητα στερεού NaCl που θα πρέπει να ζυγίσουμε είναι:

mNaCl = molNaCl x MBNaCl = 0.001 x 58.44 = 0.05844 gr NaCl

Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 10 mM NaCl:

Ζυγίζουμε 0.05844 gr NaCl

Διαλύουμε την ποσότητα του NaCl σε 90 ml απιονισμένο νερό με τη βοήθεια μαγνητικού

αναδευτήρα.

Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml.

2) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 10 μΜ ΝaCl (MBNaCl=58.44)

Αντίστοιχα με το παραπάνω διάλυμα, μπορούμε να υπολογίσουμε ότι για την παρασκευή 100 ml

διαλύματος 10 μΜ NaCl χρειάζεται να ζυγίσουμε 0.00005844 gr NaCl.

Οι ηλεκτρονικοί ζυγοί ακριβείας που συνήθως είναι διαθέσιμοι στο εργαστήριο Βιοχημείας έχουν

ακρίβεια μέχρι τέταρτο δεκαδικό του γραμμαρίου (0.0001). Συνεπώς δεν διαθέτουν την

απαιτούμενη ακρίβεια για τη ζύγιση της παραπάνω ποσότητας. Στις περιπτώσεις αυτές τα

διαλύματα παρασκευάζονται με την αραίωση πυκνότερων μητρικών διαλυμάτων.

Στη συγκεκριμένη περίπτωση ως μητρικό διάλυμα θα χρησιμοποιηθεί το διάλυμα 10 mM NaCl που

παρασκευάστηκε προηγουμένως. Από τον τύπο της αραίωσης (εξίσωση 4) προκύπτει:

V1 x C1 = V2 x C2 V1 = (0.1 lt x 10-5 M) / 10-2 M = 10-4 lt = 0.1 ml

Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 10 μM NaCl:

Αναμιγνύουμε 0.1 ml μητρικού διαλύματος 10 mM NaCl και 90 ml απιονισμένου νερού.

Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml.

Β) Παρασκευή διαλύματος 1M οξικού οξέος (CH3COOΗ)

1) Παρασκευάστε 100 ml διαλύματος 1Μ οξικού οξέος

Από τη συσκευασία του οξικού οξέος γνωρίζουμε ότι: ΜΒCH3COOH=60.05 και dCH3COOH=1.053

gr/cm3

Για την παρασκευή 100 ml 1 M CH3COOΗ απαιτούνται:

molCH3COOΗ = M x V = 1 M x 0.1 lt = 0.1 mol CH3COOΗ

Page 8: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 1η

- 6 -

Συνεπώς, ο όγκος του πυκνού CH3COOΗ που θα χρησιμοποιηθεί δίνεται από την σχέση:

VCH3COOΗ = (molCH3COOΗ x MBCH3COOΗ) / dCH3COOΗ = (0.1 mol x 60.05) / 1.053 = 5.7 ml

Άρα, για την παρασκευή 100 ml διαλύματος 1 Μ CH3COOΗ:

Αναμιγνύουμε 5.7 ml πυκνού CH3COOΗ με 90 ml απιονισμένο νερό.

Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml.

Γ) Παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος

1) Παρασκευάστε 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.2 Μ pH 5

Δίνονται: MBCH3COONa.3H2O = 136, KCH3COOΗ = 1.74x10-5.

Με την εφαρμογή της εξίσωσης των Henderson-Hasselbalch (εξίσωση 7) μπορούμε να

υπολογίσουμε την αναλογία συγκεντρώσεων [βάση]/[οξύ] ή ([CH3COO-]/[CH3COOH]) (βλέπε

σελ. 4).

pH = pKa + log([CH3COO-]/[CH3COOH])

Η τελική συγκέντρωση του αδιάστατου CH3COOH και των ανιόντων CH3COO- θα πρέπει να είναι

0.2 Μ. Συνεπώς, αν [CH3COO-] = x, τότε [CH3COOΗ] = 0.2-x και

4.5 = 4.77 + log[x/(0.2-x)] x = 0.126

Άρα: [CH3COO-] = 0.126 Μ και [CH3COOH] = 0.074 Μ

Για την παρασκευή 100 ml διαλύματος απαιτούνται:

0.1 lt x 0.126 M = 0.0126 mol CH3COO-

0.1 lt x 0.074 M = 0.0074 mol CH3COOH

Όπως είναι γνωστό η συγκέντρωση του CH3COO- προέρχεται σχεδόν εξ’ ολοκλήρου από τη

διάσταση του CH3COONa. Άρα:

mCH3COONa = molCH3COONa x MBCH3COONa = 1.7 gr

Αντίστοιχα, η συγκέντρωση του CH3COOH προέρχεται σχεδόν εξ’ ολοκλήρου από το αδιάστατο

οξικό οξύ. Άρα

VCH3COOΗ = (molCH3COOΗ x MBCH3COOΗ) / dCH3COOΗ = (0.0074 x 60.05)/1.053 = 0.42 ml

Άρα, για την παρασκευή 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.2Μ pH 5.0:

Ζυγίζουμε 1.7 gr CH3COONa.3H2O.

Διαλύουμε την ποσότητα σε 90 ml απιονισμένο νερό με τη βοήθεια μαγνητικού

αναδευτήρα.

Προσθέτουμε 0.42 ml πυκνό οξικό οξύ.

Συμπληρώνουμε με απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 100 ml.

Page 9: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 7 -

ΑΣΚΗΣΗ 2η : Χρωματογραφικοί Διαχωρισμοί Πρωτεϊνών

Γενικά

Η χρήση χρωματογραφικών μεθόδων για τον διαχωρισμό βιολογικών μιγμάτων στα

επιμέρους συστατικά τους ανάγεται στις αρχές του 20ου αιώνα όταν ο ρώσος βοτανολόγος Mikhail

Tswett χρησιμοποίησε στερεούς προσροφητές για το διαχωρισμό στα συστατικά του διαλύματος

φυτικών χρωστικών. Η νέα μέθοδος ονομάστηκε χρωματογραφία (Chromatography) πιθανότατα

εξαιτίας των έγχρωμων ζωνών που σχηματίζονταν κατά τον διαχωρισμό των συστατικών του

μίγματος κατά την κίνηση του διάμεσω του προσροφητή.

Στις μέρες μας οι σύγχρονες μέθοδοι διαχωρισμού βιολογικών μιγμάτων στηρίζονται σε

πολύ μεγάλο βαθμό στις χρωματογραφικές διαδικασίες. Παρά την ύπαρξη μεγάλου αριθμού

παραλλαγών, όλα τα συστήματα χρωματογραφίας αποτελούνται από τη στατική και την κινητή

φάση. Η κινητή φάση αποτελείται από το βιολογικό μίγμα (πρωτεϊνών ή μεταβολιτών), το οποίο

είναι διαλυμένο σε κάποιο υγρό ή αέριο μέσο. Το διάλυμα που προκύπτει διοχετεύεται διαμέσω

ενός πορώδους υδρόφιλου πολυμερούς (φορέας), στο οποίο φέρεται ακινητοποιημένο κάποιο

μικρό μόριο, πήκτωμα ή στερεό, το οποίο αποτελεί τη στατική φάση. Το σύμπλοκο φορέα και

στατικής φάσης ονομάζεται προσροφητής. Ο διαχωρισμός των συστατικών της κινητής φάσης

επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης των μεμονωμένων μορίων που την αποτελούν με την

στατική φάση. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την κίνηση των μορίων της κινητής

φάσης με διαφορετική ταχύτητα διαμέσω του προσροφητή, η οποία εξαρτάται από τις

φυσικοχημικές ιδιότητες τους. Συνεπώς εάν το βιολογικό μίγμα ξεκινήσει την κίνηση του διαμέσω

του προσροφητή υπό την μορφή στενής ζώνης, οι διαφορικές δυνάμεις συγκράτησης που επιδρούν

σε κάθε συστατικό κατά την διάρκεια της κίνησης του, έχουν ως αποτέλεσμα το διαχωρισμό τους

σε διακριτές ζώνες (Σχήμα 1).

Ο διαχωρισμός των χρωματογραφικών συστημάτων γίνεται με βάση διάφορα

χαρακτηριστικά της στατικής και της κινητής φάσης.

α) Χρωματογραφία στήλης

Ο προσροφητής βρίσκεται πακτωμένος σε μορφή στήλης (Σχήμα 1).

β) Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας

Η στατική φάση επικάθεται σε κατάλληλο στερεό επίπεδο υπόβαθρο, συνήθως πλαστικό,

μεταλλικό ή γυάλινο πλακίδιο.

Page 10: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 8 -

γ) Χρωματογραφία χάρτου

Η στατική φάση σχηματίζεται από ένα φύλλο κυτταρίνης το οποίο εμβαπτίζεται σε

κατάλληλο διαλύτη.

Επιπλέον, τα χρωματογραφικά συστήματα μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με τη φύση

της κινητής και στατικής φάσης. Για παράδειγμα, στην αέρια-υγρή χρωματογραφία η κινητή και

στατική φάση βρίσκονται σε αέρια και υγρή μορφή, αντίστοιχα.

Τέλος τα χρωματογραφικά συστήματα διαχωρίζονται ανάλογα με τη φύση των κυρίαρχων

αλληλεπιδράσεων μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ στατικής

και κινητής φάσης μπορεί να έχει είτε τη μορφή προσρόφησης των μορίων της κινητής φάσης στη

στατική, είτε τη μορφή διαφορικής κατανομής των μορίων που επιθυμούμε να διαχωρίσουμε

μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. Σύμφωνα με αυτό το διαχωρισμό τα κυριότερα είδη

χρωματογραφίας είναι τα ακόλουθα:

Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού συστήματος χρωματογραφίας στήλης.

Page 11: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 9 -

Α) Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής

Ο διαχωρισμός των βιομορίων (πχ. Πρωτεΐνες) κατά τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής

(Ion Exchange Chromatography) γίνεται με βάση το φορτίο τους και βασίζεται στην ανάπτυξη

ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των φορτίων της επιφάνειας των πρωτεϊνών και

φορτισμένων χημικών ομάδων, οι οποίες βρίσκονται ακινητοποιημένες πάνω σε ένα αδρανές

πολυμερές υλικό υπό τη μορφή σφαιριδίων (ιοντοανταλλάκτης). Ανάλογα με το πρόσημο του

φορτίου που φέρουν, οι ιοντοανταλλάκτες διακρίνονται σε: α) ανιοντοανταλλάκτες, οι οποίοι

φέρουν θετικό φορτίο, και β) κατιοντοανταλλάκτες, οι οποίοι φέρουν αρνητικό φορτίο. Οι

συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι ιοντανταλλάκτες αναφέρονται στον Πίνακα 1.

Πίνακας 1: Οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι τύποι ιοντοανταλλακτών

Ονομασία Τύπος Ιονιζόμενη ομάδα Χαρακτηριστικά

Dowex 1

Ισχυρά βασική

ρητίνη

πολυστηρενίου

Χ-CH2N+(CH3)3 Ανιοντοανταλλάκτης

Dowex 50 Ισχυρά όξινη ρητίνη

πολυστηρενίου Χ-SO3

- Κατιονοανταλλάκτης

DEAE-Cellulose Βασικό πολυμερές

κυτταρίνης

Διαιθυλαμινοαιθυλ-

ομάδα

-CH2CH2N+(C2H5)2

Ανιονοανταλλάκτης. Χρησιμοποιείται για το

διαχωρισμό όξινων και ουδέτερων πρωτεϊνών

CM-Cellulose Όξινο πολυμερές

κυτταρίνης

Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα

-CH2COO-

Κατιονοανταλλάκτης

Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό βασικών

και ουδέτερων πρωτεϊνών

P-cellulose Όξινο πολυμερές

κυτταρίνης

Φωσφορική ομάδα

-OPO3H2 Διβασικός κατιονοανταλλάκτης

DEAE-Sephadex Βασικό πολυμερές

δεξτράνης

Διαιθυλαμινοαιθυλ-

ομάδα

-CH2CH2N+(C2H5)2

Ανιονοανταλλάκτης.

Συνδυασμός χρωματογραφίας

ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού

CM-Sephadex Όξινο πολυμερές

δεξτράνης

Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα

-CH2COO-

Κατιονοανταλλάκτης.

Συνδυασμός χρωματογραφίας

ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού

Bio-Gel CM 100 Όξινο πήκτωμα

πολυακρυλαμίδης

Μεθυλοκαρβόξυλ-ομάδα

-CH2COO-

Κατιονοανταλλάκτης.

Συνδυασμός χρωματογραφίας

ιοντοανταλλαγής και μοριακού ηθμού

Page 12: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 10 -

Κατά τη διαδικασία της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής, ιόντα που βρίσκονται

δεσμευμένα στο ιοντοανταλλάκτη αντικαθίστανται κατά αντιστρέψιμο τρόπο από τα φορτισμένα

βιομόρια που βρίσκονται στην κινητή φάση της χρωματογραφίας. Στην περίπτωση

ανιονοανταλλάκτη η διαδικασία αναπαριστάται από την αντίδραση:

R+H- + B- R+B- + A-

Όπου, R+H- ο ανιονοανταλλάκτης και B- το ανιόν που βρίσκεται στην κινητή φάση. Όταν ένα

βιολογικό δείγμα που αποτελείται από φορτισμένα μακρομόρια περάσει μέσα από ένα

ανιονοανταλλάκτη τα αρνητικά φορτισμένα πολυανιόντα δεσμεύονται στον προσροφητή

αφήνοντας τα πολυκατιόντα να περάσουν από τη στήλη. Αντίθετα, ο κατιονοανταλλάκτης δεσμεύει

τα πολυκατιόντα αφήνοντας τα αρνητικά φορτισμένα μόρια να περάσουν από τη στήλη (Σχήμα 2).

Η ισχύς της ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης ενός φορτισμένου βιομορίου σε ένα ιοντοαναλλάκτη

εξαρτάται από το είδος και τη συγκέντρωση των υπολοίπων ιόντων στο διάλυμα, εξαιτίας του

Σχήμα 2: Σχηματική

αναπαράσταση ενός τυπικού

συστήματος χρωματογραφίας

ιοντοανταλλαγής με τη χρήση

κατιοντοανταλλάκτη.

Page 13: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 11 -

ανταγωνισμού μεταξύ των ιόντων για την κατάλληψη των θέσεων του ιοντοανταλλάκτη. Επιπλέον,

η ισχύς της αλληλεπίδρασης των πολυιόντων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το pH του

διαλύματος καθώς η τιμή του καθορίζει το πρόσημο και την απόλυτη τιμή του τελικού φορτίου του.

Για το λόγο αυτό, στην περίπτωση διαχωρισμού πρωτεϊνών είναι απαραίτητη η γνώση του

ισοηλεκτρικού σημείου της πρωτεΐνης που επιθυμούμε να απομονώσουμε έτσι ώστε να γνωρίζουμε

το φορτίο της σε συγκεκριμένες τιμές pH. Από τα παραπάνω γίνεται φανερό ότι οι τιμές της

ιοντικής ισχύος και του pH θα πρέπει να επιλέγονται τέτοιες ώστε η πρωτεΐνη στόχος να

δεσμεύεται στο κατά περίπτωση ιοντοανταλλάκτη. Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη, μπορεί

να γίνει με την διοχέτευση στη στήλη ενός ρυθμιστικού διαλύματος με ιοντική ισχύ και pH τέτοιο

που να μειώνεται η ισχύς της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης στόχου. Φυσικά είναι δυνατό η

πρωτεΐνη στόχος να εκλούεται μαζί με άλλες πρωτεΐνες σε συγκεκριμένες συνθήκες pH και

ιοντικής ισχύος. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής

χρησιμοποιείται συνήθως σε συνδυασμό με άλλες χρωματογραφικές μεθόδους (συγγενείας ή

μοριακού ηθμού).

Β) Χρωματογραφία συγγένειας

Ένα από τα ιδιαιτέρα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών είναι η ικανότητα τους να δεσμεύουν

εκλεκτικά συγκεκριμένα μόρια. Η ιδιότητα αυτή χρησιμοποιείται για την απομόνωση πρωτεϊνών

στόχων από σύνθετα βιολογικά δείγματα με τη μέθοδο της χρωματογραφίας συγγένειας (Affinity

Chromatography). Με βάση την τεχνική αυτή, ένα μόριο το οποίο αναφέρεται ως δεσμευτής

(Ligand), το οποίο έχει την ιδιότητα να δεσμεύεται εκλεκτικά από την πρωτεΐνη στόχο,

ακινητοποιείται ομοιοπολικά σε ένα αδρανές πορώδες πολυμερές το οποίο έχει τη μορφή

σφαιριδίων. Όταν ένα βιολογικό δείγμα περάσει διαμέσω της στήλης του προσροφητή συγγένειας,

η πρωτεΐνη στόχος δεσμεύεται στον ακινητοποιημένο δεσμευτή ενώ τα υπόλοιπα συστατικά του

δείγματος απομακρύνονται από τη στήλη με τη ροή του ρυθμιστικού διαλύματος (Σχήμα 3). Τέλος,

η πρωτεΐνη στόχος εκλούεται από τη στήλη με την αλλαγή του ρυθμιστικού διαλύματος έτσι ώστε

να ασθενήσουν οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μεταξύ της πρωτεΐνης στόχου και του δεσμευτή. Η

έκλουση συνήθως επιτυγχάνεται με κατάλληλη ρύθμιση του pH και της ιοντικής ισχύος του

διαλύματος έκλουσης. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη στόχος μπορεί να απομακρυνθεί από το δεσμευτή

με την προσθήκη ενός μορίου το οποίο αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη στόχο με τρόπο που να

μειώνει την συγγένεια της με το δεσμευτή ή ακόμα και με τη προσθήκη περίσσειας του ίδιου του

δεσμευτή τα μόρια του οποίου θα αντικαταστήσουν τα μόρια του ακινητοποιημένου δεσμευτή στη

θέση αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της τεχνικής είναι ο πολύ

μεγάλος βαθμός εξειδίκευσης που παρουσιάζει σε σύγκριση με τις άλλες χρωματογραφικές

Page 14: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 12 -

Σχήμα 3: Σχηματική αναπαράσταση ενός

τυπικού συστήματος χρωματογραφίας

συγγενείας όπου η έκλουση της πρωτεΐνης

στόχου επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο

διάλυμα έκλουσης περίσσειας μορίων δεσμευτή.

μεθόδους. Αυτό οφείλεται στο ότι η μέθοδος διαχωρισμού βασίζεται σε μοναδικές βιοχημικές

ιδιότητες της πρωτεΐνης στόχου και όχι σε γενικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της.

Γ) Χρωματογραφία μοριακού ηθμού

Στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού (Molecular Sieve Chromatography, Gel Filtration

Chromatography, Size Exclusion Chromatography) ο διαχωρισμός ενός μείγματος πρωτεϊνών

στα συστατικά του γίνεται με βάση το μέγεθος και το σχήμα των επιμέρους πρωτεϊνών. Η στατική

φάση αποτελείται από σφαιρίδια ενός υδρόφιλου πορώδους και αδρανούς πολυμερούς. Οι πόροι

των σφαιριδίων καλύπτουν ένα σχετικά μικρό εύρος μοριακών μεγεθών, το οποίο αποτελεί

σημαντικό κατασκευαστικό χαρακτηριστικό του χρωματογραφικού υλικού. Κατά την κίνηση του

Page 15: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 13 -

βιολογικού δείγματος δια μέσω της στήλης που περιέχει τα παραπάνω σφαιρίδια, οι πρωτεΐνες που

έχουν μέγεθος μεγαλύτερο από το μέγιστο μέγεθος πόρων των σφαιριδίων θα αποκλειστούν από το

εσωτερικό των σφαιριδίων και θα κινηθούν μόνο στον ελεύθερο χώρο μεταξύ των σφαιριδίων.

Συνεπώς, οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες θα κινηθούν γρηγορότερα διαμέσω της στήλης από τις

μικρότερες οι οποίες έχουν την ικανότητα να κινηθούν και στο χώρο του εσωτερικού των

σφαιριδίων. Η μοριακή μάζα του μικρότερου μορίου το οποίο δεν έχει την ικανότητα να εισέλθει

στο εσωτερικό των σφαιριδίων καλείται όριο αποκλεισμού (exclusion limit). Το μέγεθος αυτό

είναι σε κάποιο βαθμό και συνάρτηση του σχήματος της πρωτεΐνης, καθώς επιμήκη μόρια, τα οποία

διαθέτουν μεγαλύτερη ακτίνα ενυδάτωσης, είναι λιγότερο πιθανό να εισέλθουν στο εσωτερικών

των πόρων σε σχέση με σφαιρικά πολυπεπτίδια της ίδιας μοριακής μάζας.

Η συμπεριφορά ενός πολυπεπτιδίου το οποίο κινείται διαμέσω της στήλης είναι δυνατό να

περιγραφεί ποσοτικά. Αν Vx είναι ο όγκος ο οποίος καταλαμβάνεται από τα σφαιρίδια του

Σχήμα 4: Σχηματική αναπαράσταση ενός

τυπικού συστήματος χρωματογραφίας μοριακού

ηθμού όπου η έκλουση των πρωτεϊνών γίνεται

κατά σειρά μεγέθους. Οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες

συλλέγονται στα πρώτα κλάσματα που

συλλέγονται από τη στήλη ενώ οι μικρότερες

πρωτεΐνες συλλέγονται στα μετέπειτα κλάσματα.

Page 16: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 14 -

χρωματογραφικού υλικού και Vo ο ελεύθερος όγκος της στήλης μεταξύ των σφαιριδίων, τότε ο

συνολικό όγκος της στήλης (Vt) δίνεται από τον τύπο:

Vt = Vx + Vo

Συνήθως ισχύει ότι Vo = 35% Vt

Ο όγκος ρυθμιστικού διαλύματος με τον οποίο εκλούεται από τη στήλη μία πρωτείνη καλείται

(όγκος έκλουσης, Ve). Ο ελεύθερος όγκος (Vo) της στήλης υπολογίζεται εύκολα ως ο όγκος του

ρυθμιστικού διαλύματος στον οποίο εκλούονται οι πρωτεΐνες με μοριακή μάζα μεγαλύτερη από το

όριο αποκλεισμού του χρωματογραφικού υλικού. Συνεπώς, η συμπεριφορά μιας πρωτείνης είναι

δυνατό να αποδοθεί από το σχετικό όγκο έκλουσης Ve/Vo, ο οποίος δεν εξαρτάται από το

χρωματογραφικό υλικό που χρησιμοποιείται.

Από τα παραπάνω γίνεται φανερό, ότι για τις πρωτεΐνες η μοριακή μάζα των οποίων είναι

μικρότερη από το όριο αποκλεισμού, ισχύει ο γενικός κανόνας ότι η έκλουση τους από τη στήλη θα

γίνει κατά σειρά μεγέθους, με τις μεγαλύτερες να εκλούονται νωρίτερα από τις μικρότερες. Ο

διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται καθώς το μέγεθος των πόρων των σφαιριδίων ποικίλλει μέσα σε

συγκεκριμένα όρια. Συνεπώς, τα μικρότερα μόρια έχουν τη δυνατότητα να κινηθούν σε μεγαλύτερο

όγκο στο εσωτερικό των σφαιριδίων από τα μεγαλύτερα, με συνέπεια να καθυστερούν να εξέλθουν

από τη στήλη και να εμφανίζουν μεγαλύτερο σχετικό όγκο έκλουσης σε σχέση με τα μεγαλύτερα

(Σχήμα 4).

Εκτός από την εφαρμογή της μεθόδου στον διαχωρισμό μιγμάτων πρωτεϊνών στα

συστατικά τους, η χρωματογραφία μοριακού ηθμού βρίσκει εφαρμογή στον προσδιορισμό της

μοριακής μάζας πρωτεϊνών. Ο προσδιορισμός στηρίζεται στην ύπαρξη γραμμικής σχέσης μεταξύ

του σχετικού όγκου έκλουσης της πρωτεΐνης στόχου και του λογαρίθμου της μοριακής μάζας της.

Για το σκοπό αυτό κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη αναφοράς με τον υπολογισμό του σχετικού

όγκου έκλουσης πολυπεπτιδίων γνωστής μοριακής μάζας, για συγκεκριμένο κάθε φορά

χρωματογραφικό υλικό.

Τα πλέον συνηθισμένα υλικά που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των σφαιριδίων

είναι η δεξτράνη (dextran, μεγάλης μοριακής μάζας πολυμερές της γλυκόζης που παράγεται από

το βακτήριο Leuconostoc mesenteroides), η αγαρόζη (agarose, φυσικό γραμμικό πολυμερές D-

γαλακτόζης και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζης) και το πολυακρυλαμίδιο (polyacrylamide, τεχνητό

πολυμερές ακρυλαμιδίου και N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου). Κάθε χρωματογραφικό υλικό που

διατίθεται στο εμπόριο χαρακτηρίζεται από το μέγεθος των πόρων των σφαιριδίων, μέγεθος που

καθορίζει και το εύρος διαχωρισμού που επιτυγχάνει. Το πορώδες κάθε υλικού αποτελεί

κατασκευαστικό χαρακτηριστικό. Για τα σφαιρίδια δεξτράνης καθορίζεται από τη μοριακή μάζα

και την εισαγωγή ομάδων γλυκερινικού αιθέρα, που συνδέουν υδροξύλια γειτονικών αλυσίδων.

Page 17: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 15 -

Στην περίπτωση του πολυακρυλαμιδίου, το πορώδες των σφαιριδίων ρυθμίζεται από το βαθμό

πολυμερισμού και την περιεκτικότητα σε N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο. Η επιλογή του

κατάλληλου χρωματογραφικού υλικού αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για τον επιτυχή

διαχωρισμό και πρέπει να γίνεται με τρόπο ώστε οι μοριακές μάζες των πρωτεϊνών που επιθυμούμε

να διαχωρίσουμε να βρίσκονται μέσα στο εύρος διαχωρισμού του υλικού. Στον πίνακα 2

αναφέρονται τα πλέον χρησιμοποιούμενα υλικά στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού, καθώς και

το αντίστοιχο εύρος διαχωρισμού.

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια – Βιολογικά υλικά

Εναιώρημα σφαιριδίων χρωματογραφικού υλικού Sephadex G-50.

Υαλοβάμβακας.

Ρυθμιστικό διάλυμα (25 mM HEPES pH 7.0).

Μείγμα πρωτεϊνών.

Εξοπλισμός

Υάλινη στήλη με στένωση στο κάτω άκρο.

Πίνακας 2: Υλικά που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία μοριακού ηθμού

Εμπορική ονομασία Τύπος Εύρος Διαχωρισμού (kDa)

Sephadex G-10 Dextran 0.05 - 0.7

Sephadex G-25 Dextran 1 – 5

Sephadex G-50 Dextran 1 – 30

Sephadex G-75 Dextran 3 – 70

Sephadex G-100 Dextran 4 – 150

Sephadex G-150 Dextran 5 – 400

Sephadex G-200 Dextran 5 – 800

Bio-Gel P-2 Polyacrylamide 0.1 – 1.8

Bio-Gel P-6 Polyacrylamide 1 – 6

Bio-Gel P-10 Polyacrylamide 1.5 – 20

Bio-Gel P-30 Polyacrylamide 2.4 – 40

Bio-Gel P-100 Polyacrylamide 5 – 100

Bio-Gel P-300 Polyacrylamide 60 – 400

Sepharose 6B Agarose 10 – 4000

Sepharose 4B Agarose 60 - 20000

Sepharose 2B Agarose 70 - 40000

Page 18: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 2η

- 16 -

Βάση στήριξης.

Στατώ.

Σωλήνες eppendorf.

Ποτήρι ζέσεως.

Γυάλινες πιπέτες.

Πειραματική διαδικασία

Α) Διαχωρισμός πρωτεϊνών με την μέθοδο της χρωματογραφίας μοριακού ηθμού

Το κάτω μέρος της στήλης φράσσεται με ένα μικρό κομμάτι υαλοβάμβακα.

Η στήλη τοποθετείται στη βάση στήριξης και προστίθεται το εναιώρημα G-50 με την

βοήθεια γυάλινης πιπέτας μέχρι να σχηματιστεί στήλη ύψους 2 cm. Η προσθήκη πρέπει να

γίνεται υπό γωνία ώστε να αποφεύγεται ο εγκλωβισμός φυσαλίδων αέρα στο εσωτερικό της

στήλης.

Η στήλη εξισορροπείται με την προσθήκη 5 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος. Ιδιαίτερη

προσοχή απαιτείται για την αποφυγή του στεγνώματος της στήλης.

Μόλις απομακρυνθεί το ρυθμιστικό διάλυμα από τη στήλη προστίθενται 50 μl δείγματος

πρωτεϊνών στην κορυφή της στήλης.

Μόλις το δείγμα εισέρθει πλήρως στο εσωτερικό της στήλης, αρχίζει η διαδικασία

έκλουσης των πρωτεϊνών με την συνεχή προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος.

Ταυτόχρονα με την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος, συλλέγονται 5 διαδοχικά

κλάσματα έκλουσης των 500 μl από την έξοδο της στήλης, σε σωλήνες eppendorf.

Για τον προσδιορισμό του κλάσματος έκλουσης στο οποίο εντοπίζονται οι πρωτεΐνες

πραγματοποιείται προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα με τη

μέτρηση απορρόφησης στα 280 nm ή τη μέθοδο Bradford (βλέπε Ασκήσεις 3 και 4) και

ανάλυση μέρος του κλάσματος με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτική πηκτή

πολυακρυλαμιδίου.

Page 19: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 3η

- 17 -

ΑΣΚΗΣΗ 3η : Φωτομετρία

Γενικά

Η τεχνική της φωτομετρίας χρησιμοποιείται ευρύτατα στο εργαστήριο Βιοχημείας για τον

ποσοτικό προσδιορισμό ενώσεων βιολογικών μεγαλομορίων. Η ευρύτατη εφαρμογή της μεθόδου

οφείλεται κυρίως στην ταχύτητα, την απλότητα και την ακρίβεια που την χαρακτηρίζουν. Η τεχνική

στηρίζεται στην ιδιότητα ορισμένων ουσιών που βρίσκονται διαλυμένες σε κατάλληλο διαλύτη, να

απορροφούν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (λ). Τα μήκη

κύματος που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν την περιοχή του ορατού (380-700 nm), του

υπεριώδους (200-380 nm) και του εγγύς υπερύθρου (780-900 nm). Η ποσότητα του φωτός που

απορροφάται από μία ουσία στα παραπάνω μήκη κύματος, δίνεται από το φάσμα απορρόφησης

της ουσίας. Το φάσμα απορρόφησης αποτελεί χαρακτηριστικό κάθε ουσίας και καθορίζεται από

την χημική δομή της. Στο σχήμα 1 παρουσιάζεται το φάσμα απορρόφησης της ριβοφλαβίνης. Το

συγκεκριμένο φάσμα απορρόφησης παρουσιάζει ένα μέγιστο στην ορατή περιοχή του φάσματος

(450 nm) και σε αυτό οφείλεται το κίτρινο χρώμα που λαμβάνουν τα διαλύματα της ριβοφλαβίνης.

Τα δύο άλλα μέγιστα που εμφανίζονται στην περιοχή του υπεριώδους (260 και 370 nm) δεν

γίνονται αντιληπτά από το ανθρώπινο μάτι. Η ποσοτική φωτομετρική ανάλυση βασίζεται στον

συνδυασμό των νόμων των Lambert και Beer. Σύμφωνα με τον πρώτο, το ποσοστό του

προσπίπτοντος φωτός που απορροφάται από ένα μέσο, είναι ανεξάρτητο της έντασης του και κάθε

διαδοχική μονάδα στοιβάδας του μέσου απορροφά ίσο κλάσμα φωτός με την προηγούμενη και την

επόμενη. Στη γενικευμένη του μορφή, ο νόμος του Beer αναφέρει ότι η απορρόφηση του φωτός

που διέρχεται από ένα διάλυμα είναι ανάλογη του αριθμού των μορίων της ουσίας που απορροφά

το φως. Από τον συνδυασμό των παραπάνω νόμων προκύπτει το ποσοστό του φωτός που

Σχήμα 1: Φάσμα απορρόφησης της

ριβοφλαβίνης (συγκέντρωση 22 μΜ σε 0.1 Μ

φωσφορικού νατρίου pΗ 7,06 και μήκος

κυψελίδας 1 cm).

Page 20: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 3η

- 18 -

απορροφάται από ένα διάλυμα εξαρτάται από την συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας και το

μήκος της διαδρομής του φωτός μέσα από το διάλυμα. Η μαθηματική έκφραση του νόμου Lambert

και Beer δίνεται από την παρακάτω εξίσωση:

log(Io/I) = A = ε c l (εξίσωση 1)

Όπου: Ιο: η ένταση του προσπίπτοντος στο διάλυμα φωτός

Ι: η ένταση του εξερχόμενου από το διάλυμα φωτός

ε: Συντελεστής μοριακής απόσβεσης της ουσίας. Ο συντελεστής αυτός αποτελεί

χαρακτηριστικό μέγεθος για κάθε ουσία για συγκεκριμένο μήκος κύματος.

c: Συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας.

l: Το μήκος διαδρομής του φωτός για μέσα από το διάλυμα (οπτική διαδρομή).

Ο δεκαδικός λογάριθμος το πηλίκου Io/I καλείτε απορρόφηση (Α, Absorbance), ή οπτική

πυκνότητα (OD, Optical Density).

Από την εξίσωση 1 προκύπτει ότι για δεδομένο μήκος κύματος και σταθερή οπτική

διαδρομή, η απορρόφηση είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος. Με αυτό τον τρόπο,

μετρώντας την απορρόφηση ενός διαλύματος και γνωρίζοντας το συντελεστή μοριακής απόσβεσης

της διαλυμένης ουσίας σε συγκεκριμένο μήκος κύματος, είναι εύκολο να υπολογιστεί η

συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας. Στις περιπτώσεις που δεν είναι γνωστός, ο συντελεστής

μοριακής απόσβεσης μπορεί να υπολογιστεί με την μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων

γνωστής συγκέντρωσης της ουσίας και την κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς. Η μέτρηση

της απορρόφησης γίνεται με τη χρήση εξειδικευμένου οργάνου που ονομάζεται φωτόμετρο. Στο

σχήμα 2 παρουσιάζονται τα βασικά μέρη και το διάγραμμα λειτουργίας ενός τυπικού φωτόμετρου.

Πηγή φωτός: Ως πηγή φωτός χρησιμοποιούνται μία ή περισσότερες λυχνίες οι οποίες είναι

ικανές να εκπέμπουν σταθερή φωτεινή ακτινοβολία σε όλο το εύρος του ηλεκτρομαγνητικού

Σχήμα 2: Φάσμα απορρόφησης της ριβοφλαβίνης (συγκέντρωση 22 μΜ σε 0.1 Μ φωσφορικού νατρίου pΗ 7,06 και μήκος

κυψελίδας 1 cm).

Page 21: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 3η

- 19 -

φάσματος που απαιτείται για την ανάλυση. Για ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού και του εγγύς

υπέρυθρου (340-900 nm) τα περισσότερα όργανα χρησιμοποιούν λυχνίες βολφραμίου

ρυθμιζόμενης σταθερής τάσης. Για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους (200-360 nm)

χρησιμοποιούνται λυχνίες δευτερίου.

Επιλογέας μήκους κύματος (μονοχρωμάτορας): Η φωτομετρία απαιτεί μετρήσεις σε

συγκεκριμένο μήκος κύματος. Για το σκοπό αυτό τα φωτόμετρα φέρουν ένα μηχανισμό ο οποίος

αποτελείται από ένα ή περισσότερα φίλτρα ή πρίσματα, σκοπός του οποίου είναι ο αποκλεισμός της

ακτινοβολίας με μικρότερα και μεγαλύτερα μήκη κύματος από το επιθυμιτό, που παράγονται από

τη φωτεινή πηγή. Το μήκος κύματος που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση τις περισσότερες φορές

ταυτίζεται με το μήκος κύματος στο οποίο η μετρούμενη ουσία παρουσιάζει την μέγιστη

απορρόφηση (λmax). Βέβαια, αυτό δεν είναι πάντα απαραίτητο καθώς ο νόμος του Beer ισχύει για

όλα τα μήκη κύματος στα οποία η μετρούμενη ουσία παρουσιάζει απορρόφηση. Η επιλογή

διαφορετικού μήκους κύματος από το λmax επιβάλλεται στις περιπτώσεις όπου η μέτρηση στο

συγκεκριμένο μήκος κύματος παρεμποδίζεται από την ύπαρξη άλλων ουσιών στο δείγμα ή της

φωτοδιάσπασης της ουσίας στο συγκεκριμένο μήκος κύματος.

Σχισμή (Διάφραγμα, slit): Ο ρόλος της σχισμής είναι η ρύθμιση της έντασης του φωτός

(Io) που εκπέμπεται από το μονοχρωμάτορα, έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την

μέτρηση. Στα απλά όργανα η σχισμή έχει σταθερό εύρος, ενώ τα πλέον προηγμένα όργανα

χρησιμοποιούν μηχανισμό μεταβλητού εύρους.

Δοκιμαστικοί σωλήνες ή Κυψελίδες: Το δείγμα προς μέτρηση τοποθετείται σε ειδικούς

δοκιμαστικούς σωλήνες ή κυψελίδες των οποίων οι διαστάσεις είναι γνωστές, καθώς το μήκος της

οπτικής διαδρομής του φωτός μέσω του δείγματος υπεισέρχεται στο νόμο των Lambert και Beer

(εξίσωση 1). Στις περισσότερες κυψελίδες το μήκος της οπτικής διαδρομής είναι 1 cm χωρίς να

αποκλείονται μικρότερα ή μεγαλύτερα μήκη. Κατασκευάζονται συνήθως από γυαλί ή πλαστικό,

ενώ για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους χρησιμοποιούνται ειδικές χαλαζιακές κυψελίδες.

Ανιχνευτής φωτός (Φωτοπολλαπλασιαστής): Το εξερχόμενο από το δείγμα φως (Ι)

μετριέται από τα φωτόμετρα με τη χρήση φωτοβολταϊκού κυττάρου ή σωλήνα κενού. Στην πρώτη

περίπτωση το φως μετριέται από ένα ευαίσθητο ημιαγωγό (π.χ. σελήνιο) που βρίσκεται ανάμεσα σε

δύο διάφανα μεταλλικά φύλλα και μία πλάκα σιδήρου. Τα φωτόνια που προσπίπτουν δημιουργούν

ροή ηλεκτρονίων από το σελήνιο προς το σίδηρο, δημιουργώντας ρεύμα το οποίο είναι ανάλογο με

την ένταση του φωτός που προσπίπτει. Οι σωλήνες κενού περιλαμβάνουν δύο ηλεκτρόδια μεταξύ

των οποίων δημιουργείται διαφορά δυναμικού. Τα φωτόνια που προσπίπτουν στην κάθοδο

απελευθερώνουν ηλεκτρόνια τα οποία συλλέγονται από την άνοδο δημιουργώντας ρεύμα το οποίο

Page 22: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 3η

- 20 -

είναι και σε αυτή την περίπτωση ανάλογο της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Το παραγόμενο ρεύμα

μετριέται και στις δύο περιπτώσεις από αμπερόμετρο.

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια – Βιολογικά υλικά

Απιονισμένο νερό

Διάλυμα γονιδιωματικού DNA του λ βακτηριοφάγου

Διάλυμα ολικού RNA από φύλλα του φυτού Arabidopsis thaliana

Διάλυμα μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων DNA

Εξοπλισμός

Σωλήνες eppendorf

Μηχανικές ρυθμιζόμενες πιπέτες

Κυψελίδες χαλαζία

Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους

Πειραματική διαδικασία

Α) Προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας λ DNA

10 μλ από το δείγμα γονιδιωματικού DNA του λ βακτηριοφάγου μεταφέρονται σε σωλήνα

eppendorf, όπου και αραιώνονται µε dH2O σε αναλογία 1:100.

Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται

η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε

μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση

απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα DNA.

Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και

πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση του δίκλωνου DNA στο αρχικό δείγμα δίνεται από την

εξίσωση:

CdsDNA (μg/ml) = 50 x OD260 x συντελεστής αραίωσης

όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm.

Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δίκλωνου DNA υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280

και ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα

θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας.

Page 23: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 3η

- 21 -

Β) Προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας ολικού RNA

10 μλ από το δείγµα ολικού RNA από φύλλα του φυτού Arabidopsis thaliana

μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf, όπου και αραιώνονται µε dH2O σε αναλογία 1:100.

Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται

η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε

μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση

απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα RNA.

Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και

πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση του μονόκλωνου RNA στο αρχικό δείγμα δίνεται από την

εξίσωση:

CssRNA (μg/ml) = 40 x OD260 x συντελεστής αραίωσης

όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm.

Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος RNA υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280

και ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα

θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας.

Β) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας ολιγονουκλεοτιδίων DNA

10 μλ από το δείγμα ολιγονουκλεοτιδίων μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf, όπου και

αραιώνονται µε dH2O σε αναλογία 1:100.

Μετά την αραίωση το δείγμα τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα χαλαζία και προσδιορίζεται

η οπτική πυκνότητα του δείγματος σε μήκη κύματος 240, 260 και 280 nm. Πριν από κάθε

μέτρηση το φωτόμετρο πρέπει να μηδενίζεται στο αντίστοιχο μήκος κύματος με την χρήση

απιονισμένου νερού χωρίς δείγμα ολιγονουκλεοτιδίων.

Σε υδατικά διαλύματα, χωρίς την παρουσία άλλων προσμίξεων, όπως πρωτεΐνες και

πολυσακχαρίδια, η συγκέντρωση μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων DNA στο αρχικό

δείγμα δίνεται από την εξίσωση:

ColigoDNA (μg/ml) = 30 x OD260 x συντελεστής αραίωσης

όπου: ΟD260, η οπτική πυκνότητα του δείγματος στα 260 nm.

Για την εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280 και

ΟD240/OD260. Όταν οι τιμές τους είναι 1,8-2,0 και 0,5, αντίστοιχα, τότε το δείγμα θεωρείται

ικανοποιητικής καθαρότητας.

Page 24: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 4η

- 22 -

ΑΣΚΗΣΗ 4η : Προσδιορισμός Συγκέντρωσης Ολικών

Πρωτεινών κατά Bradford

Γενικά

Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε ένα βιολογικό δείγμα αποτελεί

καθημερινό ερώτημα στο βιοχημικό εργαστήριο. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί διάφορες

μέθοδοι όπως η μέθοδος Lowry, η μέθοδος Beardens, η μέθοδος της διουρίας και η μέθοδος

Bradford. Από τις παραπάνω μεθόδους, η μέθοδος κατά Βradford είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη,

καθώς έχει μια σειρά από πλεονεκτήματα όπως η ευκολία πραγματοποιήσεως και η σχετικά καλή

ακρίβεια που παρέχει.

Η μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 να

αλλάζει το μήκος κύματος όπου παρουσιάζει τη μέγιστη απορρόφηση όταν αλληλεπιδρά με

πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον. Συγκεκριμένα η ελεύθερη χρωστική παρουσιάζει μέγιστο

απορρόφησης στα 465 nm ενώ μετά την αλληλεπίδραση το μέγιστο απορρόφησης εμφανίζεται στα

595 nm. Οπτικά η αλληλεπίδραση εμφανίζεται ως αλλαγή χρώματος της χρωστικής από καστανό

σε γαλάζιο. Η χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250 δεσμεύεται κυρίως στις πλευρικές

αλυσίδες :

α) Αρωματικών αμινοξέων (Τυροσίνη, Φαινυλαλανίνη, Τρυπροφάνη)

β) Βασικών αμινοξέων (Αργινίνη, Λυσίνη, Ιστιδίνη)

Η αλληλεπίδραση με την αργινίνη είναι η ισχυρότερη, ενώ λιγότερο ισχυρές είναι οι

αλληλεπιδράσεις με την ιστιδίνη, λυσίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη και φαινυλαλανίνη.

Πρακτικά ο προσδιορισμός γίνεται με την μέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm με τη

χρήση φωτόμετρου, ενώ η ποσοτικοποίηση βασίζεται στην κατασκευή πρότυπης καμπύλης

αναφοράς με τη μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Η

μετρούμενη απορρόφηση ακολουθεί γραμμική σχέση με τη συγκέντρωση πρωτεΐνης για εύρος

συγκεντρώσεων 0.02-0.2 mg/ml. Για μέτρηση μεγαλύτερων συγκεντρώσεων τα δείγματα θα πρέπει

να αραιώνονται κατάλληλα.

Page 25: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 4η

- 23 -

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια – Βιολογικά υλικά Μητρικό διάλυμα χρωστικής Bradford [100 mg χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-

250, 100 ml πυκνού φωσφορικού οξέος (85% w/w), 100 ml υδατικού διαλύματος

μεθανόλης (50% v/v)]

Διάλυμα εργασίας Bradford (Αραίωση του μητρικού διαλύματος χρωστικής Bradford με

απιονισμένο νερό σε αναλογία 1 προς 4. Το διάλυμα το φτιάχνουμε σε σκοτεινό δοχείο και

μπορούμε να το διατηρήσουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h.

Μητρικό διάλυμα BSA (0.2 mg/ml)

Δείγμα πρωτεϊνών

Εξοπλισμός

Σωλήνες eppendorf

Μηχανικές ρυθμιζόμενες πιπέτες

Κυψελίδες

Parafilm

Φασματοφωτόμετρο

Πειραματική διαδικασία

Α) Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς

Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς πρέπει να κατασκευάζεται κάθε φορά που παρασκευάζεται

νέο μητρικό διάλυμα χρωστικής Bradford.

Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης αναφοράς, σε 6 κυψελίδες του 1ml

προστίθενται 950μl διάλυμα εργασίας Bradford, και 0-10-20-30-40-50 μl μητρικού

διαλύματος BSA, αντίστοιχα. Τέλος, συμπληρώνεται τελικός όγκος 1 ml με απιονισμένο

νερό (Πίνακας 1). Για κάθε αραίωση BSA πραγματοποιούνται 3 επαναλήψεις..

Πίνακας 1: Προετοιμασία δειγμάτων για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης αναφοράς.

Χειρισμός Διάλυμα εργασίας

(μl) dH2O(μl) BSA

Αραίωση

BSA

mg πρωτεΐνης/ml

τελικού δείγματος

Μάρτυρας 950 50 0 - 0

1 950 40 10 1:5 0,04

2 950 30 20 2:5 0,08

3 950 20 30 3:5 0,12

4 950 10 40 4:5 0,16

5 950 0 50 1 0,20

Page 26: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 4η

- 24 -

Οι κυψελίδες καλύπτονται με ένα μικρό κομμάτι parafilm και αναδεύονται.

Τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος για 20-35 min.

Το φασματοφωτόμετρο μηδενίζεται με τη βοήθεια του δείγματος μάρτυρα.

Για κάθε ένα από δείγματα λαμβάνεται η απορρόφηση στα 595 nm.

Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς κατασκευάζεται με βάση την απορρόφηση που μετρήθηκε

ως προς την συγκέντρωση σε πρωτεΐνη του τελικού δείγματος. Παρακάτω παρουσιάζεται

ένα παράδειγμα πρότυπης καμπύλης αναφοράς. Η κλίση της καμπύλης αναφοράς 2,6

αντιστοιχεί στον συντελεστή απόσβεσης ε. Chart Title

y = 2,6029x + 0,0123

R2 = 0,9908

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

C (mg/ml)

AB

S

Β) Μέτρηση της συγκέντρωσης σε πρωτεΐνη των άγνωστων δειγμάτων

Για τον προσδιορισμό άγνωστου δείγματος πρωτεΐνης σε κυψελίδα προσθέτουμε 950μl

διάλυμα εργασίας Bradford και 50 μl διαλύματος πρωτεΐνης. Το δείγμα πρωτεΐνης θα

πρέπει να έχει αραιωθεί κατάλληλα ώστε η ποσότητα πρωτεΐνης στην κυψελίδα να μην

υπερβαίνει τα 2-10 μg πρωτεΐνης. Με τον τρόπο αυτό τα δείγματα θα βρίσκονται εντός του

εύρους της καμπύλης αναφοράς. Τέλος, για κάθε δείγμα πραγματοποιούνται 2 ανεξάρτητες

μετρήσεις.

Οι κυψελίδες καλύπτονται με ένα μικρό κομμάτι parafilm και αναδεύονται.

Τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος για 20-35 min.

Το φασματοφωτόμετρο μηδενίζεται με τη βοήθεια δείγματος μάρτυρα.

Για κάθε ένα από δείγματα λαμβάνεται η απορρόφηση στα 595 nm.

Page 27: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 4η

- 25 -

Η συγκέντρωση του δείγματος σε πρωτεΐνη υπολογίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη

αναφοράς εφαρμόζοντας τον τύπο ABS = ε x l x c.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αξιόπιστες θεωρούνται οι μετρήσεις κατά τις οποίες η απορρόφηση

κυμαίνεται από 0,100 έως 0,500. Αν η συγκέντρωση πρωτεΐνης είναι μεγαλύτερη αραιώνουμε

κατάλληλα το αρχικό μας δείγμα.

Page 28: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 5η

- 26 -

ΑΣΚΗΣΗ 5η: Φυγοκέντρηση

Γενικά

Η φυγοκέντρηση είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο Βιοχημείας για το

διαχωρισμό μεγαλομορίων, υποκυτταρικών οργανιδίων και κυττάρων με τη βοήθεια της

φυγοκέντρου δύναμης. Αν θεωρήσετε ένα δοχείο με εναιώρημα άμμου σε νερό, από την εμπειρία

γνωρίζουμε ότι τα σωματίδια της άμμου θα καθιζάνουν στον πυθμένα του δοχείου ωθούμενα από

την βαρύτητα (επιτάχυνση της βαρύτητας g=9.81 m s2). Σε ένα διάλυμα μακρομορίων όμως, τα

αιωρούμενα μακρομόρια δεν εμφανίζουν αισθητή καθίζηση καθώς εμποδίζονται από τις τυχαίες

θερμικές κινήσεις (κίνηση Brown). Η καθίζηση των μεγαλομορίων γίνεται αισθητή μόνο όταν

ασκείται πάνω τους επιτάχυνση κατά πολύ μεγαλύτερη από ένα g. Οι επιταχύνσεις αυτές στο

εργαστήριο επιτυγχάνονται με τη χρήση της τεχνικής της φυγοκέντρησης όπου η καθίζηση των

μεγαλομορίων επιτυγχάνεται μέσω της φυγοκέντρου δύναμης που ασκείται λόγω της περιστροφής

του δείγματος με τη χρήση της φυγοκέντρου. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το

1923 από το Σουηδό βιοχημικό The Svedberg.

Η φυγόκεντρος δύναμη που ασκείται σε ένα σωματίδιο με μάζα m το οποίο περιστρέφεται

με γωνιακή ταχύτητα ω σε ακτίνα r από τον άξονα περιστροφής, δίνεται από τον τύπο:

Fφυγκοκέντρησης = mω2r (εξίσωση 1)

Η τελική δύναμη καθίζησης που ασκείτε στο αντικείμενο ισούται με την Fφυγκοκέντρησης μείον την

δύναμη της άνωσης που ασκείται στο σωματίδιο από το διάλυμα στο οποίο βρίσκεται.

Fκαθίζησης = mω2r – Vpρω2r (εξίσωση 2)

Όπου Vρ ο όγκος του σωματιδίου και ρ η πυκνότητα του διαλύματος.

Εκτός από τη δύναμη της άνωσης μια επιπλέον δύναμη που αντιτίθεται στην καθίζηση του

σωματιδίου είναι η δύναμη της τριβής που ασκείται πάνω του κατά την κίνηση του μέσα στο

διάλυμα. Η δύναμη αυτή ισούται με:

Fτριβής = f(dr/dt) (εξίσωση 3)

Όπου, f ο συντελεστής τριβής ο οποίος εξαρτάται από το κινούμενο σωματίδιο (για σφαιρικά

σωματίδια ισχύει f = 6πηrm, όπου η το ιξώδες του διαλύματος και rm η ακτίνα του σωματιδίου) και

dr/dt ο ρυθμός καθίζησης εκφρασμένος ως αλλαγή της ακτίνας περιστροφής με το χρόνο. Από τα

παραπάνω προκύπτει ότι ένα σωματίδιο το οποίο βρίσκεται μέσα σε φυγοκεντρικό πεδίο θα

επιταχύνει μέχρι η φυγόκεντρος δύναμη να γίνει ίση με το άθροισμα της άνωσης και της τριβής:

Fφυγκοκέντρησης = Vpρω2r + f(dr/dt) (εξίσωση 4)

Page 29: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 5η

- 27 -

Από τις παραπάνω εξισώσεις προκύπτει ότι κάθε σωματίδιο που βρίσκεται μέσα σε φυγοκεντρικό

πεδίο χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένο ρυθμό καθίζησης. Συνεπώς για κάθε σωματίδιο ορίζεται ο

συντελεστή καθίζησης (s, sedimentation coefficient) o οποίος εκφράζει την οριακή ταχύτητα που

αποκτά το σωματίδιο για δεδομένη γωνιακή ταχύτητα και δίνεται από τη σχέση:

s = v / ω2r ή με αντικατάσταση:

s = M(1-Vs ρ) / N f (εξίσωση 5)

Όπου, v η ταχύτητα καθίζησης (dr/dt), Ν ο αριθμός του Avogadro, Vs ο μερικός σχετικός όγκος

του σωματιδίου (η μεταβολή του όγκου κατά τη διάλυση 1 gr σε άπειρο όγκο διαλύτη). Ο

Πίνακας 1: Ενδεικτικές τιμές του συντελεστή καθίζησης (s20,w) για διάφορες πρωτεΐνες, ιούς και

υποκυτταρικά οργανίδια.

Βιολογικά Υλικά Μοριακή μάζα (kDa) Συντελεστής καθίζησης, s20,w (S)

Ριβονουκλεάση Α 6,7 1,14

Κυτόχρωμα c 12,6 2,00

Αφυδρογονάση του γλουταμινικού 1015 26,60

Ευκαρυωτικά Ριβοσώματα 80

Πολυσώματα 100-400

Βακτηριοφάγος Τ2 1500

Μικροσώματα 100 - 10000

Μιτοχόνδρια 15000 - 70000

Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση

τυπικής φυγοκέντρησης με καθίζηση

ταχύτητας. Ο ρυθμός καθίζησης για

δεδομένη γωνιακή ταχύτητα (ω)

εξαρτάται από το συντελεστή

καθίζησης (s) κάθε βιολογικού

υλικού. Σε τυπικές συνθήκες

φυγοκέντρησης, μόρια με μικρό

συντελεστή καθίζησης παραμένουν

σε αιώρημα.

Page 30: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 5η

- 28 -

συντελεστής καθίζησης ορίζεται σε μονάδες Svedberg (S), ένα S ισούται με 10-13 sec. Ο

συντελεστής καθίζησης για κάθε μεγαλομόριο ή υποκυτταρικό οργανίδιο προσδιορίζεται στους

20oC και σε διαλύτη με την πυκνότητα και το ιξώδες του νερού (s20,w) Στον πίνακα 1 αναφέρονται

οι συντελεστές καθίζησης για διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια και πρωτεΐνες.

Στην εργαστηριακή πρακτική, όταν ένα βιολογικό δείγμα βρεθεί μέσα σε ένα φυγοκεντρικό

πεδίο, τότε τα διάφορα βιολογικά υλικά που το αποτελούν καθιζάνουν με ταχύτητα που εξαρτάται

από το συντελεστή καθίζησης. Συνεπώς, βιολογικά υλικά με μεγαλύτερο συντελεστή καθίζησης

κινούνται ταχύτερα από βιολογικά υλικά με μικρότερο συντελεσή με συνέπεια να σχηματίζονται

χαρακτηριστικές ζώνες διαχωρισμού (Σχήμα 1). Η τεχνική αυτή ονομάζεται Φυγοκέντρηση με

Καθίζηση Ταχύτητας.

Αναλυτική Φυγοκέντρηση

Η μοριακή μάζα (Μ) ενός μεγαλομορίου η υποκυτταρικού οργανιδίου είναι δυνατό να

υπολογιστεί εάν μετρηθεί η συντελεστής καθίζησης (s) και είναι γνωστός ο συντελεστής τριβής του

(f). Πράγματι, από την εξίσωση 5 προκύπτει με αντικατάσταση:

Μ = s N f / (1-Vs ρ) (εξίσωση 6)

Ο προσδιορισμός του ρυθμού καθίζησης γίνεται με τη βοήθεια οπτικών διατάξεων. Η τεχνική της

αναλυτικής φυγοκέντρησης χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των μοριακών μαζών σχετικά

μεγάλων βιολογικών συμπλόκων. Τα τελευταία χρόνια όμως τείνει να αντικατασταθεί από άλλες

μεθόδους όπως η χρωματογραφία μοριακού ηθμού.

Φυγοκέντρηση Βαθμίδωσης Πυκνότητας

Κατά την τεχνική της Φυγοκέντρησης Βαθμίσωσης Πυκνότητας ο διαχωρισμός ενός

βιολογικού δείγματος στα επιμέρους συστατικά τους γίνεται είτε με βάση το συντελεστή καθίζησης

και την πυκνότητα τους. Αρχικά το δείγμα αποτίθεται πάνω σε στήλη η οποία περιέχει ένα διάλυμα

σακχαρόζης ή γλυκερόλης του οποίου η πυκνότητα μεταβάλλεται γραμμικά ή εκθετικά με το ύψος.

Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, τα σωματίδια και μεγαλομόρια που αποτελούν το βιολογικό δείγμα

κατά τη φυγοκέντρηση ακολουθούν του κανόνες της καθίζησης ταχύτητας. Η αυξανόμενη

πυκνότητα διευκολύνει την κλασματοποίηση, έτσι ώστε κάθε στοιβάδα να είναι ελεύθερη από την

λιγότερο πυκνή που είναι από επάνω και την πυκνότερη που βρίσκεται από κάτω. Παραλλαγή της

μεθόδου αποτελεί η Φυγοκέντρηση Εξισορρόπησης σε Βαθμίδωση Πυκνότητας. Στη μέθοδο

αυτή η βαθμίδωση πυκνότητας επιτυγχάνεται με τη χρήση πυκνών αλάτων (πχ. CsCl). Η

διαβάθμιση πυκνότητας επιτυγχάνεται κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρηση του διαλύματος σε

υψηλές ταχύτητες, ενώ το εύρος πυκνοτήτων που προκύπτει καλύπτει το εύρος πυκνοτήτων των

Page 31: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 5η

- 29 -

βιολογικών υλικών. Το βιολογικό δείγμα είτε εφαρμόζεται στην κορφή της στήλης είτε απ’

απευθείας στο εσωτερικό της στήλης και υφίσταται μακροχρόνια φυγοκέντρηση ώστε τα

συστατικά του να συσσωρευθούν στην περιοχή όπου η πυκνότητα της βαθμίδωσης είναι ίση με την

πυκνότητα τους (Σχήμα 2Β). Στο σημείο αυτό η περαιτέρω καθίζηση σταματά καθώς o

συντελεστής (1-Vs ρ) γίνεται ίσος με το μηδέν. Η ζώνη που περιέχει τα σωματίδια η μεγαλομόρια

που μας ενδιαφέρουν παραλαμβάνεται μετά το τέλος της φυγοκέντρησης. Η μέθοδος αυτή

αποκαλείται και ισοπυκνηκή φυγοκέντρηση (isopycnic centrifugation) και χρησιμοποιείται

ευρύτατα για την απομόνωση βιολογικών υλικών όπως νουκλεϊνικά οξέα, ιοί και διάφορα

υποκυτταρικά οργανίδια όπως ριβοσώματα.

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια – Βιολογικά υλικά

Υγρή καλλιέργεια του βακτηρίου Escherichia coli

Υγρή καλλιέργεια του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae

Εξοπλισμός

Σωλήνες eppendorf

Επιτραπέζια φυγόκεντρος

Σχήμα 2: Α) Σχηματική αναπαράσταση

τυπικής φυγοκέντρησης σε βαθμίδωση

πυκνότητας σακχαρόζης ή γλυκερόλης.

Η καθίζηση ακολουθεί γενικά τους

κανόνες της φυγοκέντρησης ταχύτητας

με τη διαφορά ότι η διαβάθμιση

πυκνότητας υποβοηθά το διαχωρισμό.

Β) Σχηματική αναπαράσταση τυπικής

φυγοκέντρησης εξισορρόπισης σε

βαθμίδωσαη πυκνότητας. Η βαθμίδωση

πυκνότητας δημιουργείτε κατά τη

φυγοκέντρηση σε υψηλές στροφές. Τα

συστατικά του βιολογικού δείγματος

ισορροπούν στην περιοχή όπου η

πυκνότητα του διαλύματος εξισώνεται

με τη δική τους.

Page 32: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 5η

- 30 -

Πειραματική διαδικασία

Α) Συλλογή κυττάρων Escherichia coli με φυγοκέντρηση ταχύτητας

1.5 ml από την καλλιέργεια E. coli μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf.

Οι σωλήνες eppendorf τοποθετούνται στην κεφαλή της φυγοκέντρου, κατά ζεύγη σε

αντιδιαμετρικές θέσεις, έτσι ώστε οι κεφαλή να παραμένει ισοζυγισμένη ως προς τον άξονα

περιστροφής.

Τα δείγματα φυγοκεντρούνται για 1 min στις 1.000 σ.α.λ. (στροφές ανά λεπτό).

Παρατηρήστε την ποσότητα του ιζήματος των βακτηριακών κυττάρων.

Επαναδιαλύστε τα κύτταρα με ελαφριά ανακίνηση και επαναλάβεται την φυγοκέντρηση 5

min στις 5.000 σ.α.λ.

Παρατηρήστε την ποσότητα του ιζήματος των βακτηριακών κυττάρων.

Απομακρύνεται το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό.

Β) Συλλογή κυττάρων Saccharomyces cerevisiae με φυγοκέντρηση ταχύτητας

1.5 ml από την καλλιέργεια S. cerevisiae μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf.

Οι σωλήνες eppendorf τοποθετούνται στην κεφαλή της φυγοκέντρου, κατά ζεύγη σε

αντιδιαμετρικές θέσεις, έτσι ώστε οι κεφαλή να παραμένει ισοζυγισμένη ως προς τον άξονα

περιστροφής.

Τα δείγματα φυγοκεντρούνται για 1 min στις 1.000 σ.α.λ. (στροφές ανά λεπτό).

Παρατηρήστε την ποσότητα του ιζήματος των κυττάρων του ζυμομύκητα.

Επαναδιαλύστε τα κύτταρα με ελαφριά ανακίνηση και επαναλάβεται την φυγοκέντρηση 5

min στις 5.000 σ.α.λ.

Παρατηρήστε την ποσότητα του ιζήματος των κυττάρων του ζυμομύκητα.

Απομακρύνεται το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό.

Page 33: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 31 -

ΑΣΚΗΣΗ 6η : Ηλεκτροφόρηση

Γενικά

Ηλεκτροφόρηση καλείται η οικογένεια τεχνικών κατά την οποία φορτισμένα βιομόρια

διαχωρίζονται κατά την κίνηση τους μέσα σε ένα διάλυμα ή στερεό υπόστρωμα, κάτω από την

επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η δύναμη που ασκείται σε ένα φορτισμένο σωματίδιο το οποίο

βρίσκεται εντός ηλεκτρικού πεδίου δίνεται από τον τύπο:

Fel = q E (εξίσωση 1)

Όπου, q το φορτίο του σωματιδίου και Ε η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Η κίνηση του

σωματιδίου διαμέσω του διαλύματος ή του στερεού υποστρώματος της ηλεκτροφόρησης, κάτω από

την επίδραση της Fel, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μια δύναμης που αντιτίθεται στην κίνηση

και η οποία δίνεται από τον τύπο:

Fτριβής = v f (εξίσωση 2)

Όπου, v η ταχύτητα της κίνησης του μορίου και f ο συντελεστής τριβής. Ο συντελεστής τριβής

αποτελεί ένα μέτρο της αντίστασης που προβάλει το μέσο ηλεκτροφόρησης στην κίνηση των

φορτισμένων βιομορίων και εξαρτάται από την ακτίνα του μορίου και το ιξώδες του μέσου. Σε ένα

σταθερό ηλεκτρικό πεδίο, το φορτισμένο μόριο θα επιταχύνει μέχρι οι δύο αντιτιθέμενες δυνάμεις

να εξισωθούν:

q E = v f (εξίσωση 3)

Με βάση την εξίσωση 3 ορίζεται ο συντελεστής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (μ) του

μορίου, ο οποίος είναι ανάλογος του φορτίου του και αντιστρόφως ανάλογος της ακτίνας του

μορίου και του ιξώδους του μέσου:

μ = v / f = q / f (εξίσωση 4)

Για την κάλυψη των ειδικών αναγκών διαχωρισμού βιομορίων που προκύπτουν στο

εργαστήριο Βιοχημείας, έχουν αναπτυχθεί αρκετά διαφορετικά συστήματα ηλεκτροφόρησης,

μερικά από τα οποία θα αναλυθούν παρακάτω.

Ηλεκτροφόρηση χάρτου: Αποτελεί την πιο κοινή μέθοδο ηλεκτροφόρησης για το

διαχωρισμό μικρών μορίων. Αντίθετα δεν χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μεγαλομορίων όπως

πρωτεΐνες και νουκλεϊνικά οξέα. Στην τεχνική αυτή, το δείγμα εναποτίθεται σε μία λωρίδα

διηθητικού χαρτιού οι άκρες του οποίου είναι εμβαπτισμένες σε δύο ανεξάρτητα δοχεία με

ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτρολύτη, τα οποία αντιστοιχούν στην άνοδο και την κάθοδο αντίστοιχα

(Σχήμα 1Α). Το δείγμα του περιλαμβάνει τα προς διαχωρισμό μόρια εναποτίθεται στη γραμμή

Page 34: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 32 -

εκκίνησης και με την έναρξη της ηλεκτροφόρησης τα θετικά φορτισμένα ιόντα κινούνται προς την

κάθοδο ενώ τα αρνητικά προς την άνοδο. Η απόσταση που καλύπτουν τα μόρια είναι εξάρτηση της

ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, παράγοντας βάση του οποίου επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός.

Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ακολουθεί ανάλυση για τον εντοπισμό των ουσιών (Σχήμα

1Β).

Ηλεκτροφόρηση σε οξική κυτταρίνη και νιτρική κυτταρίνη: Η διαδικασία της

ηλεκτροφόρησης είναι σχεδόν όμοια με την ηλεκτροφόρηση χάρτου με τη διαφορά ότι ως

υπόστρωμα χρησιμοποιούνται πλαστικά φύλλα οξικής και νιτρικής κυτταρίνης. Η τεχνική αυτή,

όμως, σε αντίθεση με την ηλεκτροφόρηση χάρτου χρησιμοποιείται για την ανάλυση δειγμάτων

πρωτεϊνών. Ο εντοπισμός των πρωτεϊνών μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης μπορεί να

πραγματοποιηθεί είτε με ανίχνευση ενζυμικής δραστικότητας, είτε ανοσολογικά

(Ανοσοηλεκτροφόρηση).

Ηλεκτροφόρηση πηκτής: Η Ηλεκτροφόρηση πηκτής αποτελεί την πλέον αποτελεσματική

μέθοδο για τον διαχωρισμό βιολογικών μεγαλομορίων (πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα). Στην μέθοδο

αυτή ως υπόστρωμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται ένα πήκτωμα, το οποίο αποτελείται από

πολυμερές υλικό. Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται συνήθως για την παρασκευή των

πηκτωμάτων είναι η αγαρόζη και το πολυακρυλαμίδιο. Οι πηκτές που κατασκευάζονται από τα

παραπάνω υλικά, έχουν πόρους το μέγεθος των οποίων είναι δυνατό να ρυθμιστεί κατά την

παρασκευή της πηκτής. Συνεπώς, ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με συνδυασμό μοριακής διήθησης

και διαφορικής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των μεγαλομορίων. Σε αντίθεση όμως με την

Σχήμα 1: Α) Σχηματική παράσταση της

ηλεκτροφόρησης χάρτου. Το δείγμα σηνύθως

εφαρμόζεται ως κηλίδα ή ζώνη στο σημείο εκκίνησης.

Β) Σχηματική παράσταση ενός ολοκληρωμένου

ηλεκτροφορεγραφήματος χάρτου. Τα θετικά

φορτισμένα ιόντα κινούνται προς την κάθοδο ενώ τα

αρνητικά προς την άνοδο. Τα μη φορτισμένο μόρια

παραμένουν στο σημείο εφαρμογής του δείγματος.

Page 35: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 33 -

χρωματογραφία μοριακού ηθμού, οι πηκτές που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση

προβάλουν μεγαλύτερη αντίσταση στην κίνηση των μεγαλύτερων μορίων σε σχέση με τα

μικρότερα. Αυτό οφείλεται στο ότι δεν υπάρχει ελεύθερος χώρος στο εσωτερικό της πηκτής

ανάλογος με τον κενό χώρο μεταξύ των σφαιριδίων που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία

μοριακού ηθμού, μέσα στον οποίο να μπορούν να κινηθούν τα μεγαλύτερα μόρια. Στη συνήθη

εργαστηριακή πρακτική, οι πηκτές αγαρόζης χρησιμοποιούνται κυρίως για την ηλεκτροφόρηση

νουκλεϊνικών οξέων (DNA, RNA), ενώ οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιούνται για την

ηλεκτροφόρηση τόσο νουκλεϊνικών οξέων όσο και πρωτεϊνών. Παρακάτω θα γίνει λεπτομερέστερη

περιγραφή των μεθόδων ηλεκτοφόρησης πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, καθώς οι

τεχνικές ηλεκτροφόρησης νουκλεϊνικών οξέων σε πηκτή αγαρόζης θα αποτελέσουν αντικείμενο

των εργαστηρίων Τεχνολογίας Ανασυνδυασμένου DNA.

Στην ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (Polyacrylamide Gel Electrophoresis,

PAGE), η πηκτή παρασκευάζεται από τον χημικό πολυμερισμό μονομερών ακρυλαμιδίου και

N,N´-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (Σχήμα 2).

Από το σχήμα 2 γίνεται φανερό ότι ο ρόλος του N,N´-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου εντοπίζεται στο

σχηματισμό γεφυρών μεταξύ των γειτονικών αλυσίδων ακρυλαμιδίου, ρυθμίζοντας με αυτό τον

τρόπο το πορώδες της πηκτής. Τα μονομερή ακρυλαμιδίου και N,N´-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου

δεν πολυμερίζονται από μόνα τους ο πολυμερισμός επάγεται από την παρουσία ελευθέρων ριζών

στο διάλυμα. Στην πράξη για την παραγωγή των ελευθέρων ριζών που απαιτούνται για τον

πολυμερισμό, χρησιμοποιούνται χημικές ή φωτοχημικές πηγές παραγωγής τους. Στη χημική

μέθοδο, οι ελεύθερες ρίζες παράγονται από το υπερθειïκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate,

APS), παρουσία του αντιδραστηρίου τετραμεθυλαιθυλενο-διαμίνης (TEMED) ο ρόλος της

οποίας έγκειται στη σταθεροποίηση των ελεύθερων ριζών. Στη φωτοχημική μέθοδο, οι ελεύθερες

Σχήμα 2: Σχηματική αναπαράσταση του

πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου και του

N,N´-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου για το

σχηματισμό πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Ο

πολυμερισμός επάγεται από ελεύθερες

ρίζες που παράγονται από την αποδόμηση

υπερθειïκού αμμωνίου (APS), παρουσία

της τετραμεθυλαιθυλενο-διαμίνης

(TEMED) που δρα ως καταλύτης.

Page 36: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 34 -

ρίζες παράγονται από τη διάσπαση μιας φωτοευαίσθητης ουσίας (ριβοφλαβίνη) με ακτινοβολία

υπεριώδους φωτός (UV).

Μη συνεχής ηλεκτροφόρηση πηκτής (discontinuous gel electrophoresis): Το σύστημα

μη συνεχούς ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμίδης έχει αναπτυχθεί με σκοπό την

βελτιστοποίηση της διαδικασίας διαχωρισμού πρωτεϊνών. Στην τεχνική αυτή, η πηκτή

πολυακρυλαμιδίου αποτελείται από δύο πηκτές διαφορετικής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο και

τιμής pH (Σχήμα 3). Tο δείγμα των προς διαχωρισμό πρωτεϊνών τοποθετείται στην πηκτή

συσσώρευσης (stacking gel), η οποία είναι χαμηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο και τιμής pH

6,9 (ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl). Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται ρυθμιστικό

διάλυμα γλυκίνης pH 8.3. Κατά την έναρξη της ηλεκτροφόρησης τα ανιόντα γλυκίνης που

βρίσκονται σε τιμή pH 8,3, έχουν μέσο φορτίο 0,1. Με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, τα

ανιόντα γλυκίνης κινούνται προς την πηκτή συσσώρευσης όπου λόγω της χαμηλότερης τιμή pH

που συναντούν μειώνεται το μέσο αρνητικό φορτίο του με αποτέλεσμα να μειώνεται η

κινητικότητα τους. Σε αντίθεση, σε pH 6,9, οι περισσότερες πρωτεΐνες φέρουν αρκετά μεγάλο

αρνητικό φορτίο, έχοντας μεγαλύτερη κινητικότητα από τα ιόντα γλυκίνης. Τέλος τα ιόντα Cl- που

βρίσκονται στην πηκτή συσσώρευσης, έχοντας πλήρες αρνητικό φορτίο και μικρό μέγεθος έχουν

την μεγαλύτερη κινητικότητα σχηματίζοντας μέτωπο μπροστά από τις πρωτεΐνες και τα ιόντα

γλυκίνης. Συνεπώς η σειρά κινητικότητας των ανιόντων που απαντώνται στην πηκτή είναι Cl- >

πρωτεΐνες > γλυκίνη. Η πολύ χαμηλή κινητικότητα των ιόντων γλυκίνης δημιουργεί έλλειψη

ιόντων φορέων ηλεκτρικού ρεύματος με συνέπεια την τοπική αύξηση της ηλεκτρική αντίστασης

(R), η οποία με βάση τον νόμο του Ohm συνεπάγεται την τοπική αύξηση της έντασης του

Σχήμα 3: Σχηματική παράσταση της διαδικασίας ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών σε μη συνεχή πηκτή πολυακρυλαμιδίου.

Page 37: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 35 -

ηλεκτρικού πεδίου (E). Η τοπική αύξηση της έντασης του ηλεκτρικού πεδίου ωθεί τα μόριο των

πρωτεϊνών να κινηθούν ταχύτερα μέχρι να φτάσουν το μέτωπο των προπορευμένων ιόντων Cl- και

επιβραδύνουν καθώς δεν υφίσταται πλέον τοπική έλλειψη ιόντων. Το φαινόμενο αυτό υποχρεώνει

τα μόρια των πρωτεϊνών να κινηθούν σε στενές ζώνες (0,01 mm), ανάλογα με την κινητικότητα

τους, μεταξύ των ιόντων της πηκτής συσσώρευσης (Cl-) και των ιόντων ρυθμιστικού

ηλεκτροφόρεσης (γλυκίνη). Καθώς τα μόρια των πρωτεϊνών εισέρχονται στην πηκτή διαχωρισμού

(resolving gel) επιβραδύνουν καθώς η περιεκτικότητα της πηκτής σε ακρυλαμίδιο είναι

μεγαλύτερη και το μέγεθος των πόρων μικρότερο σε σχέση με την πηκτή συσσώρευσης. Επιπλέον,

η κινητικότητα των ιόντων γλυκίνης αυξάνεται καθώς εισέρχονται σε pH 8,9, με αποτέλεσμα να

προσπερνούν τα μόρια των πρωτεϊνών. Έτσι η τοπική έλλειψη ιόντων αίρεται και από το σημείο

αυτό και μετά η ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών συνεχίζεται κανονικά με βάση την

ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Η είσοδος των πρωτεϊνών στην πηκτή διαχωρισμού υπό την μορφή

προδιαχωρισμένων στενών ζωνών έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση της διακριτικής

ικανότητας της διαδικασίας διαχωρισμού.

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-

PAGE): Στα συστήματα ηλεκτροφόρησης που αναφέρθηκαν μέχρι τώρα, οι πρωτεΐνες

διαχωρίζονται στην φυσική τους κατάσταση (Native) με βάση την ηλεκτροφορητική ικανότητα, η

οποία όπως έγινε φανερό, καθορίζεται από το σχήμα, το μέγεθος, αλλά και το φορτίο τους. Στα

συστήματα ηλεκτροφόρησης πολυακρυλαμιδίου παρουσία του δωδεκανοθειϊκού νατρίου

(sodium dodecyl sulphate, SDS, [CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-]Na+), ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών

γίνεται με βάση τη μοριακή τους μάζα και όχι το φορτίο. Το SDS είναι ένα ισχυρό, αρνητικά

φορτισμένο απορρυπαντικό (αμφιφιλική ένωση) η οποία αλληλεπιδρά ισχυρά με τα πρωτεϊνικά

μόρια σε αναλογία 1,4 gr SDS / gr πρωτεΐνης (περίπου ένα μόριο SDS για κάθε δύο αμινοξέα). Η

αλληλεπίδραση έχει ως αποτέλεσμα να χάνουν τη φυσική δομή τους και να αποκτούν ραβδόμορφο

σχήμα. Επιπλέον, το ισχυρό αρνητικό φορτίο των μορίων SDS καλύπτει το φυσικό φορτίο της

πρωτεΐνης, έτσι ώστε τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-SDS τείνουν να έχουν σταθερό λόγο φορτίου προς

μάζα. Συνεπώς, κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή που περιέχει SDS, ο διαχωρισμός

γίνεται μόνο με βάση τη μοριακή μάζα εξαιτίας του φαινόμενου μοριακής διήθησης κατά την

κίνηση μέσα από τους πόρους της πηκτής. Πριν από την ηλεκτροφόρηση, τα πρωτεϊνικά δείγματα

θερμαίνονται στους 100οC παρουσία SDS και μίας θειόλης, όπως η β-μερκαπτοαιθανόλη (ΗΟ-CH2-

CH2-SH). Ο ρόλος της β-μερκαπτοαιθανόλης είναι η αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών που

σχηματίζονται μεταξύ καταλοίπων κυστεΐνης. Αποτέλεσμα της παραπάνω κατεργασίας είναι η

αποδιάταξη των πρωτεϊνικών μορίων, έτσι ώστε κατά την ηλεκτροφόρηση να διαχωρίζονται οι

μεμονωμένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες που σε πολλές περιπτώσεις απαρτίζουν ένα πρωτεϊνικό

Page 38: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 36 -

μόριο. Ο εντοπισμός των πρωτεϊνών μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης επιτυγχάνεται μετά από

χρώση τους με κατάλληλα αντιδραστήρια. Συνήθως χρησιμοποιείται η χρωστική Coomassie

Brilliant Blue R-250 η οποία βάφει τις ζώνες των πρωτεϊνών κυανές (σχήμα 4), ή εναλλακτικά

διάλυμα νιτρικού αργύρου παρουσία αναγωγικών ενώσεων και φορμαλδεΰδης ή γλουταραλδεΰδης,

οπότε οι πρωτεϊνικές ζώνες χρωματίζονται καστανόμαυρες.

Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε αποδιατακτική (SDS) πηκτή πολυακρυλαμιδίου βρίσκει

εφαρμογή στον κατά προσέγγιση (απόκλιση μέχρι 10%) προσδιορισμό της μοριακής μάζας των

πολυπεπτιδίων. Ο προσδιορισμός στηρίζεται στο γεγονός ότι η σχετική κινητικότητα ενός

πολυπεπτιδίου σχετίζεται γραμμικά με το δεκαδικό λογάριθμο της μοριακής μάζας του. Στη συνήθη

πρακτική, η μοριακή μάζα αγνώστων πολυπεπτιδικών αλυσίδων προσδιορίζεται με την παράλληλη

ηλεκτροφόρηση ενός μίγματος πρωτεϊνών γνωστής μοριακής μάζας (δείκτης μοριακών μαζών).

Ισοηλεκτρική Eστίαση (Isoelectric Focusing): Όπως είναι γνωστό, το συνολικό φορτίο

μιας πρωτεΐνης είναι ίσο με το αλγεβρικό των φορτίων των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων που

την αποτελούν. Σε ορισμένη τιμή pH, που ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο, το συνολικό φορτίο

της πρωτεΐνης γίνεται ίσο με το μηδέν. Συνεπώς, αν είναι μίγμα πρωτεϊνών αναλυθεί με

ηλεκτροφόρηση σε μια πηκτή η οποία φέρει διαβάθμιση pH, με το pH να αυξάνεται ομαλά από την

άνοδο προς την κάθοδο, κάθε πρωτεΐνη θα κινηθεί μέχρι το σημείο στην πηκτή στο οποίο η τιμή

του pH θα γίνει ίση με το ισοηλεκτρικό της σημείο. Στο σημείο αυτό το φορτίο της πρωτεΐνης θα

μηδενιστεί και η κίνηση του μορίου θα σταματήσει. Αν τα μόρια της πρωτεΐνης διαχυθούν πέρα

από το συγκεκριμένο σημείο, το φορτίο θα αλλάξει καθώς η πρωτεΐνη θα κινηθεί σε περιοχή με

διαφορετικό pH με αποτέλεσμα οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις που θα αναπτυχθούν να ωθήσουν την

πρωτεΐνη πίσω στην ισοηλεκτρική περιοχή. Τελικά κάθε πρωτεΐνη συγκεντρώνεται (εστιάζεται) σε

μια στενή ζώνη γύρω από το ισοηλεκτρικό της σημείο (±0.01 μονάδα pH). Η διαβάθμιση pH στην

Σχήμα 4: Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε

αποδιατακτική πηκτή πολυακριλαμιδίου παρουσία

SDS (SDS-PAGE). Ο διαχωρισμός των

πολυπεπτιδίων γίνεται με βάση την μοριακή μάζα.

Για τον προσδιορισμό της μοριακής μάζας των

πρωτεϊνών του δείγματος ηλεκτροφορείται

παράλληλα μείγμα πολυπεπτιδίων γνωστής

μοριακής μάζας (στήλη 1)

Page 39: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 37 -

πηκτή της ισοηλεκτρικής εστίασης δημιουργείται με την ανάμιξη χαμηλού μοριακού βάρους (300-

600 Da) πολυμερών που φέρουν αλιφατικές αμινο και καρβοξυλικές ομάδες, οι οποίες ονομάζονται

πολυαμφολύτες (polyampholytes). Κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, σε διάλυμα οι

πολυαμφολύτες θα κινηθούν ανάλογα με το ισοηλεκτρικό τους σημείο με τρόπο ώστε οι

περισσότερο όξινες ενώσεις να συγκεντρωθούν στην άνοδο, ενώ οι βασικές πλησιέστερα στην

κάθοδο. Η διαβάθμιση pH δημιουργείται από την ρυθμιστική ικανότητα του μεταβαλλόμενου

μίγματος των πολυαμφολυτών μεταξύ των δύο πόλων και παραμένει σταθερή όσο διατηρείται το

ηλεκτρικό πεδίο. Στη συνήθη εργαστηριακή πρακτική, η ισοηλεκτρική εστίαση χρησιμοποιείται σε

συνδυασμό με μια συμβατική μέθοδο ηλεκτροφόρησης (SDS-PAGE). Η τεχνική ονομάζεται

δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2D-PAGE) και αποτελεί μια πανίσχυρη τεχνική για την

λεπτομερή ανάλυση σύνθετων μιγμάτων πρωτεϊνών (σχήμα 5).

Εκτέλεση της άσκησης

Απαιτούμενα Υλικά

Αντιδραστήρια – Βιολογικά υλικά

Διάλυμα απιονισμένου ακρυλαμιδίου 30% (w/v)

Διάλυμα N,N´-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου 1% (w/v)

Ρυθμιστικό διάλυμα 3Μ Tris-HCl pH 8.6

Ρυθμιστικό διάλυμα 1Μ Tris-HCl pH 6.8

Διάλυμα δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) 10% (w/v)

Σχήμα 5: Δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση

(2D-PAGE) ραδιενεργά σημασμένων

ολικών πρωτεϊνών του βακτηρίου

Escherichia coli. Κατά το πρώτο στάδιο,

πραγματοποιήθηκε ισοηλεκτρική εστίαση

των πρωτεϊνών σε πηκτή

πολυακρυλαμιδίου που βρισκόταν σε

σωλήνα. Ακολούθως η πηκτή

απομακρύνθηκε από το σωλήνα και

τοποθετήθηκε στην κορυφή SDS πηκτής

πολυακρυλαμιδίου. Μετά την ανάλυση

SDS-PAGE, ο εντοπισμός των πρωτεϊνών

έγινε με αυτοραδιογραφία.

Page 40: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 38 -

Tετραμεθυλαιθυλενο-διαμίνη (TEMED)

Διάλυμα υπερθειïκού αμμωνίου (APS) 10% (w/v)

1x Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (Ανά λίτρο: 14.4 gr γλυκίνη, 3 gr Tris-base, 1 gr

SDS)

Διάλυμα δείγματος (2x) (4% SDS, 10% β-μερκαπτοαιθανόλη, 20% γλυκερόλη, 0.1Μ Tris

pH 6.8, 0.005% μπλε της βρομοφαινόλης)

Διάλυμα χρώσης (45% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ, 0.25% (w/v) Coomasie Brilliant Blue R-

250)

Διάλυμα αποχρωματισμού (30% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ)

Υγρή καλλιέργεια βακτηρίων

Εξοπλισμός

Πιπέτες γυάλινες

Μηχανικές ρυθμιζόμενες πιπέτες

Ποτήρι ζέσεως

Σωλήνες eppendorf

Βραστήρας

Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης

Τροφοδοτικό συνεχόμενου ρεύματος

Πειραματική διαδικασία

Α) Παρασκευή της αποδιατακτικής πηκτής ακρυλαμιδίου

Η πηκτή συσσώρευσης καθώς και η πηκτή διαχωρισμού παρασκευάζονται µε βάση τον παρακάτω

πίνακα:

Πίκακας 1: Σύσταση πηκτής πολυακρυλαµιδίου ανάλογα µε την τελική συγκέντρωση σε ακρυλαµίδιο. Όλες

οι ποσότητες αναγράφονται σε ml.

Πηκτή Διαχωρισμού Πηκτή

Συσσώρευσης 20% 15% 25%

ddH2O 3,84 8 - 6,24

30% Ακρυλαμίδιο 20 15 25 1,3

1% δις-ακρυλαμίδιο 1,95 2,6 11,56 1

3Μ Tris-HCl pH 8.6 3,75 3,75 3,75 -

1Μ Tris-HCl pH 6.8 - - - 1,25

10% SDS 0,3 0,3 0,3 0,1

TEMED 0,015 0,015 0,015 0,015

10% APS 0,15 0,15 0,15 0,15

Page 41: Γ &πονικ Πανπιήμιο Αθηνν · 1 = v 2 x c 2 (Εξί 1ωη 4) Όπου v1, c1, ο αρχικός όγκος και η συγκέντρωση του μητρικού

ΑΣΚΗΣΗ 6η

- 39 -

Το μείγμα της πηκτής διαχωρισμού τοποθετείται ανάμεσα στα τζάμια της συσκευής και

αφού προστεθεί λίγο νερό για να εξομαλυνθεί η ελεύθερη επιφάνεια, αφήνεται να

πολυµεριστεί για 1 ώρα.

Μετά τον πλήρη πολυµερισµό και αφού αφαιρεθεί το νερό, προστίθεται το μείγμα της

πηκτής συσσώρευσης και αμέσως τοποθετείται η χτένα .

Μετά τον πολυµερισµό της πηκτής επικάλυψης, περίπου 30 λεπτά, η χτένα αφαιρείται

προσεκτικά και η πηκτή τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης.

Η συσκευή γεμίζεται µε 1x ρυθµιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης, απομακρύνονται οι

φυσαλίδες από το κάτω μέρος της πηκτής, αφαιρείται η χτένα και καθαρίζονται τα

πηγαδάκια από τα υπολείμματα πολυακρυλαμιδίου.

Β) Απομόνωση ολικών πρωτεϊνών από καλλιέργεια του βακτηρίου E. coli

1.5 ml καλλιέργειας E. coli μεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf και τα βακτηριακά

κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση στις 6.000 σ.α.λ. για 5 λεπτά σε θερμοκρασία

δωματίου.

Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το βακτηριακό ίζημα επαναδιαλύεται σε 100 µl dΗ2O.

Αμέσως προστίθενται 100 µl διαλύματος δείγματος (2x) και τα δείγματα επωάζονται

στους 100οC για 5 λεπτά, φυγοκεντρούνται στις 13.000 σ.α.λ. για 5 λεπτά και φυλάσσονται

στους -20οC.

Γ) Ηλεκτροφόρηση του δείγματος των πρωτεϊνών

Τα δείγματα των πρωτεϊνών εφαρμόζονται στην πηκτή και ηλεκτροφορούνται αρχικά στα

90 Volts όσο διατρέχουν την πηκτή συσσώρευσης και αμέσως μετά στα 140 Volts.

H ηλεκτροφόρηση διακόπτεται μόλις η χρωστική του δείγματος φτάσει στο κάτω μέρος της

πηκτής.

Εφ’ όσον είναι επιθυμητή η χρώση των πρωτεϊνών, μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η

πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα χρώσης για 30 λεπτά στους 60οC µε ελαφρά ανακίνηση.

Η περίσσεια της χρωστικής αφαιρείται µε εµβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα

αποχρωµατισµού σε θερμοκρασία δωματίου, µε ελαφρά ανακίνηση. Το διάλυμα

αποχρωµατισµού αντικαθίσταται µε νέο ανά 1 ώρα.