Καθαρισμός  και  χαρακτηρισμός  πρωτεινών  

Βασικές  αρχές  και  μεθοδολογία  

Καθαρισμός  πρωτεινών  

�  Μέθοδοι  διαλυτοποίησης  πρωτεϊνών  �  Μηχανικές  διαδικασίες  διάρρηξης  

κυττάρων  �  Μεμβρανικές  πρωτείνες  �  Χρωματογραφικός  διαχωρισμός  

πρωτεϊνών  �  Ανάλυση  πρωτεϊνών  �  Ποσοτικοποίηση  πρωτεϊνών  

 

 

   

Κυτταρική  λύση

Διαλυτό  κλάσμα

Χρωματογραφικός  καθαρισμός

Μέγεθος-­‐φορτίο-­‐συγγένεια  κλπ

Διαφορική  κλασμάτωση

Χρωματογραφικός  καθαρισμός

Αδιάλυτο  κλάσμα

Διαλυτοποίηση  ή  απόρριψη

Γενική  επισκόπηση  καθαρισμού  πρωτεϊνών  

Mέθοδοι  διαλυτοποίησης  πρωτεϊνών  �  1ο  στάδιο  είναι  η  μεταφορά  των  πρωτεϊνών  σε  διάλυμα  �  Εάν  η  πρωτείνη  είναι  στο  κυτταρόπλασμα  πρέπει  να  σπάσουμε-­‐ανοίξουμε  τα  κύτταρα.  

�  Για  ζωϊκά  κύτταρα  η  ρήξη  μπορεί  εύκολα  να  γίνει  με  ωσμωτική  λύση  (υποτονικό  διάλυμα)  παρουσία  μη  πολικών  απορρυπαντικών.      

�  Για  κύτταρα  με  κυτταρικό  τοίχωμα  (βακτήρια,  φυτά)  πρέπει  να  χρησιμοποιήσουμε  άλλες  μεθόδους.  

�  Για  βακτήρια,  η  λυσοζύμη  είναι  η  λύση  διότι  επιλεκτικά  αποικοδομεί  το  βακτηριακό  τοίχωμα.  

�  Η  χρήση  απορρυπαντικών  ή  οργανικών  διαλυτών  πρέπει  να  γίνει  πολύ  προσεκτιά  διότι  μπορεί  να  αποδιατάξει  ή  απενεργοποιήση  κάποιες  πρωτείνες.  

 

Μηχανικές  διαδικασίες  για  τη  ρήξη  κυττάρων  

� Μίξερ  υψηλής  ταχύτητας    �  Ομογενοποιητές  διαφόρων  τύπων  �  Γαλλική  πρέσσα  �  Υάλινα  σφαιρίδια-­‐άμμος  θαλάσσης    Το  κυτταρικό  εκχύλισμα  είτε  φιλτράρεται  ή  φυγοκεντρείται.  

 

Mηχανικές  διαδικασίες  εκχύλισης  πρωτεϊνών  

Πρωτείνες  που  είναι  συστατικά  μεμβρανών  ή  υποκυτταρικών  οργανιδίων.  

�  Απομονώνουμε  τις  μεμβράνες/υποκυτταρικά  οργανίδια  από  το  υπόλοιπο  κυτταρικό  υλικό    

�  Συνήθως  γίνεται  με  διαφορική  φυγοκέντρηση  με  τη  χρήση  αδρανών  υλικών  που  σχηματίζουν  κλήση  πυκνότητας  ή  μαξιλάρια  πυκνότητας  για  να  αυξηθεί  η  διακριτικότητα  της  διαδικασίας.  

       

Διαλυτότητα  πρωτεϊνών-­‐1  

�  Οι  πρωτείνες  έχουν  διάφορες  ομάδες  που  ιονίζονται  (διαφορετικά  pK’s)  

�  Σε  ένα  pH  χαρακτηριστικό  για  κάθε  πρωτείνη  ο  αριθμός  των  θετικών  και  των  αρνητικών  φορτίων  είναι  ακριβώς  ο  ίδιος.  Η  πρωτείνη  έχει  συνολικά  μηδενικό  φορτίο  και  όχι  δεν  έχει  φορτίο.  

�  Το  pH  αυτό  αντιστοιχεί  στο  ισοηλεκτρικό  σημείο  της  πρωτείνης  pI  (isoelectric  point,  pI).  

�  Στο  pI  οι  πρωτείες  έχουν  μηδενικό  συνολικό  φορτίο  και  δεν  μετακινούνται  σε  κάποιο  ηλεκτρικό  πεδίο.  

�  Η  διαλυτότητα  μιας  πρωτείνης  εξαρτάται  λοιπόν  από  το  pΗ  και  στο  pI  είναι  η  ελάχιστη.  

 

Διαλυτότητα  πρωτεϊνών-­‐2  •  Οι  πολλαπλές  πλάγιες  ομάδες  των  αμινοξικών  καταλοίπων  των  πρωτεϊνών  επηρεάζουν  την  διαλυτότητά  τους  

•  Η  διαλυτότητα  των  πρωτεϊνών  εξαρτάται  κυρίως  από  τη  συγκέντρωση  των  ιόντων  στο  διάλυμα,  από  την  πολικότητα  του  διαλύτη,  το  pH,  την  θερμοκρασία  και  πολλούς  άλλους  παράγοντες.  

•  Σε  συγκεκριμένες  συνθήκες  ενώ  κάποιες  πρωτείνες  είναι  διαλυτές  κάποιες  άλλες  δεν  είναι.  Είναι  μια  ιδιότητα  που  την  αξιοποιούμαι  στα  πρώτα  στάδια  καθαρισμού  πρωτεϊνών.  

•  «Salkng  out»  or  «salkng  in»  είναι  διαδικασίες  που  βασίζονται  στην  ιοντική  ισχύ.  

�  Η  διαλυτότητα  μιας  πρωτείνης  σε  δεδομένη  ιοντική  ισχύ  εξαρτάται  από  την  ιοντική  ισχύ  και  το  τύπο  των  ιόντων.    

�  Η  διαλυτότητα  μιας  πρωτείνης  σε  χαμηλή  ιοντική  ισχύ  γενικά  αυξάνει  με  την  αύξηση  της  της  συγκέντρωσης  άλατος.  Η  διαδικασία  αυτή  ονομάζεται  «salkng  in».  ‘Οσο  αυξάνεται  η  συγκέντρωση  των  επιπλέον  ιόντων  επικαλύπτουν  πιο  αποτελεσματικά  τα  πρωτεϊνικά  μόρια  αυξάνοντας  την  προσβασιμότητα  στο  νερό  και  ως  εκ  τούτου  την  διαλυτότητα  της  πρωτείνης.  

�  Σε  υψηλή  ιονική  ισχύ  η  διαλυτότητες  πρωτεϊνών  και  άλλων  βιομορίων  συνήθως  μειώνεται.  Το  φαινόμενο  αυτό  ονομάζεται  «salkng  out»  και  είναι  αποτέλεσμα  του  ανταγωνισμού  μεταξύ  των  ιόντων  και  των  συστατικών  του  διαλύτη  που  επηρεάζουν  την  επαφή  της  πρωτείνης  με  το  διάλυμα.  

Διαλυτότητα  πρωτεϊνών-­‐3  

�  Η  πλέον  χρησιμοποιούμενη  μέθοδος  σε  διαδικασίες  καθαρισμού  πρωτεϊνών  είναι  η  “salkng  out”    

�  Ρυθμίζοντας  τη  συγκέντρωση  άλατος  σε  διάλυμα  πρωτεϊνών  λίγο  πριν  το  σημείο  αδιαλυτότητας  της  πρωτείνης  στόχος,  πολλές  άλλες  πρωτείνες  ίσως  απομακρυνθουν  από  το  διάλυμα.  Οι  πρωτείνες  αυτές  εύκολα  απομακρύνονται  με  φυγοκέντρηση.  

�  Διαφορική  καθίζηση  με  θειϊκό  αμμώνιο.      Προσοχή: τα ιόντα I-, ClO4

-, SCN-, Li+, Mg2+, Ca2

+ και Ba+ αυξάνουν τη διαλυτότητα πρωτεϊνών παρά τις διαλυτοποιούν µε τη διαδικασία του «salting out», αλλά υφίστανται και ο κίνδυνος αποδιάταξης πρωτεϊνών.

Διαλυτότητα  πρωτεϊνών-­‐4  

�  Μια  πρωτείνη  σε  pH  κοντά  στο  ισοηλεκτρικό  σημείο  δεν  είναι  αντικείμενο  της  διαδικασίας  «salkng  in».  

�  Όσο  το  pH  απομακρύνεται  από  το  pI  της  πρωτείνης  το  καθαρό  φορτίο  της  πρωτείνης  αυξάνεται  και  είναι  ευκολώτερη  η  διαδικασία  “salkng  in”.  

�  Τα  άλατα  αναστέλλουν  τις  αλληλεπιδράσεις  μεταξύ  γειτονικών  μορίων  που  πιθανόν  να  βοηθούν  στη  δημιουργία  συσσωμάτων  και  ιζημάτων  (aggregakon  and  precipitakon).  

�  Tα  pI’s  των  πρωτεϊνών  μπορούν  να  χρησιμοποιηθούν  για  τη  διαδικασία  καθίζησης  πρωτεϊνών.  

 

Διαλυτότητα  πρωτεϊνών-­‐4  

Ammonium Sulfate (% saturated)  

0   10   20   30   40   50   60   70   80   90  

Sample A280   1000   900   600   300   100   75   50   40   25   20  

Activity assay (units)   200   200   200   190   170   100   30   5   0   0  

Units/A280   0.20   0.22   0.30   0.60   1.70   1.33   0.60   0.12   0   0  

Συγκεντρωτικός  πίνακας  διαφορικής  διαλυτότητας  πρωτεϊνών  στη  διαδικασία  καθαρισμού  

Διαλυτότητα  διαφορετικών  πρωτεϊνών  σε  θειϊκό  αμμώνιο  συναρτήσει  της  ιοντικής  ισχύος.  

Διαλυτότητα  της  b-­‐lactoglobin  σε  σχέση  με  το  pH  σε  διαφορετικές  συγκεντρώσεις  NaCl.  

Διαλυτότηα  της  caboxy-­‐hemoglobin  στο  pI  της  σε  σχέση  με  την  ιοντική  ισχύ.  

Ιοντική  ισχύ  

½ Σ ciZi Ιοντική ισχή (I) = 2

Ci  =  μοριακή  συγκέντρωση  ιόντων  Zi  =  φορτίο  ιόντων  

1Μ  NaCl   1Μ  CaCl2  

½[1*(+1)2+1*(-­‐1)2]=1   ½[1*(+2)2+2*(-­‐1)2]=3  

Σταθεροποίηση  πρωτεϊνών  

�  pH  (όχι  ακραία)  �  Θερμοκρασία  �  Αναστολείς  πρωτεασών  �  Αναστολή  πιθανής  ανάπτυξης  βακτηρίων  (συνήθως  χρησιμοποιείται  sodium  azide).  

�  Ταχύτητα  �  Σωστός  προγραμματισμός  �  Χρήση  σταθεροποιητικών  παραγόντων          

Δοκιμασίες  ταυτοποίησης  πρωτεϊνών  

�  Κατά  τη  διάρκεια  μιας  διαδικασίας  καθαρισμού  πρέπει  να  είμαστε  σε  θέση  άμμεσα  και  γρήγορα  να  ταυτοποιήσουμε  την  υπάρξη  της  πρωτείνης  στόχου  στα  διάφορα  στάδια.  

�  Απαιτείται  η  χρήση  εύκολων,  γρήγορων  και  επαναλήψιμων  τεχνικών,  χαμηλού  κόστους.  

�  Ενδεικτικά:  �  Φασματοσκοπία  �  Ενζυμική  ενεργότητα  �  Ανοσολογικές  αντιδράσεις  (ELISA,Western)  �  Μοριακό  βάρος  �  Βιολογική  δραστικότητα  �  Χρήση  Τags  σε  ανασυνδιασμένες  πρωτείνες  �  Χρήση  υβριδιακών  συστημάτων  σε  ανασυνδιασμένες  πρωτείνες  

Τι  πρέπει  να  παρακολουθούμε  κατά  τη  διάρκεια  μιας  διαδικασίας  καθαρισμού  πρωτεϊνών  �  Σε  επίπεδο  πρωτείνης  ◦  Συνολικός  όγκος  πρωτεϊνών  ◦  Συγκέντρωση  πρωτεϊνών  ◦  Ενεργότητα  πρωτεϊνών  (βιολογική,  ενζυμική  κλπ)  

�  Άλλες  βασικές  παράμετροι  ◦  %  απόδοση  σε  κάθε  στάδιο  ◦  Ειδική  ενεργότητα  της  πρωτείνης  στόχου  (units/mg  πρωτείνης)  ◦  Βαθμός  εμπλουτισμού  (πχ.  3.5  φορές  καθαρότερη)  

�  Σχεδιάζοντας  μια  διαδικασία  καθαρισμού  πρέπει  να  λάβουμε  υπόψην  μας  μια  ισορροπία  πολλών  παραγόντων  

   

Σύνοψη  των  αρχικών  σταδίων  καθαρισμού  μιας  πρωτείνης  �  Επιλογή  πηγής  πρωτείνς  �  Διαλυτοποίηση  πρωτεϊνών  �  Σταθεροποίηση  πρωτεϊνών  �  Ειδικές  δοκιμασίες  εντοπισμού  της  πρωτείνης  στόχου  ◦  Ενζυμική  ενεργότητας,  ανοσολογική  ενεργότητα  ◦  Φυσικά  χαρακτηριστικά  (ΜΒ,  φάσματα  κλπ)  ◦  Βιολογική  ενεργότητα  

�  Οι  δοκιμασίες  πρέπει  να  είναι:  ◦  Ειδικές  ◦  Γρήγορες  ◦  Ευαίσθητες  ◦  Ποσοτικές  

   

Ιδιότητα   Διαδικασία  

Διαλυτότητα   1.   Salkng  in  2.   Salkng  out  

Φορτίο   1.   Ion  exchange  chromatography  2.   Electrophoresis  3.   Isoelectric  focusing  

Πολικότητα   1.   Adsorpkon  chromatography  2.   Paper  chromatography  3.   Reverse-­‐phase  chromatography  4.   Hydrophobic  interackon  

chromatography  Mοριακό  μέγεθος   1.   Dialysis  

2.   Gel  electrophoresis  3.   Gel  filtrakon  chromatography  4.   Ultracentrifugakon  

Ειδική  αλληλεπίδραση   1.   Affinity  chromatography    

Συγκεντρωτικός  πίνακας  ιδιοτήτων  πρωτεϊνών  και  διαδικασιών  καθαρισμού  

Καθαρισμός  πρωτεινών  

•  Βάσει  διαλυτότητας  •  Βάσει  φορτίου  •  Βάσει  μεγέθους  •  Βάσει  βιολογικής  συγγένειας  •  Βάσει  υδροφοβικότητας  •  Μετά  από  γενετική  τροποποίηση  •  κλπ  κλπ….  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  φορτίου.  Στήλες  (κολώνες)    

� Oι  στήλες  χρωματογραφίας  ιοντοανταλλαγής  έχουν  διάφορα  ονόματα:    ◦ DEAE,  Q  (+)  ◦  CM,  SP  (-­‐)  

� Η  φύση  του  “αδρανούς”  υποστρώματος  παίζει  καθοριστικό  ρόλο  στη  διακριτικότητα  της  χρωματογραφίας  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  με  βάση  το  φορτίο  

Ποιό  είναι  το  φορτίο  πρωτεϊνών  σε  διάφορα  pH?  

Ποιό  είναι  το  φορτίο  πρωτεϊνών  σε  διάφορα  pH?  

IEC  σε  αρνητικά  φορτισμένη  στήλη    

Διαχωρισμός  πρωτεινών  με  βάση  το  φορτίο  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  με  βάση  το  φορτίο  

Συσκευή  δημιουργίας  βαθμίδωσης  άλατος  

Pag

e 13

5

c = c2 - (c2 - c1)f

Διαχωρισμός  βάσει  των  ηλεκτρικών  ιδιοτήτων  μιας  πρωτείνης  σε  διάλυμα  Χρωματογραφία  ιονοανταλλαγής  (IEC)    

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Χρωματογραφία  μοριακής  διήθησης  Gel  filtrakon  chromatography  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

size Molecular mass (daltons) 10,000

30,000

100,000

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

ροή

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

ροή

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

ροή

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

ροή

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

ροή

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  (ΜΒ-­‐σύμπλοκα)  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Volume (ml)

OD

260n

m

Pag

e 13

8

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Rf

logM

B  

Pag

e 13

8

Υλικά  χρωματογραφίας  μοριακής  διήθησης  

Χρωματογραφία  χάρτου  

Pag

e 13

9 Διαπύδιση  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  με  βάση  το  μέγεθος  σε  τεχνητό  πεδίο  βαρύτητας  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  υδροφοβικότητας  

Υδρόφοβη  χρωματογραφία  (Hydrophobic  Interackon  Chromatography  HIC)  

Υδρόφοβη  Xρωματογραφία  (ΗΙC)    

Υδρόφοβη  Xρωματογραφία  (ΗΙC)  

Διαχωρισμός  βάσει  της  συγγενείας  μιας  πρωτείνης  πρός  άλλα  βιομόρια  Χρωματογραφία  εκ  συγγενείας  (ΑC)  

•  Η  συγγένεια  μιας  πρωτείνης  πρός  άλλα  βιομόρια  DNA,  RNA,  ειδικές  αλληλουχίες  και  των  δύο.  

•  Πρωτείνη:  αντίσωμα-­‐αντιγόνο,  •  Αλληλεπιδράσεις  πρωτεινών.  •  Σάκχαρα:  πρωτείνες  που  αλληλεπιδρούν  με  

σάκχαρα  ή  περιοχές  πρωτεινών  (ConA,  Cellulose,  Chikn  )  

•  Μεταβολίτες  ή  συνένζυμα  •  Χρωστικές  

Χρωματογραφία  εκ  συγγενείας  α:  προσρόφηση  

Χρωματογραφία  εκ  συγγενείας  β:  έκλουση  

Οργανολογία  

Οργανολογία  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Για  να  επιτευχθεί  σωστός  διαχωρισμός  πρέπει  οι  πρωτείνες  να  αποδιαταχθούν  και  να  αναχθούν.  Η  γενική  αποδιάταξη  γίνεται  παρουσία  του  απορρυπαντικού  SDS  και  θερμοκρασίας  (1000C).  Η  χρήση  του  αναγωγικού  παράγοντα  β-­‐μερκαπτοαιθανόλης  σκοπό  έχει  να  σπάσει  τις  δισουλφιδικές  γέφυρες.    Η  αποδιατακτική  ηλεκτροφόρηση  SDS  χρησιμοποιείται  στην  ανάλυση  πολυπεπτιδικών  αλυσίδων.  

Sodium  dodecyl  sulfate  (SDS)  

Φυσική πρωτείνη

Θέρµανση +

Αναγωγικός παράγοντας

+ SDS

Αποδιατεταγµένη πρωτείνη πλήρως καλυµµένη µε SDS

N

C -

-

-

- - -

- -

- -

- -

- - -

- -

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση-­‐  οργανολογία  

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση-­‐οργανολογία  

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση  σε  αποδιάταξη  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους  

Rf

logM

B

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους-­‐πρόβλημα  

Ένα  πρωτεϊνικό  δείγμα  αναλύθηκε  με  χρωματογραφία  μοριακής  διήθησης  και  έδωσε  μια  μοναδική  κορυφή  που  αντιστοιχεί  σε  μοριακό  βάρος  160  kDa.    Το  ίδιο  δείγμα  αναλύθηκε  με  ηλεκτροφόρηση  παρουσία  SDS  και  β-­‐μερκατοαιθανόλης  και  τα  αποτελέσματα  μας  έδωσα  2  ζώνες  με  μοριακό  βάρος  60  kDa  και  50  kDa.    Ζητούμενο:  Ποιά  είναι  η  πολυπεπτιδική  σύσταση  της  πρωτείνης.  

Διαχωρισμός  πρωτεινών  βάσει  μεγέθους-­‐απάντηση  

Η  πρωτείνη  έχει  συνολικό  μοριακό  βάρος  160  kDa.    Η  ανάλυση  με  αποδιατακτική  ηλεκτροφόρηση  μας  έδωσε  2  ζώνες  50  και  60  kDa.    • 2x60+50=170  (-­‐)  

• 2x50+60=160  σωστό  

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση  δύο  διαστάσεων:  πρώτη  διάσταση=ισοηλεκτρική  εστίαση  

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση  δύο  διαστάσεων:  δεύτερη  διάσταση=μοριακό  βάρος  

Ανάλυση  πρωτεινών  με  ηλεκτροφόρηση  δύο  διαστάσεων:  2D-­‐IEF-­‐SDS/PAGE  

Figure  6-­‐27    Two-­‐dimensional  (2D)  gel  electrophoresis.  

Pag

e 15

0

Ισοηλεκτρικά  σημεία  διαφόρων  γνωστών  πρωτεϊνών  

Σύνοψη  σταδίων  καθαρισμού  πρωτεινών  

Δομική  ανάλυση  πρωτεινών  

Η  αρχιτεκτονική  των  πρωτεϊνών  μπορεί  να  αναλυθεί  με  την  βοήθεια  πολλών  

βιοφυσικών  τεχνικών    

�  Ανάλυση  κρυστάλλων  με  ακτίνες-­‐Χ.  �  Ανάλυση  με  NMR  �  Ανάλυση  με  CD  �  Ανάλυση  με  FTIR  � Microcalorimetry  �  RAMAN  spectroscopy........    

Κρυσταλλοποίηση    

Προσδιορισμός  της  3D-­‐δομής  πρωτεϊνών  

Πηγή ακτίνων-Χ Πρωτεϊνικός κρύσταλλος

Περιθλασίγραµµα

Υπολογιστικές µέθοδοι

Ηλεκτρονιακή πυκνότητα

Δοµικό µοντέλλο

Αποτύπωση  περίθλασης  ακτίνων-­‐Χ  

Xάρτης  ηλεκτρονιακής  πυκνότητας  

Xάρτης  ηλεκτρονιακής  πυκνότητας